DNA重组技术的基本工具-

设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出”蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。1973年，美国科学家科恩将两种不同来源的DNA分子进行体外重组，并首次实现了在大肠杆菌中的表达，创立了定向改造生物的新技术——基因工程。专题1

基因工程1.1DNA重组技术的基本工具科技探索之路基础理论和技术的发展催生了基因工程从科技探索之路中可以看出：说明没有

的研究成果，没有

的创新发明，基因工程不可能诞生，也不可能迅速崛起。阅读选修3《现代生物科技专题》的目录，找出现代生物科技包括哪些工程？基因工程、蛋白质工程、细胞工程、胚胎工程、生态工程基础理论技术什么叫基因工程？基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。一、基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程实质结果DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平新生物类型型和生物产产品剪切→拼接→导入→表达基因重组（定向）①它是一种种按照人们们愿望，定定向改造生生物遗传特特性的技术术。②②在DNA分子水平上上进行操作作。③③是在在体外进行行的人为的的基因重组组。④④一一旦成功，，便可遗传传。⑤⑤主要技术术是体外DNA重组技术和转基因技术术。基因工程的的特点：转基因抗虫虫棉抗虫棉普通棉基因工程培培育抗虫棉棉的简要过过程：上述培育抗抗虫棉的关关键步骤是是什么？导入普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)重组DNA形成关键步骤一一：关键步骤二二：关键步骤三三：抗虫基因从从苏云金芽芽孢杆菌细细胞内提取取出来形成重组DNA重组DNA导入受体(棉花)细胞解决培育抗抗虫棉的关关键步骤需需要哪些工工具？关键步骤一一的工具：：关键步骤二二的工具：：关键步骤三三的工具：：“分子手术术刀”——限制性核酸酸内切酶“分子缝合合针”——DNA连接酶“分子运输输车”——运载体（一）“分分子手术刀刀”——限制性核酸酸内切酶二、基因操操作的工具具切割DNA的工具是限制性核酸酸内切酶，又称限制酶。这类酶主要要从原核生生物中分离离纯化出来来的，迄今今为止已从从近300种不同的微微生物中分分离出了约约4000种限制酶。。（简称限制制酶）限制性核酸酸内切酶能能够识别双链DNA分子的某种特定定核苷酸序序列,并且使每一一条链中特特定部位的的两个核苷酸酸之间的磷酸二酯键键断开。

T磷酸二酯键键1234512345AAATTGCCTTAAG识别别双双链链DNA分子子的的某某种种特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，并并且且使使每每一一条条链链中中特特定定部部位位的的两两个个核核苷苷酸酸之之间间的的磷酸酸二二酯酯键键断开开。。主要要是是从从原核核生生物物中分分离离纯纯化化出出来来的的。。4000种。。1、来来源源：：2、种种类类：：3、作作用用：：4、结结果果：：形成成两两种种末末端端（一一））限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶———“分分子子手手术术刀刀””黏性性末末端端平末末端端能将将外外来来的的DNA切断断，由由于于这这种种切切割割作作用用是是在在DNA分子子内内部部进进行行的的，，故故名名限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。。大肠肠杆杆菌菌的的一一种种限限制制酶酶（（EcoRⅠⅠ）能能识识别别GAATTC序列列，，并并在在G和A之间间切切开开。。限制制酶酶限制制酶酶什么么叫叫黏黏性性末末端端？？当限限制制酶酶在在它它识识别别的的中中心心轴轴线线两两侧侧将将DNA两条条链链切切开开时时，，切切开开的的DNA两条条单单链链的的切切口口，带有有几几个个伸伸出出的的核核苷苷酸酸，它们们之之间间正正好好互互补补配配对对，这这样样的的切切口口叫叫黏性性末末端端。什么么叫叫平平末末端端？？当限限制制酶酶在它它识识别别序序列列的的中中心心轴轴线线处处切切开开时时，，切开开的的DNA两条条单单链链的的切切口口，，是是平整整的，，这这样样的的切切口口叫叫平末末端端。DNA分子子经经限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶切切割割产产生生的的DNA片段段末末端端通通常常有有哪哪两两种种形形式式？？有黏性性末末端端和平末末端端两种种。。那么么，，在在中中心心轴轴线线两两侧侧的的双双链链DNA上的的碱碱基基有有什什么么特特点点呢呢？？不管管是是产产生生黏黏性性末末端端还还是是平平末末端端，，在在中中心心轴轴线线两两侧侧的的双双链链DNA上的的碱基基是是旋旋转转对对称称的的。。要想想获获得得某某个个目目的的基基因因必必须须要要用用限限制制酶酶切切几几个个切切口口？？可可产产生生几几个个黏黏性性末末端端？？一一个个目目的的基基因因有有几几个个黏黏性性末末端端？？要切切两两个个切切口口，，产产生生四四个个黏黏性性末末端端，，两两个个。。如果果把把两两种种来来源源不不同同的的DNA用同同一一种种限限制制酶酶来来切切割割，，会会怎怎样样呢呢？？会产产生生相相同同的的黏黏性性末末端端。。是不不是是把把两两者者的的黏黏性性末末端端黏黏合合起起来来，，这这样样就就形形成成了了重重组组的的DNA分子子了了?实际际还还不不够够,还需需要要DNA连接接酶酶进进行行连连接接。。一种种限限制制酶酶只只能能识识别别和和切切断断特特定定的的核核苷苷酸酸序序列列，，这这是是由由限限制制酶酶的的性性质质（（专一性或或特异性性）决定的的。中轴线思考：①①限制酶酶所识别别的序列列有什么么特点？？限制酶所所识别的的序列，，都可以以找到一一条中心心轴线，，中心轴轴线两侧侧的双链链DNA上的碱基是旋旋转对称称的。②限制酶酶在DNA的任何部部位都能能将DNA切开吗？？问题探讨讨：①限制酶酶从哪里里寻找？？提示：联联想以前前学过的的内容───噬菌菌体侵染染细菌的的实验，，进而认认识细菌菌等单细细胞生物物容易受受到自然然界外源源DNA的入侵。。那么这这类原核核生物之之所以长长期进化化而不绝绝灭，有有何保护护机制？？原核生物物在长期期的进化化过程中中形成了了一套完完善的防防御机制制，以防防止外来来病原物物的侵害害。限制制酶就是是细菌的的一种防防御性工工具，当当外源DNA侵入时，，会利用用限制酶酶将外源源DNA切割掉，，以保证证自身的的安全。。所以，，限制酶酶在原核核生物中中主要起起到切割割外源DNA、使之失失效，从从而达到到保护自自身的目目的。②迄今为为止，基基因工程程中使用用的限制制酶绝大大部分都都是从细细菌或霉霉菌中提提取出来来的，联联系你已已有的知知识，想想一想，，为什么么细菌中中限制酶酶不剪切切细菌本本身的DNA？是因为微微生物在在长期进进化过程程中，含含有某种种限制酶酶的细胞胞，其DNA分子中或或者不具具备这种种限制酶酶的识别别切割序序列，或者通过过甲基化化酶将甲甲基转移移到所识识别序列列的碱基基上，使限制制酶不能能将其切切开。这这样，尽尽管细菌菌中含有有某种限限制酶也也不会使使自身的的DNA被切断，，并且可可以防止止外源DNA的入侵．．将切下来来的DNA片段拼接接成新的的DNA分子,是靠DNA连接酶来来完成的的。1967年，世界界上几个个实验室室几乎同同时发现现了一种种能够将将两条DNA链连接起起来的酶酶，称之之DNA连接酶。。根据酶的的来源不不同，可可以将这这些酶分分为两类类：一种种是从大大肠杆菌菌中分离离得到的的，称为为E.coliDNA连接酶;另一类是是从T4噬菌体中中分离出出来的,称为T4DNA连接酶。这两类酶酶都是将将双链DNA片段“缝合”起起来，恢复被限制酶酶切开的的两个核核苷酸之之间的磷酸二酯酯键，但这两两种酶的的作用有有所差别别：E.coliDNA连接酶只只能将双双链DNA片段互补补的黏性性末端之之间连接接起来，，不能将双双链DNA片段平末末端之间间进行连连接。而而T4DNA连接酶既既可以““缝合””双链DNA片段互补补的黏性性末端，，又可以以“缝合合”双链链DNA片段的平平末端，，但连接平平末端之之间的效效率比较较低。（二）““分子子缝合针针”——DNA连接酶1、种类：：两类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶

磷酸二酯酯键DNA连接酶可可把黏性性末端之之间的缝缝隙“缝合”起来，，即把梯梯子两边边扶手的的断口连连接起来来，这样样一个重重组的DNA分子就形形成了。。2、作用部部位：基因工程程中所用用的连接接酶有两两种：一一种是E·coliDNA连接酶。。另一种种是T4DNA连接酶。。这两种种连接酶酶都是连连接双链链DNA的缺口，，不能连连接单链链DNA。DNA连接酶和和DNA聚合酶都都是形成成磷酸二二酯键，，那么，，二者的差差别主要要表现在在什么地地方呢？DNA连接酶与与DNA聚合酶是是一回事事吗？为为什么？？不是。⑴DNA聚合酶只只能将单单个核苷苷酸加到到已有的的核酸片片段的末末端上，，形成磷磷酸二酯酯键；而DNA连接酶是是在两个个DNA片段之间间形成磷磷酸二酯酯键，不不是在单单个核苷苷酸与DNA片段之间间形成磷磷酸二酯酯键。⑵DNA聚合酶是是以DNA一条链为为模板，，将单个个核苷酸酸通过磷磷酸二酯酯键形成成一条与与模板链链互补的的子链；；而DNA连接酶是是将DNA双链上的的两个缺缺口同时时连接起起来。因因此DNA连接酶不不需要模模板。二者虽然然化学本本质都是是蛋白质质，但组组成和性性质各不不相同。。外源基因因(如抗虫基基因)怎样才能能导入受受体细胞胞(如棉花细细胞)？导入过程程需要运运输工具具——载体。载体的作作用有哪哪些？作用一：：作为运运载工具具，将外外源基因因(抗虫基因因)转移到受受体细胞胞(棉花细胞胞)中去。作用二：：利用载载体在受受体细胞胞(棉花细胞胞)内，对外外源基因因(抗虫基因因)进行大量量复制。。三、基基因进入入受体细细胞的载载体——“分子运运输车””用什么方方法才能能将外源基因因（目的基因因）送入受受体细胞胞中呢？？质粒是基基因工程程最常用用的载体体。最常用的的质粒是是大肠杆杆菌质粒粒。质粒是一一种裸露露的、结结构简单单、独立于细细菌拟核核DNA之外，并具有有自我复制制能力的很小双链环状状DNA分子。质粒DNA上有一个个至多个个限制酶切切割位点点，供外源源DNA片段（基基因）插插入其中中。携带外源源DNA片段的质质粒进入入受体细细胞后，，在细胞胞中进行行自我复复制，或或整合到到染色体体DNA上，随染染色体DNA进行同步步复制。。质粒DNA上有特殊殊的标记基因因，如四环环素抗性性基因、、氨卞青青霉素抗抗性基因因等标记记基因，，供重组组DNA的鉴定和和选择。。在基因工工程使用用的载体体除质粒外，还有有λ噬菌体的的衍生物物、动植物病病毒等。它们来源源不同，，在大小、结构、复制以及插入片段段大小上也有很很大差别别。这些基因因工程载载体的作作用，就就相当于于一种运运输工具具，因此此将它们们比喻为为“分子子运输车车”。将外源基基因送入入受体细细胞。1、作用：：2、条件：：⑴能够在宿宿主细胞胞中复制并稳定地地保存。⑵载体DNA必须有一一个或多多个限制酶切切点，以便目目的基因因插入到到载体上上去。⑶具有某些些标记基因因，便于进进行筛选。⑷载体DNA必须是安全的,不会对受体体细胞有害害。⑸载体DNA分子大小应适合合,以便提取和和在体外进进行操作。。3、常用种类类：质粒、λ噬菌体衍生生物和一些些动植物病病毒。（三）基因因进入受体体细胞的载载体——“分子运输输车”1.重组DNA不能复制，，就可能丢丢失。2.没有一个至至多个限制酶的切切割位点，就不能进进行DNA的重组。3.载体上没有有没有标记记基因，我我们用肉眼眼又看不到到载体是否否真正进入入，鉴定困困难。4.载体必须对对细胞无害害。不能有有害于受体体细胞，影影响其生命命活动的正正常进行。。原因：大肠杆菌的的质粒：最常用的质质粒是大肠肠杆菌的质质粒，其中中含有标记记基因，如如四环素抗抗性基因、、氨卞青霉霉素的抗性性基因。质质粒的存在在与否对宿宿主细胞生生存没有影影响，能在在宿主细胞胞内进行复复制。质粒