植物同工酶分析技术

实验8植物同工酶分析技术什么是同工酶同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。广义是指生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶。按照国际生化联合会（IUB）所属生化命名委员会的建议，则只把其中因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶称为同工酶。最典型的同工酶是乳酸脱氢酶（LDH）同工酶。同工酶的基因先转录成同工酶的信使核糖核酸，后者再转译产生组成同工酶的肽链，不同的肽链可以不聚合的单体形式存在，也可聚合成纯聚体或杂交体，从而形成同一种酶的不同结构形式。同工酶应用1、在生物学中，同工酶可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。例如最原始的脊椎动物七鳃鳗（Lamprey）只有一种LDH肽链，进化到较高级的鱼类才有A、B两类肽链。又如通过对地理分布不同的物种间某一同工酶谱的普查可以推测物种的地理来源。动、植物的遗传变异可通过子代和亲代同工酶谱的比较来鉴别。法医学中也可用多种同工酶谱的分析来鉴定亲子关系。细胞杂交或植物杂交育种后是否出现新品种也可用周工酶谱的比较来确定。在个体发育中，从胚胎到出生，再到成年，随着组织的分化和发育，各种同工酶谱也有一个分化转变的过程。某型同工酶在胚胎的大多数组织中出现，成为主要型式，称为原始型同工酶。但出生后在某些组织中逐渐减少而被另一型同工酶取代，后者在胚胎组织中几乎不存在或含量极微，只在分化成熟的少数组织中存在，称为成年型同工酶。在植物的不同发育阶段，同样可见同工酶谱的相应改变。

2、在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段，癌瘤组织的同工酶谱常发生胚胎化现象，即合成过多的胎儿型同工酶。如果这些变化可反映到血清中，则可利用血清同工酶谱的改变来诊断癌瘤。此外。因同工酶谱有脏器特异性，故测定血清同工酶常可较特异地反映某一脏器的病变，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是诊断心肌梗塞较特异的指标，较测定血清LDH或肌酸激酶（CK）总活力更为可靠。同工酶分离同工酶分离方法主要有电泳法、层析法、酶学法和免疫学法等，其中以电泳法应用最为广泛。其原理在于同工酶是功能相同但结构不同的一组酶，由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，致使同工酶在电泳时，其迁移率也存在差异电泳电泳(electrophoresis，简称EP)指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。1937年瑞典科学家Tiselius成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品电泳方向电泳带孔胶大分子按分子大小分离小分子影响电泳效果的因素1、带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；2、颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；3、溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；4、溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；5、电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；6、离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；7、电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；8、支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。聚丙烯酰胺凝胶电泳胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。聚丙烯酰胺凝胶结构上的特点1、聚丙烯酰胺的基本结构为丙烯酰胺单体构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起；2、链的纵横交错形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛的性质；3、网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有抗对流的作用；4、长链富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶；5、该结构不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。过氧化氢酶过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。一、实验目的1.通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分析在遗传学研究中的意义2.着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方法。二、实验原理同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利用凝胶电泳技术可以将它们分开，用专一的作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上呈现同工酶谱。同工酶的不同分子形式，可以出现在同一生物的不同发育时期，所以取不同时期的材料，酶带的情况就不一样。这是同工酶技术适用于发育研究的方便之处。另一方面，利用同工酶技术进行遗传学分析与群体遗传学研究时，则特别要求取材的一致性。否则，它们之间的差异可能不是遗传而是由发育造成的。例如要比较2个蚕豆品种的遗传差别，可用它们的发芽种子进行比较。但这时至少应该检查是否是同年的种子、是否在发芽前都晒过种、是否同时浸种、是否恒温发芽以及是否取同样部位和同样分量等。同工酶电泳在植物的分类、鉴定、起源、杂种优势利用和育种等研究中有重要意义。三、实验材料黄豆和蚕豆四、实验器具和药品1、器具电泳仪、垂直电泳槽、微量加样器、Tip头、研钵、移液管、离心机。2、药品三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。五、实验步骤1、提取酶液取蚕豆幼芽2个和黄豆幼芽3个分别置于研钵中，加入1毫升水研磨匀浆、然后将样品移至小离心管中离心（1000rpm）15min，取上清液，备用。2、聚丙烯酰胺凝胶系统的配制(16ml)A液：1mol/L盐酸48.0ml，Tris36.0g,TEMED0.23ml加水至100ml,pH值8.3

B液：丙烯酰胺30.0g；甲叉双丙烯酰胺0.8g加水至100ml。

C液：过硫酸铵（用前配制）1.4％。

配胶：A∶B∶C∶H2O=1∶2∶0.4∶4.6

配胶后立即灌进装胶室，插上梳子。3、电极缓冲液配制Tris3.0g,甘氨酸14.4g加水至1000ml,pH8.8,使用时稀释10倍。4、染色液配制（过氧化物酶染液）醋酸联苯胺溶液5毫升，3％H2O22ml，H2O93ml5、加样和电泳向各加样孔中滴加24μl的样品酶粗提液。加一小微滴1％溴酚蓝，在电压120V下进行电泳分离，根据指示剂位置确定电泳时间。电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，用刀片或薄板轻轻将玻璃夹层分开。电泳缓冲液加在槽中的样品夹在两块玻璃板之间的凝胶电泳缓冲液电泳示意图分子量大分子量小电源6、染色将完整的胶块置于染色器皿中，加入染色液，浸泡整块凝胶，室温下染色20—30min，呈现酶带后取出胶块，用水漂洗以终止染色。7、对带型清楚的胶应做摄影记录或做扫描测定，胶晾干后做永久保存。六、实验报告及思考与练习1、绘出样品同工酶谱，并说明酶谱差异。、2、将酶带条数、宽度、着色深浅和移动距离填入下表(表16-1)：计算酶带的相对迁移率Rf=某酶带迁移距离/溴酚蓝指示剂迁移距离表16-1根据迁移率Ｒ，值绘制同工酶酶谱及聚类分析；①计算酶谱的相似性系数：ｃ＝２ｗ／（＋ｂ），其中，ｎ为种Ａ酶谱的酶带数，ｂ为种Ｂ酶谱的酶带数。Ｗ为Ａ，Ｂ两种的相同酶带数，②计算不相似性系数值：ｄ：ｚ—ｆ。③采用未加权配群法，即ＵＰＧＭＡ法，进行聚