DNA重组技术的基本工具正式

基因工程专题1每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译通用基因工程的产物什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。基因工程的概念基因工程的概念：基因工程，又叫DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传特性。基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。

想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：在以上过程中关键步骤或难点是什么？普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因通过运载体导入转基因棉花含抗虫基因转基因棉花产生伴胞晶体转基因棉花有抗虫特性基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论达尔文提出生物进化论基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路早期基础理论孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路早期基基础理理论摩尔根根证明基因在在染色色体上上，并提提出基基因的的连锁互互换定定律。基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基础理理论艾弗里里证明DNA是遗遗传物物质，DNA可可从一一种生生物个个体转移到另一一种生生物个个体。。基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基础理理论沃森、克里克克提出DNA的双螺旋旋结构构模型。。基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基础理理论梅塞尔尔松、斯塔尔尔证明DNA的半保留留复制制基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基础理理论克里克克等提出出中心法法则DNARNA蛋白质转录翻译逆转录复制基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路后期基基础理理论1963年年尼伦伯伯格和马太破译编编码氨氨基酸酸的遗传密密码，1966年霍拉纳纳用实验验加以以证明明。基础理理论和和技术术发展展催生生了基基因工工程科技探探索之之路1)基基因转转移载载体的的发现现2)工工具酶酶的发发现3)DNA合成成和测测序技技术的的发明明4)DNA体体外重重组的的实现现5)重重组DNA表达达实验验的成成功6)第第一一例例转转基基因因动动物物问问世世7)PCR技技术术的的发发明明解决决培培育育抗抗虫虫棉棉的的关关键键步步骤骤需需要要哪哪些些工工具具？？“分分子子手手术术刀刀””————限制制性性核核酸酸内内切切酶酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分分子子缝缝合合针针””————DNA连连接接酶酶“分分子子运运输输车车””————基基因因进进入入受受体体细细胞胞的的载体体1.1、、DNA重重组组技技术术的的基基本本工工具具一、、限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶————““分分子子手手术术刀刀””1.主要要来来源源：：⒉种类类与与命命名名：：⒊作用用特特点点：：4.限制制酶酶识识别别序序列列5.作用用结结果果：：识别别双双链链DNA分分子子的的某某种种特定定核苷苷酸酸序序列列，，并并且且使使每每条条链链中中特定定部部位位的两两个个核核苷苷酸酸之之间间的的磷酸酸二二酯酯键键断开开。。主要要从从原原核核生生物物中中分分离离纯纯化化产生生黏黏性性末末端端或或平平末末端端Goon大多多数数限限制制酶酶的的识识别别序序列列由由6个个核核苷苷酸酸组组成成少数数的的识识别别序序列列由由4、、5或或8个个核核苷苷酸酸组组成成寻根根问问底底你能推测限制制酶存在于原原核生物中的的作用是是什什么吗？原核生物易受受自然界外源源DNA的入入侵，但生物在长长期的进化过过程中形成了了一套完善的的防御机制，，以防止外来来病原物的侵侵害。限制酶就是细菌的一一种防御性工具，当外源DNA侵入时，，会利用限制制酶将外源DNA切割掉，以保证自自身的安全。。所以，限制制酶在原核生生物中主要起起到切割外源源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。Goback⒉种类与命名名：现在已经从约约300种微微生物中分离离出了约4000种限制制性内切酶(限制酶)。。EcoRⅠSmaⅠ粘质沙雷氏杆杆菌（Serratiamarcesens）大肠杆菌（EscherichiacoliR）Goback练习：流感嗜嗜血杆菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分离离到3种限制制酶，则分别别命名为:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ磷酸二酯键T12345A12345HHHHHOT12345A12345HHHHOH2O+O限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶酶与DNA解解旋酶的区别别切割特定的核核苷酸序列的的磷酸二酯键键将DNA两条条链的氢键打打开形成两条条单链限制酶DNA水解酶区别限制性内切酶酶与DNA水水解酶的区别别切割特定的核核苷酸序列的的磷酸二酯键键，形成片段段的DNA.切割磷酸二酯酯键，形成单单个的脱氧核核苷酸。Goback限制酶的识别别序列：能被限制性内内切酶特异性性识别的切割割部位都具有有回文序列：在切割部位，，一条链正向读的碱基顺序序与另一条链链反向读的顺序完全全一致。GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端重复演示Goback什么叫黏性末末端？被限制酶切开开的DNA两两条单链的切切口，带有几几个伸出的核苷酸酸，它们之间正正好互补配对，这样的切口口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平平末端要想获得某个个特定性状的的基因必须要要用限制酶切切几个切口？？可产生几个个黏性(平)末端？要切两个切口口，产生四个个黏性(平)末端。如果把两种来来源不同的DNA用同一一种限制酶来来切割，会怎怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者者的黏性(平平)末端黏合起来，就似乎乎可以合成重重组的DNA分子了。思考?……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混混合将不同种来源源的DNA片片段连接起来来生物A基因片片段生物B基因片片段……GAATTC……………CTTAAG………酶切……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……同一种DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点寻根问底DNA连接酶酶与DNA聚聚合酶是一回回事吗?为什什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的的核酸片段上上，形成磷酸酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片片段之间形成磷酸二酯酯键2)以一条DNA链链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯酯键连接成一条互互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时时连接起来，不需要模板可把黏性末端端之间的缝隙“缝合””起来，E·coliDNA连连接酶或或T4DNA连接酶酶即恢复被限制酶酶切开的两个个核苷酸之间间的磷酸二酯酯键T4DNA连接酶酶还可把平末端之间的的缝隙“缝合合”起来，但效率率较低T4DNA连接酶酶二、“分子缝缝合针”———DNA连接酶①作用:把切下来的DNA片段拼拼接成新的DNA，即将将脱氧核糖和磷磷酸连接起来.②作用原理：：催化磷酸二酯酯键形成③类型：类型E·coliDNA连接酶酶T4DNA连接酶酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别三、“分子运运输车”———基因进入入受体细胞的的载体⒈载体需要的的条件：⑴有1~多个个限限制制酶酶切切点点⑵对对受受体体细细胞胞无无害害⑶导导入入基基因因能在在受受体体细细胞胞中中复复制制、、表表达达⑷有某某些些标标记记基基因因，，便便于于筛筛选选⒉常常用用运运载载体体：：⑴细细菌菌的的质质粒粒⑵λ噬噬菌菌体体衍衍生生物物或某某些些动动植植物物病病毒毒⑶假假如如目目的的基基因因导导入入受受体体细细胞胞后后不不能能复复制制或或不不能能转转录录，，转转基基因因生生物物能能有有预预想想的的效效果果吗吗？？⑴作作为为分分子子运运输输车车————载载体体，，如如果果没没有有切切割割位位点点将将会会怎怎样样？？⑵霍霍乱乱菌菌的的质质粒粒多多个个限限制制酶酶切切点点，，你你会会用用它它来来做做分分子子运运输输车车吗吗？？⑷目目的的基基因因有有没没有有进进入入受受体体细细胞胞，，如如何何去去发发现现？？常用用的的载载体体：：质质粒粒能复复制制并并带带着着插插入入的的目目的的基基因因一一起起复复制制有切切割割位位点点有标标记记基基因因的的存存在在，，可可用用含含氨氨苄苄青青霉霉素素的的培培养养基基鉴鉴别别思考考与与探探究究P7（（2））为什什么么限限制制酶酶不不剪剪切切细细菌菌本本身身的的DNA？？通过过长长期期的的进进化化，，细细菌菌中中含含有有某某种种限限制制酶酶的的细细胞胞，，其其DNA分分子子中中或或者者不具具备备这种种限限制制酶酶的的识别别切切割割序序列列；或或者者通通过过甲甲基基化化酶酶将甲甲基基转转移移到所所识别别序序列列的碱碱基基上上，，使使限制制酶酶不不能能将将其其切切开开。这这样样，，尽尽管管细细菌菌中中含含有有某某种种限限制制酶酶也也不不会会使使自自身身的的DNA被被切切断断，，并并且且可可以以防防止止外外源源DNA的的入入侵侵。。3、、天天然然的的DNA分分子子可可以以直直接接用用做做基基因因工工程程载载体体吗吗？？为为什什么么？？提示示：：基因因工工程程中中作作为为载载体体使使用用的的DNA分分子子很很多多都都是是质质粒粒（（plasmid）），，即即独独立立于于细细菌菌拟拟核核染染色色体体DNA之之外外的的一一种种可可以以自自我我复复制制、、双双链链闭闭环环的的裸裸露露的的DNA分分子子。。是否否任任何何质质粒粒都都可可以以作作为为基基因因工工程程载载体体使使用用呢呢？？不是，作作为基因因工程使使用的载载体必需需满足以以下条件件：思考与探探究P71）载载体DNA必需需有一个或多多个限制制酶的切割位位点，以以便目的的基因可可以插入入到载体体上去。。这些供供目的基基因插入入的限制制酶的切切点所处处的位置置，还必必须是在质粒本本身需要要的基因因片段之之外，这样才才不至于于因目的的基因的的插入而而失活。。2）载载体DNA必需需具备自我复制制的能力力，或整合合到受体体染色体体DNA上随染染色体DNA的的复制而同同步复制制。3）载载体DNA必需需带有标记记基因，以便重重组后进进行重组组子的筛筛选。4）载载体DNA必需需是安全的的，不会对对受体细细胞有害害，或不不能进入入到除受受体细胞胞外的其其他生物物细胞中中去。5）载载体DNA分子子大小应适适合，以便提提取和在在体外进进行操作作，太大大就不便便操作。。实际上自