KM-8p主要用于原生质体培养

生物技术在植物育种中的应用一、细胞工程与作物育种二、转基因技术与作物育种三、分子标记帮助选择育种第一节细胞工程与作物育种植物细胞工程（包括细胞和组织培育、原生质体培育与体细胞杂交等）是以植物组织和细胞培育技术为基础发展起来的一门学科。植物细胞的全能性是植物细胞工程的理论基础。细胞的全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在实力。

细胞工程技术已在作物的品种改良、作物种质保存、作物快速繁殖、作物脱毒、植物体外受精、基因转移等方面得到广泛应用。一、植物细胞和组织培育基本技术（一）培育基及其组成常用培育基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。MS培育基的无机盐和离子浓度较高，养分平衡，是目前运用最多的培育基。B5含有较低的铵离子，这个成分可能对很多培育物的生长有抑制作用。White培育基的无机盐含量较低，适于生根培育。KM-8p主要用于原生质体培育，特点是有机成分较困难，包括几乎全部的单糖和维生素及呼吸代谢中的主要有机酸。N6是花药培育中常用的培育基，其成分简洁，且KNO3和(NH4)2SO4含量高。（二）、培育基的配制（1）母液的配制为了便利起见，一般先配制母液（大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液）。*大量元素可配制成10倍母液。配制时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最终加入Ca2＋。微量元素一般配成100或1000倍母液。第三种母液就是铁盐，铁盐必需单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀，一般接受螯合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，常扩大200倍。最终一种母液是激素，每种激素应单独配制母液，多种激素难溶于水。（2）培育基的配制1、混合各成分母液2、熔化琼脂3、混合4、调pH5、分装6、灭菌7、放置备用。（3）无菌操作方法1、消毒剂2、无菌操作3、无菌培育1、体细胞克隆变异的遗传基础何卓培认为植物组织细胞培育中DNA复制和细胞分裂增生中染色体行为脱离常规是导致体细胞及其再生株特征、特性变异的根本缘由变异体：不加任何选择压力而筛选出的个体称为变异体。突变体经过施加某种选择压力所筛选出的无性变异，称为突变体。体细胞克隆变异是指织物组织和细胞培育物在培育过程中产生的变异。（1）染色体数目变异细胞内DNA重复复制，最多见的是多倍体，主要是培育基中运用了细胞分裂素。（2）染色体结构变异最重要的是染色体缺失、倒位、重复和易位。是体细胞克隆变异的主要来源。（3）点突变这种突变可分为多种类型。第一种是自发突变；其次种是诱发突变；第三种点突变是基因的表达及基因放大和衰减；第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地变更了基因的依次，但仍影响基因的表达。这种变更包括：某一基因拷贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程中基因的转变。转座因子也是造成体细胞突变的缘由之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控。（转座因子：细胞中能变更自身位置的一段DNA序列。转座因子变更位置（例如从染色体上的一个位置转移到另一个位置，或者从质粒转移到染色体上）的行为称为转座。由于转座因子既能给基因组带来新的遗传物质，在某些状况中又能像一个开关那样启动或关闭某些基因，并常使基因组发生缺失、重复或倒位等DNA重排，所以它与生物演化有亲密的关系，并可能与个体发育、细胞分化有关。）2、体细胞突变体的筛选与利用（1）植物体细胞突变体的类型a抗性突变体：是指具有突变的细胞或再生株具有抗拒某一物质、药物和不良条件实力的个体。b雄性不育系突变体：Kaul从花药培育加倍单倍体中获得了水稻雄性不育突变体。Brettel等从玉米雄性不育系的培育物中获得了雄性可育的突变。c养分缺陷型突变体：是指培育的细胞由于体内缺乏某一种物质合成的酶，而不能在基本培育基上生长的一种突变体。d各种形态特征和生物学特性突变体：体细胞变异在形态特征和生物学特性都有广泛的变异。（2）突变体的筛选在植物细胞培育中，自发突变的频率为10-5－10-8，为了增加突变频率，须要进行诱变处理，诱发处理可使其突变频率提高到10-3。常用的诱变因素有两类：一是物理诱变剂，二是化学诱变剂一步筛选法和多步筛选法或正选择法和负选择法。（4）在作物改良上的应用包括抗病、抗除草剂、抗氨基酸或氨基酸类似物、耐盐、耐旱等。*单倍体细胞培育及育种利用1、单倍体细胞培育在遗传和育种中的应用价值单倍体在遗传和育种探讨中有如下优点：（1）后代快速纯合，通过单倍体可快速产生纯系。（2）提高选择效率（3）解除杂种优势对后代选择的干扰（4）遗传探讨的良好试验材料体系（5）突变体的筛选。2、离体培育条件下的小孢子发育小孢子发育途径：小孢子母细胞四分体小孢子单核早期单核靠边期双核期三核期（成熟花粉粒）养分细胞发育途径；生殖细胞发育途径3、影响花药培育的因素（1）供体植株的生长条件：有时只有在控温、确定光周期和光强的环境条件下，其花药才能有反应。（2）供体植株的年龄（3）花粉发育时期（4）花蕾和花药的预处理（5）培育基及培育条件。二、植物原生质体培育和体细胞杂交探讨和利用原生质体的首要环节是原生质体的分别和培育。无论是制造单细胞无性系、体细胞杂交，还是用作转化的受体，都必需分别培育出分化力强，比较简洁再生成植株的原生质体。体细胞杂交又称原生质体融合，体细胞杂交的最大特点是有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功。胞质杂种：具一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的杂种细胞。体细胞杂交的最大特点是有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功。体细胞杂交包括以下几个步骤：1、原生质体的分别和培育2、原生质体间的融合；3、融合后杂种细胞的选择；4、诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。一、原生质体的分别和培育分别原生质体的方法一般有机械法分别和酶法分别两种。机械法分别是早期接受的分别方法，先对材料进行质壁分别处理，然后切割，这一过程中会释放出少量的不受损伤的原生质体。用这一方法仅能从液泡很大的材料获得原生质体，而不能应用于分生细胞。酶法分别原生质体是目前常用的方法，可分为一步法和二步法。一步法是将果胶酶(pecti-Ilase)和纤维素酶(celluluse)等混合处理材料，干脆分别获得原生质体；二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分别，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。目前多用一步法。（一）影晌原生质体分别的因素1、材料来源：叶肉细胞是常用的材抖，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培育物。2、渗透压：原生质体分别之前必需确定一个适合的渗透压。3、酶：植物细胞壁结构困难,由纤维素和半纤维素组成,须要确定的酶组成才能降解它。4、分别培育基。5、培育条件：酶处理时的温度和pH最重要。6、组织前处理：高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分别可能有较好的效果。（二）原生质体的收集、纯化和活力测定：原生质体酶解完成后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，收集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液同样渗透剂的无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，反复几次，便完成原生质体的洗涤工作。原生质体的纯化可接受庶糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法。（三）原生质体培育原生质体培育前必需调到确定密度，一般103-105/ml的密度比较适合原生质体培育。原生质体的培育方法各种各样，依作物和材料来源而异。平板培育、液体浅层培育、悬滴培育、液固双层培育、琼脂糖包埋、看护培育等是原生质体培育常用的方法。但不管哪种培育方法，在培育过程中，都应依据细胞生长状况不断降低渗透压。待肉眼可见的细胞团形成后，便可转移到一般细胞培育基上进行细胞繁殖和分化工作。液体浅层静置法：是将含有确定密度的原生质体悬浮培育液，放在培育皿中，形成一个液体薄层，封口后放在培育室中静置培育。其优点是通气性好，接触O2面大，排泄物易扩散，而且易于补加簇新培育基。同时也易于用倒置显微镜进行视察和照相。影响原生质体培育的因素很多，物理条件如密度、光照和温度等都会影响培育效果。低于确定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培育基中原生质体在培育过程中释放的有害物质脱毒。原生质体培育一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种始终在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。照光与否以及什么时候照光，光强如何，均干脆影响着植板率。原生质体培育过程中假如培育基条件能够满足需求，原生质体首先形成新的细胞壁，继而进行分裂，形成多细胞团。在促进分化的条件下还能分化出芽、茎、根，再生成完整的植株。二、原生质体融合（一）融合的基本方法：1、原生质体选择：用于融合的原生质体应具有四个特征a获得原生质体的量要多，活力要强，遗传上还要一样；b融合原生质体的双亲中至少有一方有诱导原生质体再生成完整植株的成熟技术；c原生质体应带有可供融合后识别异核体的性状；d在异核体发育中有能选择杂种的标记性状。2、融合方法：A多聚化合物法：培育物中加入多聚－L－鸟氨酸、多聚－L－赖氨酸等多聚化合物，以促进原生质体融合的方法。B高pH高Ca2＋法：CPEG法D电融合法3、融合方式：A对成融合：种内或种间完整原生质体的融合，可产生核与核、胞质与胞质间重组的对称杂种，并可发育为遗传稳定的异源双二倍体杂种植株。B非对称融合：用物理或化学的方法处理亲本原生质体，使一方细胞核失活，或者使另一方胞质基因失活，再进行原生质体融合。非对称融合在育种中有着广泛的应用：（1）、非对称融合在确定程度上克服体细胞不亲和现象，可得到用一般方法得不到的杂种。（2）、非对称融合是供体单向转移部分遗传物质到受体中去的一种行之有效的方法，这对于转移由多基因限制的具有重要经济价值的性状的有很大意义。（3）、非对称融合可以快速转移胞质基因。导致非对称融合中供体染色体丢失的因素有：1、射线的剂量，剂量对染色体丢失影响很大；2、亲缘关系；3、融合亲本染色体的特性和状态，染色体的大小和数量不同，都会影响染色体的丢失；4、融合时染色体所处的细胞周期。假如想保留亲本全部染色体，可考虑选用间期细胞，假如想亲本部分染色体丢失，则选用分裂中期的细胞5、培育时间和选择压对染色体丢失也有影响。4原生质融合体的生长发育三、杂种细胞的选择1、互补选择法2、机械分别法四、杂种细胞的鉴定其次节转基因技术与作物育种作物转基因育种是依据育种目标，从供体生物中分别目的基因，经DNA重组与遗传转化或干脆运转进入受体作物，经筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验育成转基因新品种或种质资源。一、转基因植物发展的特点1、种类持续增多2、转基因植物商品化速度明显加快3、转基因植物作为生物反应器促进药物生产4、转基因植物稳定高效表达技术不断完善二、基因工程理论和技术准备基因工程发展的重要理论和技术基础是：分子生物学中心法则的确立；限制性内切酶和其它工程酶的发觉；DNA、RNA和蛋白质的序列分析；DNA和RNA合成技术和转基因载体的发觉。而且这些理论和技术都在不断完善和发展中。三、转基因植物的基因转化方法（一）DNA干脆导入的基因转化技术：是指不依靠于农杆菌载体和其它生物媒体，将特殊处理的外源目的基因干脆导入植物细胞，实现基因转化的技术，又成为无载体介导转化。依据DNA干脆导入的原理可分为化学法和物理法两类。1、PEG介导的基因转化；2、基因枪法。（二）花粉管通道法介导的基因转化技术以生物自身的种质细胞为媒体，特殊是植物的生殖系统的细胞（花粉、卵细胞、子房、幼胚等），将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化，这种导入基因技术称为“种质转化系统”，有的也称为生物媒体转化系统，还有的称为整株活体转化，换句话说，基因转移主要是利用花粉管通道，利用子房、幼穗及种胚注射外源DNA等方法导入外源基因。该技术的主要特点表现为：1、转化的DNA可以是袒露的，也可以是重组在质粒上的，也可以是总DNA或某些DNA片断；2、是在植物整体水平上的转化，不须细胞分别、组织培育和再生植株困难技术；3、方法简便易行，并与常规育种紧密结合。具体方法包括：花粉管通道法，子房、幼穗幼胚注射法和DNA孵育法等。

花粉管通道法是指利用花粉管通道，将外源总DNA或外源基因在自花授粉前后的适当时期导入胚囊，转化尚不具备正常细胞的卵、合子或早期胚胎细胞。这种导入外源DNA的方法称为花粉管通道法。

此技术最早由我国学者周光宇（1973）提出的，并在长期科学探讨中不断发展。1983年，周光宇等在“MethodsinEnsymology”杂志上首次报道了棉花花粉管通道导入外源DNA获成功的探讨结果，标记着这一技术起先应用阶段。通过花粉管通道法导入外源基因通常有以下几种方法：1、花粉粒与外源DNA混合授粉法2、花粉粒培育法3、柱头滴注法4、花粉粒转化法5、微注射法。（三）农杆菌介导的植物基因转化技术根癌农杆菌和发根农杆菌均是革兰氏阴性菌，在植物基因转换上应用最早和较多的是根癌农杆菌。根癌农杆菌在土壤中含量极为丰富，它可以通过植物伤口处侵染多种植物，尤其是双子叶植物，受侵染的植物可以形成冠瘿瘤。植物一旦产生冠瘿瘤，除去根癌农杆菌后，冠瘿瘤仍能接着生长。四、分子标记与育种遗传标记是指基因型易于识别的表现形式。目前把遗传标记区分为四种类型，即形态标记、细胞标记、生化标记和分子标记。分子标记是在DNA水平上对基因型的标记。与其它标记相比分子标记具有以下优点：1、干脆以DNA形式表现，在植物的各个组织、各个发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；2、数量多，遍及整个基因组；3、多态性高；4、不影响目标性状的表达，与不良性状无必定的连锁；5、很多分子标记表现为显性或其显性能够鉴别出纯合和杂合的基因型。一、分子标记的分类：20世纪90年头分子标记技术发展快速。依据国际植物遗传资源探讨所Karp的人的分类方法，将目前应用的分子标记技术分为三大类。1、非PCR技术2、随机或半随机引物PC