直接反映基因特征,非推测oweroinre

DNA遗传标记

特点：1.直接反映基因特征，非推测。2.基因座位数量多，无论表达与否。3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力强。4.适合于陈旧的样品，检测能力强。5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。6.易于检测手段的自动化、标准化，重复性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方法。

第一部DNA基础

一、DNA结构与特征

1.DNA分子结构

线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸组成----碱基、脱氧核糖、磷酸差别----碱基：嘌呤碱—腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G）

嘧啶碱—胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸

2.DNA理化性质1）

DNA的变性变性（denaturation）:在一定条件下，DNA双链间氢键断裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。条件：A：温度上升----Tm值(meltingtemperature)50%DNA分子解链的温度。与GC/TA比值有关。1%GC-0.4℃。B：碱性升高---0.5NNaOH-完全解链。2）DNA的复性复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链DNA根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。条件：A：温度降低—过低易错配。过高不易复性。

B：高离子强度。3）DNA分子杂交杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据碱基互补的原则，形成双链杂种DNA的过程。二、基因

1.基因与基因组

基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所需的全部核苷酸序列基因组（genome）：一个生物体的所有基因。核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因

2.

基因结构

结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。外显子（exon）：编码序列。内含子(intron)：非编码序列（间隔列）。如β珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨基酸，3个外显子，2个内含子。3.基因突变

突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。1）点突变（pointmutation）：单碱基置换。同义突变（samesensemutation）:简并密码，无突变效应。错义突变(missensemutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。无义突变(non-sensemutation)：变成终止密码，合成不完整多肽产生突变效应。终止密码突变（terminatorcodonmutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。移码突变（frame-shiftmutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或重排，产生突变效应。单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点)三、DNA多态性的分类

1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差别。由一特定序列，首尾相连串联重复次数不同产生的个体差别。可变数目串联重复（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）

短串联重复(shorttandemrepeat,STR)A：产生原因：DNA滑动与同源染色体不等交换。

B：差别：VNTRSTR

重复序列组成2-7bp7-数十bp

重复序列数目2-10数个10数个-数百个鉴别能力高极高优势扩增现象不明显极明显检测灵敏度极高稍差片段总长度200-500bp数千以上bpC：STR的命名：非编码区-D3S1358

D3第三号染色体S单拷贝（singlecopy）1358

VNTR序列的发现序号

编码区内含子-HumHPRTB

次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hypoxanthinephosphoribosyltransferase）1））序列列多多态态性性：DNA片段段碱碱基基排排列列顺顺序序的的个个体体差差别别。。单核核苷苷酸酸多多态态性性（singleucleotidepolymorphism,SNPs））原因因：：碱碱基基的的置置换换、、插插入入、、缺缺失失。。特点点：：多多位位于于非非编编码码区区，，选选择择压压力力。。数量量多多，，1/1000bp，，300万二态态性性，，2个个等等位位基基因因，，多多态态性性程度度较较低低。。孤立立事事件件，，人人类类遗遗传传学学意意义义大大。。第二二部部分分DNA的制制备备核心心与与关关键键脑>肺>肌肉肉>肾6pg/细胞胞一、、理想想DNA样品品的的要要求求1.纯度度-RNA、、蛋白白质质、、多多糖糖、、脂脂类类。。2.完整整性性-DNA大分分子子。。3.DNA量。。Μg/指纹纹图图；；ng/PCR；；pg/PCR二、、经典典DNA提取取法法1.在弱弱碱碱和和螯螯合合剂剂的的条条件件下下行行组组织织匀匀浆浆，，溶解解胞胞、、核核膜膜。。2.去垢垢剂剂与与蛋蛋白白酶酶消消化化蛋蛋白白，，分分离离DNA。。3.有机机溶溶剂剂去去除除蛋蛋白白，，萃萃取取DNA。。4.乙醇醇与与盐盐类类沉沉淀淀DNA。。三、、试剂剂的的使使用用原原理理1.弱碱碱和和螯螯合合剂剂：：Tris-HClpH8.0，，DNA分子稳稳定。。EDTA（（乙二胺胺四乙乙酸））-抑抑制核核酸酶酶。通通过螯螯合镁离离子。。2.去垢剂剂与蛋蛋白酶酶：SDS（十二烷烷基磺磺酸钠钠）：：增加加膜通透性性；促促进DNA与蛋白白质分分解；；促使使核酸酸酶与蛋白白质变变性。。蛋白酶酶K：酶解解组蛋蛋白。。3.有机溶溶剂：：酚-变性性沉淀淀蛋白白质，，组蛋蛋白、、蛋白白酶等等。PH6.0，需Tris-HClpH8.0平衡。。氯仿-变性性沉淀淀蛋白白质，，除酚酚，水水相分分离。。异戊醇醇-除除酚，，除泡泡沫。。4.乙醇与与盐类类：DNA不溶于于乙醇醇与盐盐类。。四、基本步步骤1.样品处处理-分离离细胞胞，低低渗盐盐水或或细胞胞悬浮浮液。。10mmol/LTris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰RNA酶,0.5%SDS.2.消化-TNE（（15mmol/LTris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA,5mmol/LNaCl））4ml，，10%SDS0.45ml，，10mg/ml蛋白酶K（终浓度度100μg/ml）混匀，，50℃3h，45℃℃过夜。。3.DNA提取-等体体积饱饱和酚酚-等等体积积饱和和酚/氯仿仿/异异戊醇醇（25/24/1）-氯仿仿/异异戊醇醇（24/1））。500r/min,10min.4.沉淀DNA-1/10体积3mol/LNaAc，，2倍无水水乙醇醇-70%乙醇醇。室室温挥挥干。。5.溶解DNA-适量TE（（10mmol/LTris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间间。五、其其他方方法1.Chelex-100提取DNA基本成成分：：含有有亚氨氨基二二乙酸酸盐离离子的的苯乙乙烯-二乙乙基苯共聚聚物。。基本方方法：：沉淀淀细胞胞；5%试试剂200μl；；56℃0.5h以上；100℃8min；剧烈震震荡；；离心心上清清。注意：：离离心心彻底底。2.硅硅珠法法提取取DNA基本成成分：：GuSCN（硫氰酸酸胍，，蛋白白变性性剂））与二二氧化化硅（硅硅珠，，核酸酸吸附附剂））。基本方方法：：血液液（1-4μl））TES（（100μμl））SDS（20μl）煮沸5min；300μlGuSCN溶液与20μl硅珠液液保温温15min；离心；；离心心加GuSCN溶液；；离心心加乙乙醇漂漂洗；；TES56℃10min离心取取上清清。3.直直接煮煮沸法法，100℃10min六.注注意事事项1.如消化化不完完全，，可用用TNE溶解后后再重重提。。2.消化时时间宜宜长不不宜短短。3.操作轻轻柔。。4.混匀要要充分分。5.挥干不不宜过过度。。七.不不同生生物性性检材材的DNA制备1.混混合斑斑二步步提取取法（（精液液与阴阴道液液）原理：精精子子细胞胞膜富富含硫硫醇蛋蛋白，，包裹裹DNA的鱼精精蛋白白富含含半光光氨酸酸，二二硫键键丰富富，可可抵抗蛋蛋白酶酶作用用。二二硫苏苏糖醇醇（DTT）可还原二硫硫键，，使蛋蛋白酶酶发生生作用用。方法:(1)分离细细胞成成分。。(2)常规消消化。。(3)加10%SDS40μl，1mol/LDTT16μμl，，10μμg/μl蛋白酶酶K4μμl，，37℃过夜。。(4)常规处处理。。八.DNA定量1.凝凝胶电电泳半半定量量分析析法标准参参照分分析。。2.分分光光光度计计分析析原理：：核酸酸于260nm波长为为吸收收峰，，1OD值为50μg/μl双链核核酸（（40μg/μl单链核核酸），，根据据OD值可计计算DNA含量。。蛋白白于280nm波长为为吸收收峰，，260/280比比检测测核酸纯纯度。九.DNA纯化第三部部分聚合酶酶链式式反应应技术术聚合酶酶链式式反应应（polymerasechainreaction，PCR）在模板板DNA和4种种脱氧氧核苷苷酸存存在的的条件件下，，由一一对特特异性性引物物限定定的靶靶DNA片段，，经DNA聚合酶酶催化化的体体外合合成过过程。。一、PCR的基本本过程程1.变变性（（denaturation））:在加热热的条条件下下（94℃℃左右右），，模板板DNA配对碱碱基间间氢键键断裂裂，DNA双链变变成单单链。。2.退退火（（annealing）：：在降温温的条条件下下（55℃℃-62℃℃），，引物物与其其互补补的模模板DNA结合形形成杂杂交双双链。。3.延延伸（（extension）：：在合适适的温温度下下（68℃℃-72℃℃），，经DNA聚合酶酶催化化4种种脱氧氧核苷苷酸，，由引引物的的3ˊˊ端为为起始始点，，从5ˊ向向3ˊˊ端延延伸，，合成成新的的与模模板DNA互补的的DNA链。每反应应一个个循环环，靶靶DNA片段数数量增增加一一倍，，并以以指数数的量量堆积积，经经30余次次循环环，产产物量量可达达到2×105-7个拷贝贝。几几个循循环后后扩增增产物物作为为模板板。二、PCR反应的的体系系标准体体系为为50-100μl，，常用20μl。。DNA模板/DNA聚合酶酶/一一对引引物/4种种脱氧氧核苷苷酸/缓冲冲液。。反应条条件：：95℃4-5min,94℃℃30s,55℃-62℃30s,72℃℃30-60s,30循环后后72℃5-10min。三、试试剂的的要求求：1.引引物：：人工工合成成的单单链DNA。A：长度15-30bp。。Ln=2×(G+C)+(A+T)<38,延伸温温度大大。B：内部的的互补补序列列。C：引物间间的互互补序序列。。D：序列的的随机机。E：识别序序列的的单拷拷贝。。引物物决定定特异异性。。F：浓度：：02-1μmol/L。。G：应纯化化低温温保存存。2.DNA模板A：量10ng左右。。B：纯，无无污染染。3.DNA聚合酶酶A：根据具具体实实验要要求选选择。。B：注意外外切酶酶活性性，5-3或3-5。C：活性最最适温温度70-75℃，，半衰衰期一一般95℃℃40min92℃℃130minD：镁离子子依赖赖。第六章章DNA多态性性分型型方法法一、长长度多多态性性分型型扩增片片段长长度多多态性性分析析（amplifiedfragmentlengthpolymorphisms,Amp-RLP）。。主要指指VNTR和STR1.步步骤（1））PCR扩增，，遗传传标记记特异异性由由特异异性引引物决决定。。（2））电泳泳分离离PCR产物A：凝胶：：聚丙丙烯酰酰氨凝凝（polyacrylamidegel,PAG），，成分：：丙烯烯酰氨氨与甲甲叉丙丙烯酰酰氨凝胶浓浓度（（T）：：6-8%，与分析析的片片段大大小有有关。。交联度度（C）：：3%，甲叉/丙烯烯酰氨氨与甲甲叉B:载样缓缓冲液液：甘甘油（（蔗糖糖）密密度重重力，，防扩扩散。。泳速指指示剂剂：溴溴酚蓝蓝（5%，，65bp））二甲苯苯青（（5%，260bp））C：电压：：100-200V（3））谱带显显示：：A：溴乙啶啶染色色：ethidiumbromide,EB,嵌合与与DNA双链间间，紫紫外线线激发发红色色荧光光。注意：：强致致变剂剂。可可加凝凝胶中中或后后染色色。B：银染色色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结结合，，甲醛还还原Ag+颗粒，，显黑黑褐色色。比比溴乙乙啶敏敏感度度高。。C：荧光显显色:(P78)染料标标记在在引物物5ˊˊ端，，激光光激发发。（4））基因因型判判定：：根据等等位基基因分分型标标准物物（alleleladder））或片段段长度度标准准物(molecularmarker)同步电泳比比对判判型。。等位基基因命命名根根据重重复序序列的的重复复次数数。注意事事项：：出现现3条条谱带带或3个峰峰时，，污染染、混混合样样品、、变异异。2.STR基因座座的选选择：：A：重复序序列为为4个个碱基基。B：等位基基因数数量在在10个左左右。。C：基因座座距离离足够够远。。D：引物识识别序序列尽尽可能能单拷拷贝。。E：PCR产物在在100bp-300bp之间。。3.多多基因因座复复合扩扩增检检测二、序序列多多态性性分型型（一））限制制性片片段长长度多多态性性分析析法restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs因DNA核苷酸酸序列列的变变异，，使DNA限制性性内切切酶识识别部部位产产生、、消失失或移移位，，致使使酶切切片段段长度度和/或数数量发发生变变化而而呈现现的DNA多态性性。1.限限制制性片片段长长度多多态性性的DNA基础（1））识别部部位的的点突突变：：碱基基的替替换、、修饰（甲甲基化化）或或插入入与缺缺失。。（2））识别部部位间间的片片段插插入与与缺失失。（3））识别部部位间间的重重复序序列数数目的的变化化。2.DNA限制性性内切切酶restrictionendonuclease能够识识别特特定的的DNA序列，，与DNA分子结结合后后在特特定部部位将将DNA双链切切断的的核酸酸水解解酶。。（1））生物物学功功能：：水解解核酸酸的磷磷酸二二酯键键。（2））命名名：根根据微微生物物的种种（第第一个个字母母大写）、、属（（前二二个字字母小小写））、变变种第第一个个字母大大写））、发发现分分离的的顺序序（罗罗马数数字））。（3））分类类：A：ⅠⅠ型：远远离识识别部部位随随即切切割，，非特特异。。B：ⅡⅡ型：在在识别别部位位内部部切割割，特特异。。C：ⅢⅢ型：在在识别别部位位后定定点切切割，，特异异。单位：：1U：在标准准条件件下，，1h完全水水解1μgλλ噬菌体体的酶酶量。。Ⅱ型DNA限制性性内切切酶：：A：识别核核酸序序列数数目4-6个。。B：识别序序列为为回纹纹序列列。C：切割后后产生生的末末端分分为粘粘行末末端与与平末端。。例：PstⅠ5ˊ-C↓↓TGCAG-3ˊˊ3ˊ-GACGT↑↑C-5ˊˊHaeⅢ5ˊ-GG↓CC-3ˊˊ3ˊ-CC↑GG-5ˊˊ3.分分型法法：酶+缓缓冲液液+样样品----一一定的的温度度----电泳泳检测测。4.注注意事事项：：A：星号活活力。。B：消化时时间宜宜长不不宜段段。C：阳性可可肯定定序列列，阴阴性序序列不不定。。（二））等位位基因因特异异性寡寡核苷苷酸探探针杂杂交分分析法法allelespecificoligonucleotide,ASO根据硷硷基互互补的的原则则,制制备识识别特特定寡寡核苷苷酸序序列的的单链链DNA探针,并标标记示示踪物物,在在高强强度条条件下下与变变性DNA样品杂杂交,检测测示踪踪物,阳性性者为为检出出相应应的等等位基基因。。1.相关概概念：：A：杂交：：两条条异源源寡核核苷酸酸单链链按照照硷基基互补补的原原则复复性为为双链链的过过程。。B：探针：：标记记有示示踪物物，能能够识识别靶靶核苷苷酸序序列并并与之之退火火杂交交的具具有以以知序序列的的寡核核苷酸酸单链链。2.探探针针的条条件:A:长度为为20bp左右。B：具备高度度特异性性。C：容易标记记示踪物物。D：在杂交过过程中本本身性质质稳定。。3.对示示踪物的的要求A:高灵敏度度。B:不影响探探针的特特异性。。C:不影响探探针的杂杂交特性性。D：不改变本本身的特特性。E：检测方法法特异。。F：安全可靠靠无公害害。G：检测方法法简单，，重复性性好。4.示示踪物的的种类A：放射性同同位素--灵敏敏度高，，有放射射性污染染。B：非放射性性同位素素：半抗抗原生物素荧光物质质酶—常见辣根根过氧花花物酶碱性磷酸酸酶5.检测测方法—斑点印迹迹杂交dotblothybridization反向斑点点杂交reversedotblot6.基本本操作过过程A：固相滤膜膜印迹-打点、、Southern转移、真空转移移、电转转移。常常用尼龙龙膜。B：DNA变性—碱变性、、紫外线线照射、、真空烘烤。。C：预杂交交—封闭D：杂交：：高强度杂杂交-温温度高，，离子强强度低。。特异不利利于复性性。低强度杂杂交-温温度低，，离子强强度高。。利于复性性不特异异。E：漂洗F：示踪物显显示。三、等位位基因特特异性PCR（（序列特异异性引物物PCR））allelespecificPCR，ASPCR（sequencespecificprimers,SSP-PCR）基本原理理：根据据待测等等位基因因的碱基基差异设设计3条条特异性性引物，，其中2条引物物为上游游（或下下游）引引物，其其3端第第1个碱碱基（或或第2、、3个碱碱基）分分别与等等位基因因特异性性碱基互互补，作作为等位位基因特特异性引引物；1条下游游（或上上游）引引物作为为共通引引物。分分为两个个体系同同时PCR扩增，对对比电泳泳，依据据PCR产物的有有无判定定等位基基因的型型别，有有PCR产物者为为阳性，，证实该该等位基基因存在在。方法：1.设设计计3条引引物，2条等位位基因特特异性引引物，其其5端长长度有差差异（5端差4-6bp），，与共通引引物引物物在1个个体系中中同时PCR扩增，电电泳后，，依据PCR产物片段段的有无无与谱带带的位置置判定等等位基因因的型别别。2.同同一片段段多等位位基因同同时检测测：依据据片段上上等位基基因数目目，设计计两组多多条等位位基因特特异性引引物，分分别与共共通引物物在1个个体系中中同时PCR扩增，对对比电泳泳后，依依据PCR产物片段段的有无无与谱带带的位置置判定等等位基因因的型别别。3.不不同染色色体上多多等位基基因同时时检测：：设计两两组多条条等位基基因特异异性引物物及相应应的共通通引物，，并在引引物的5端人工工设计10bp左右碱基基序列，，PCR产物对比比电泳后后，依据据PCR产物片段段的有无无与谱带带的位置置判定等等位基因因的型别别。技术关键键点：1.引物物特异性性碱基设设计的位位置。2.多位位点复合合扩增的的PCR反应条件件。四、随机机引物PCRrandomprimerPCR特点：1.PCR反应仅1条引物物。2.引物物碱基序序列随机机。3.引物物长度10bp左右。4.复性性温度低低。5.扩扩增片段段多,但但符合孟孟德尔遗遗传规律。。6.可多多引物复复合扩增增,增加加信息含含量。7.重复复性欠佳佳。五、PCR单链构型型多态性性分析PCR-singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP1、基本原理：PCR产物热变性后后形成单链DNA，在非变性凝胶胶中，因DNA片段碱基排列列顺序的不同同，单链DNA形成不同的（（空间构型，，导致电泳迁移率率的差别而呈呈现多态性，根据谱带带的位置判定定型别。2、特点：A：样品需要充分分变性（加样样品缓冲液，，沸水浴10min），并保持至电泳泳前。B：电泳凝胶为非非变性凝胶。。C：泳动过程中温温度保持恒定定。D：分辨率高，可可检测出单一一碱基变异，，检出率90%以上。E：重复性稍差，，多用于筛选选实验。F：不能确定突变变碱基的种类类与位置。G：样品片段应短短于500bp。H：电泳谱型可能能出现四条片片段（1处变变异）：同源源双链；异源双链链；两种碱基基排列顺序不不同的单链DNA。六、扩增片段段长度多态性性检测法amplifiedfragmentlengthpolymorphism,AMP-PCR1、基本原理：应应用一对特异异性引物，选选择VNTR或STR基因座进行PCR扩增，由于基基因座不同等等位基因串联联重复次数的的差异，导致致PCR产物DNA片段数目与长长度不同，经经电泳后，依依据谱带的数数目和位置判判定型别。2、特点：A：操作简单，重重复性好。B：泳动中根据等等位基因标准准品认定型别别。C：可检测的基因因座数量多。。D：可将多基因座座复合扩增。。[复合扩增要要求]：A：引物间无互补补序列。B：基因座不在同同一染色体上上，或距离足足够远。C：不同基因座PCR产物片段长度度分布不交叉叉。D：不同基因座PCR扩增条件相近近。E：片段长度差异异不宜过大。。（优势扩增增）F：变性胶检测测效果好。3、用于检测测的STR基因座选择条条件：A：重复序列碱基基数目3-5之间，易于于分辨。B：等位基因数目目适中，10个左右。C：各等位基因频频率分布均匀匀。D：杂合度高。E：扩增片段长度度小于300bp。F：突变率低。G：避免检测连锁锁的基因座.（影响计算结结果）七、小卫星重重复单位变异异分型ministatellitevariantrepeatmapping,MVR-PCR1、基本原理：部部分VNTR基因座的重复复序列存在碱碱基变异，据据此设计相应应的序列特异异性引物，与与共通引物分分别进行PCR扩增，分泳道道对比电泳检检测PCR产物，根据谱谱带的有无与与位置编码后后判定型别。。2、特点：A：DNA片段数目多，，类似DNA指纹图。B：分辨率高，个个人识别能力力高。C：编码分型，不不需标准对照照。D：普通检测手段段不能够反映映全基因状况况。E：反映了基因座座长度多态性性与已知序列列多态性的性性质。八、DNA序列分析（双双脱氧核苷酸酸末端终止法法）1、基本原理理：在常规PCR反应体系中加加入四种2，，3-双脱氧氧单核苷酸，由由1条引物进进行PCR反应，在正常常的模DNA复制同时，当当有2，3-双脱氧单核核苷酸结合到到产物3端后，下一个单单核苷酸不能能够与之形成成磷酸二酯键键，使DNA片段延伸终止止于该2，3-双脱氧单单核苷酸处，，根据不同长度含有有2，3-双双脱氧单核苷苷酸片段的检检测结果判定PCR产物的单核苷苷酸序列。2、特点：A：完全忠实地反反映靶片段核核苷酸排列顺顺序。B：测序反应为1条引物（浓浓度低于常规规PCR反应）。C：根据方法学，，一次反应可可测200-500bp。D：产物分析分别别有手工与机机器自动化方方法。第五部分DNA遗传标记的特特殊意义一、线粒体DNA遗传标记的法法医学意义1.线粒体体DNA（mitochondrialDNA,mtDNA）基本结构特点点环形双链；无无组蛋白而裸裸露；全长16569bp；除基因区域外外有5%-7%的D-环区（displacementloop），多态性高；单单倍体无重组组。2.线粒体体DNA的特征与法医医学意义A：稳定的母系遗遗传：母系血血缘亲属具有有完全相同的的mtDNA。。适合特殊类型的亲权鉴鉴定（母-子子；同胞兄妹妹；母系血缘缘）。B：拷贝数多：有有利于微量检检材；检测敏敏感度高。C：片段短：抗降降解，有利于于降解检材，，如角化组织织（毛发等））。D：突变率高：多多态性高，个个人识别能力力强。E：属于序列多态态性，检测方方法RFLP；ASPCR；；PCR-ASO；测序等。F：单倍体型具有有民族特征。。G：单倍体型具有有种属特征。。3.线粒体体DNA法医学应用的的问题点A：遗传的特殊性性带来的个人人识别局限性性。B：异质性；同一一个体不同器器官或同一器器官出现序列列不同的mtDNA。。二、Y染色体DNA遗传标记的法法医学意义1.Y染色体DNA特征与法医学学意义A：父系伴性遗传传：父系血缘缘男性具有完完全相同的Y染色体DNA遗传标记。适适合特殊类型型的亲权鉴定定（父-子；同胞兄弟弟；父系血缘缘）。B：男性仅有：适适合于含有男男性成分的混混合斑检验。。C：单倍体型具有有民族特征。。D：同时进行性别别鉴定。E：多态性种类以以STR为主，并2.线粒体体DNA法医学应用的的问题点A：遗传的特殊殊性带来的个个人识别局限限性。B：其他男性成成分地污染。。C：约5%的X染色体重组区区的STR基因座的X染色体共有。。三、DNA分子水平的性性别与种属鉴鉴定1.DNA分子水平的性性别鉴定DNA分子水平的性性别鉴定的基基本原理是X与Y染色体的特异异基因的检检测。A：牙釉基因（amelogenin,AMG）-X染色体的特异异编码牙釉蛋蛋白基因；类类牙釉基因（（amelogenin-like,AMGL））-Y染色体的特异异编码牙釉蛋蛋白基因，与与AMG基因有90%同源性，AMG基因有一段插插入序列，导导致基因片段段长度长。由由1对引物可可同时扩增出出X与Y染色体的相应应基因片段。。X染色体-977bp产物；Y染色体-977bp与788bp两个产物。B：Y染色体的性别别决定区（sexdeteminationregionY,SRY）,位于Y染色体的着丝丝点近拟常染染区，一个外外显子，约1kb，表达蛋白诱导导睾丸发育。。根据该基因因的一段保守守序列设计引引物，可以扩扩增出254bp的片段。分析要点：避避免扩增失败败假阴性，应应加Alu序列作对照；；不等交换所所至性别异常常；基因突变变所至性别异异常。C：Y染色体的特异异STR基因座的检出出。2.DNA分子水平的种种属鉴定DNA分子水平的种种属鉴定的基基本原理是染染色体上人类类特异基因(片段)的检检测。包括人人与动物的鉴鉴别和动物间间的鉴别。A：Alu序列；属于散散在重复序列列短片段间隔隔型（shortinterspersedsegment,SINEs），具有人及灵长长类动物特征征的SINEs片段长约300bp，300-900万个，内部存存在限制性内内切酶AluⅠ识别部位，称称之Alu序列。检测法（1））Alu探针杂交斑点点法，基因组组DNA直接点膜。（2）PCR法：Alu片段特异性引引物，130bp的产物。B：28srRNA、SON基因3ˊ非编编码区等，依依据不同种属属动物相应片片段内部的碱碱基插入与缺缺失，PCR片段长度差异异鉴别动物。。C：mtDNA细胞色素b基因：人与其其他哺乳动物物细胞色素b基因内部有AluⅠ识别部位；鸟鸟类有NcoⅠ识别部位，依依据不同种属属动物细胞色色素b基因碱基序列列不同，其PCR产物酶切片段段长度与数目目产生差别而而鉴定种属。。D：STR基因座的种属属差异。斑迹检查一、血痕检测测顺序：肉眼观观察-预备试试验-确证试试验-种属鉴鉴别-遗传标标记检测-其其他检测。1、肉眼观察察：数量、形形态、位置、、色泽、大小小等，案件发发生过程。2、预备实验验preliminarytest目的：是否为为血液。检测指标：血血红蛋白或正正铁血红素-血液的主要要成分。基本原理：血血红蛋白或正正铁血红素具具有过氧化物物酶活性，使使过氧化氢分分解产生新生生态氧，0可可以氧化某种种化学物质形形成有颜色的的新化学物质质，以证明可可能是血液。。特点：敏感性性高，特异性性差。阴性可可否定血痕，，阳性疑为血血痕。方法：联苯苯胺试验---联苯苯胺蓝酚酞试验----在在碱性环境境中还原酚酚酞---酚酞（红红色）2、确证试试验conclusivetest目的：是否否为血液。。检测指标：：血红蛋白白或其衍生生物-血液液的主要成成分。基本原理：：血红蛋白白在酸（碱碱）性条件件下可分解解成血红素素，血红素素与某些化化学物质反反应可生成成血红素结结晶。以证证明是血液液。特点：敏感感性较高，，特异性好好。阴性可可否定血痕痕，阳性为为血痕。方法：血色色原结晶试试验-含氮氮化合物（（吡啶）血血色原结晶晶桃红色。。氯化血红素素结晶试验验-氯化血血红素结晶晶。血红蛋白吸吸收光谱检检测，血细细胞涂片检检测。3、种属鉴鉴别speciesidentification目的：是否否为人血或或何种动物物血液。检测指标：：人及动物物血红蛋白白或血清蛋蛋白。基本原理：：应用血红红蛋白或血血清蛋白特特异性抗体体，根据血血清学抗原抗体反应应原理，出出现免疫复复合物为阳阳性，判定定种属。常用抗体：：抗人血红红蛋白抗体体—种属、器官官双特异性性。抗人血清蛋蛋白抗体—种属特异性性。方法：沉淀淀反应precipitation；环状沉淀反反应；琼脂脂扩散实验（单向与与双向）；；对流免疫疫电泳；酶酶联免疫试试验。注意：交叉叉反应；种种属特异性性。生物化学方方法：血红红蛋白等电电聚焦。4、遗传标标记检测A：ABO型检测：吸吸收实验absorption-标准化抗体体1：32解离试验elution-高效价抗体体混合凝集试试验mixedagglutination-高亲合力抗抗体。B：其他遗传标标记检测二、精斑检检验1、定性试试验1）.预备备试验：酸酸性磷酸酶酶检出法法医学意义义：酸性磷磷酸酶在前前列腺分泌泌物中含量量最高。酸性磷酸酶酶化学性质质稳定。检测方法简简单敏感，，万余倍。。2）.确证证试验：A:精子检出：：最可靠，，注意无精精子症患者者。B:乳酸脱氢酶酶-X(lactatedehydrogenase,LDH)检出：源于精子，，活性最高高。意义同同精子检出出。3-4之间。C:γ-精浆蛋白(γ-seminoprotein,γγ-sm检出：源于前列腺腺，为糖蛋蛋白，也称称作P30（分子量3万），化学学性质稳定定，无精子子症患者无无影响。D：β-微精浆蛋白白(β-microseminoprotein,β-MSP检出：源源于前列腺腺的蛋白，，无精子症症患者无影影响。E：精子黄递酶酶（diaphorase,DIA）3多态性检出出：源于精子，，意义同精精子检出。。3）遗传标标记检测：：A：二步消化法法，检测常常染色体遗遗传标记。。B：Y染色体遗传传标记检测测。C：常规血型检检测（ABO吸收、解离离；PGM1、、DIA3、GLOⅠ等酶型；GC、ORM1、、GM、KM等血清蛋白白型。）D：DIA3型检测（无无精子症，，精子对照照）。三、精液与与阴道液混混合斑的检检验1、定性试试验A：阴道脱落上上皮的检出出。B：阴道肽酶（（vaginalpeptidase,Vp））的检出。2、混合斑斑的男性遗遗传标记检检测。A：常规血型检检测结果对对比推断法法：B：二步消化法法，检测常常染色体遗遗传标记。。C：Y染色体遗传传标记检测测。D：男性成分分分离检测法法；1）DIA3型检测。2）α2-精浆糖蛋白白（α2-seminoglycoprotein,α2-SGP）检测。源于精囊腺腺，为精液液ABH物质，应用用其抗体分分离混合斑斑的男性ABH物质，检测测ABO血型。3）抗人人精浆抗体体分离男性性成分ABO血型检测。。一、基因型型频率计算算基因型频率率（genotypefrequency））：：在一一个个群群体体中中，，某某基基因因座座上上不不同同基基因因型型在在全全部部个个体体中中所所占占的的百百分分比比。。根根据据等等位位基基因因频频率率计计算算。。例：：MN系统统：：M=0.526；；N=0.474MM=M=0.526×