益生菌基因工程改造和粘膜作为粘膜免疫的递送系统

益生菌的工程化改造和作为粘膜免疫的抗原递送系统简介人兽共患寄生虫病的防治技术研究华支睾吸虫、包虫、血吸虫、囊虫疫苗动物宿主在寄生虫病的传播中起了非常重要的作用，以期通过对动物宿主的免疫阻断疾病传播目前，成功的寄生虫疫苗极少，希望另辟蹊径主要内容益生菌的功能益生菌在疫苗研究中的应用枯草芽孢作为消化道粘膜疫苗递送系统及其工程化改造应用前景存在的问题益生菌功能肠道微生态调节功能（通过消耗氧、产生乳酸等有机酸、种群密度感应、细菌素等调节肠道正常菌群和致病菌群的生理平衡）消化道营养功能（包括合成人体必需的氨基酸、维生素、促进食物消化和吸收的各种酶类)免疫调节功能(通过益生菌的组分促进宿主免疫的形成和调节机体免疫应答，增强宿主的免疫抵抗力）益生菌在疫苗研究中的应用益生菌应用于疫苗研究，是基于其独特的生理特性和免疫调节功能乳酸菌能通过胃酸环境并在肠道厌氧环境下定植在肠粘膜表面芽孢杆菌的芽孢能能够抵抗胃酸和小肠消化酶的作用，能促进肠粘膜吞噬细胞的功能和宿主的免疫应答皮肤、消化道、呼吸道、泌尿生殖道是病原体入侵的主要门户，粘膜免疫对抵抗各种病原的入侵发挥了极为重要的作用目前的疫苗（减毒活疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、重组病毒疫苗等）主要采用注射免疫方式，不能有效刺激粘膜免疫。极少有口服疫苗，主要是疫苗在经过消化道时易被酸性环境和各种酶破坏，不能产生有效的保护性免疫新型口服疫苗以乳酸杆菌作为表达系统，将外源抗原进行分泌表达，刺激肠道粘膜免疫以枯草芽孢杆菌作为表达系统，将外源抗原进行分泌型表达或表达在芽孢表面，以分泌的可溶性抗原或重组芽孢颗粒抗原形式刺激粘膜免疫将疫苗的特异性保护与益生菌功能融为一体枯草杆菌作为口服疫苗载体的优势生物安全性高枯草杆菌在营养缺乏的情况下，能产生内生芽孢-抗性好枯草芽孢有独特的免疫学特性：口服枯草芽孢肠道相关淋巴组织（GALT）识别活化GALT分泌型（SIgA）诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统枯草杆菌作为口服疫苗载体的优势枯草杆菌易于进行遗传工程操作枯草杆菌芽孢生产成本低：枯草杆菌生长快速，对营养要求低，适于现代工业发酵生产重组芽孢疫苗，稳定性高，方便储存、运输，并可以作为食品添加剂使用。通过胃肠道后，大部分枯草杆菌芽孢仍能存活。正进行的下一步工作cercariaemetacercariaemeracidia克隆策策略pUS186质粒枯草杆杆菌基基因组组提取取PCR扩增枯枯草芽芽孢外外壳蛋蛋白CotC启动子子及结结构基基因pGEX-Ag质粒pUS186-CotC质粒pUS186-CotC-Ag质粒转化枯枯草杆杆菌WB600诱导芽芽孢形形成重组芽芽孢CotC-TP重组芽芽孢的的超微微结构构示意意图芽孢耐耐性评评估细菌：：B.subtilisWB600繁殖体体,E.coliJM109，B.subtilisWB600芽孢主要试试剂模拟胃胃液：：取10mlLB,用盐酸酸调PH值至2.0,加加入胃胃蛋白白酶10mg。。模拟肠肠液：：取10mlLB，，加胆酸酸钠（（sodiumcholate））20mg，胰液素素（pancreatin））10mg,调PH值至7.4。1枯草草杆菌菌芽孢孢抗性性评估估0min15min30min1h0min15min30min1h0min15min30min1h0.000﹪0.0024﹪﹪93.3﹪﹪图3-1在模拟拟胃环环境中中枯草草杆菌菌芽孢孢的存存活率率图3-2在模拟拟胃环环境中中枯草草杆菌菌繁殖殖体的的存活活率图3-3在模拟拟胃环环境中中大肠肠杆菌菌的存存活率率1枯草草杆菌菌芽孢孢抗性性评估估0h1h2h3h0h1h2h3h0h1h2h3h258.0﹪图3-6在模拟拟肠环环境中中大肠肠杆菌菌的存存活率率图3-5在模拟拟肠环环境中中枯草草杆菌菌繁殖殖体的的存活活率0.0013﹪﹪图3-4在模拟肠环环境中枯草草杆菌芽孢孢的存活率率92.0﹪﹪ABCD图免免疫荧光光检测华支支睾吸虫表表膜蛋白在在芽孢表面面的表达A:TP31.8；B:TP20.8；C:TP22.3；D:pUS186-Cotc.举例华支支睾吸虫表表膜蛋白重重组芽孢芽孢疫苗免免疫大鼠腹腔注射免免疫SD大白鼠分5组：naïve、pUS186-Cotc芽孢，及pUS186-Cotc-TP31.8、pUS186-Cotc-TP20.8、pUS186-Cotc-TP22.3表膜蛋白表表达株芽孢孢组用量：腹腔注射1×1010口服免疫6组：其中中5组与腹腹腔注射分分组相同，，第六组为为三表膜蛋蛋白表达株株混合芽孢孢组（cocktail组）。乙醚轻度麻麻醉大鼠后后，分别用用1×1010芽孢在第0、1、2、16、17、18、、33、34、35天用灌胃针经口免疫疫各组大鼠鼠，cocktail组为同时给给予三表膜膜蛋白表达达芽孢各1×1010。2.1腹腹腔注射免免疫TP31.8表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP31.8特异性IgG水平(OD450)TP31.8表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP31.8特异性IgG1、IgG2a水平TP20.8表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP20.8特异性IgG水平(OD450)TP20.8表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP20.8特异性IgG1、IgG2a水平TP22.3表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP22.3特异性IgG水平(OD450)TP22.3表达株芽孢孢腹腔注射射血清TP22.3特异性IgG1、IgG2a水平口服TP31.8表达芽孢大大鼠血清特特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)naiveCotCCotC-TP31.8Day15day32day50Day15day32day50AB2.2口口服免疫口服TP20.8表达芽孢大大鼠血清特特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)Day15day32day50Day15day32day50CotC-TP20.8CotCnaiveAB口服TP22.3表达芽孢大大鼠血清特特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)ABDay15day32day50Day15day32day50CotC-TP22.3CotCnaive口服免疫第第50天粪粪便中表膜膜蛋白特异异性IgA水平肠道黏膜免免疫为肠道道寄生虫排排虫主要机机制。肠道道免疫同时时也能引起起胆道黏膜膜免疫系统统功能增强强，使胆道道特异性分分泌型IgA升高。胆道分泌型IgA能阻碍病原原生物对胆胆管及肠道道黏膜的吸吸附及其所所分泌的毒毒性物质对对黏膜的损损害，从而而增强对胆胆道及肠道道的保护作作用。3芽孢疫疫苗口服免免疫后的保保护性表达的稳定定性质粒不能连连续扩增和和维持，涂涂板连续培培养10天后，只有有5%的菌株含有有重组质粒粒。草鱼和麦穗穗鱼口服芽芽孢疫苗及及其免疫效效果将3种TP重组芽孢杆杆菌的4L培养基离心心获得的芽芽孢沉淀与与0.5kg玉米粉和100g鸡蛋清混匀匀初步制备备鱼用口服服饲料选择20尾麦穗鱼分分为实验组组和对照组组，每组各各10尾。同时选选择20尾草鱼鱼苗苗，分为实实验组和对对照组，每每组各10尾。将各组鱼苗苗在实验室室生态池内内常规饲养养，每天作作换水及消消毒处理。。每天早晚晚投喂研究究制备的鱼鱼用口服饲饲料，每次次投喂1g/10尾连续投喂4周后，将筛筛选阳性的的纹沼螺放放入小方皿皿中释放尾尾蚴，收集集200条尾蚴放入入小碗中，，放入鱼进进行攻击感感染。每组感染攻攻击感染后后4周后分组检检测比较鱼鱼用口服饲饲料预防麦麦穗鱼和草草鱼感染华华支睾吸虫虫尾蚴的效效果单纯芽孢喂喂食组囊蚴蚴的回收率率，囊蚴回回收率草鱼鱼为80%，麦穗鱼为为145%。3种重组芽孢孢混合喂食食组，均未未发现囊蚴蚴?重组枯草芽芽孢疫苗的的应用前景景适合做禽畜畜、水产的的益生菌微微生态制剂剂适合各种病病原（尤其其是经消化化道和呼吸吸道感染））的感染性性疾病的疫疫苗载体实现益生菌菌和疫苗功功能的复合合型动物饲饲料添加剂剂和食品添添加剂。风险评价在连续喂食食重组B.substilis芽孢菌30天的大鼠肠肠腔分离的的其他菌株株中未发现现有重组质质粒的水平平转移质粒携带的的卡那抗性性基因水平平转移的可可能性很小小重组质粒在在活菌内难难以持续扩扩增和传代代，会逐步步消失，对对环境影响响小。存在的问题题和解决策策略重组枯草芽芽孢不能在在肠道定植植，芽孢一一次性排出出率在99.5%以上，要实实现足够的的免疫，服服用剂量要要大，次数数多要解决枯草草芽孢杆菌菌繁殖体在在肠粘膜的的定植能力力