激光共聚焦扫描显微镜LSCM

激光共聚焦扫描显微镜

Laserscanningconfocalmicroscope基本内容1.典型产品2.基本组成3.优点4.共聚焦的原理5.扫描模式6.整体结构7.应用1.典型产品Nikon的EclipseC1PlusNikon的EclipseC1Plus

1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（60x，100x），NA=1.49.。这是当前数值孔径最高的油浸物镜2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小，可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。3.时间间隔可变的TimeLapse:可以在拍摄过程中不同的时间段采用不同的时间间隔。2.基本组成一、基本组成（一）激光器:多线氩离子(458nm,488nm,514nm)、氦氖绿(543nm)、氦氖红(633nm)（二）扫描器(内装有针孔光栏、分光镜、发射荧光单色器及检测器)（三）光学装置：根据样品中荧光信号的强弱、大小及分布，调节激光能量、检测孔光栏、光电倍增管（PMT）的检测范围、物镜和电子放大倍数（zoom），以利于采集各种荧光信号。（四）计算机图像存储与处理及控制系统：实现了图像的优化、三维重建，实现了全自动程序化控制采集（检测）样品荧光图像的时间和空间，并和同时采集样品中多重荧光信号的分解及合成图像，对其进行定量测定。3.优点一.分辨率（0.18μm）二.可重构样品的三维结构三.无损伤、连续光学切片四.光谱扫描（分辨由光源波长，物镜参数和针孔直径等决定，如60X，NA1.4的物镜水平分辨率约为0.2

μm，垂直分辨率约为0.5μm。）（细菌细胞1-2

μm，原核生物细胞1-10μm）优点4.共聚焦原理利用照明针孔和探测针孔实现点照明和探测，并且被探测点位于焦平面。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点。共聚焦原理共聚焦原理1.点照明（为作图方便已将光线发散角放大）共聚焦原理假设是场照明（非共聚焦），会导致：一.发生衍射，使像模糊；

二.散射光干扰（即除了成像点外，其余点处有散射光进入探测针孔）；

而点照明则不会有这些问题。共聚焦原理消除衍射影响消除背景杂光共聚焦原理2.焦平面点成像共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，从上面的图可以看出，非焦平面点所成的像的光像被探测针孔挡住，不会进入光探头，所以焦平面点成像使像更清晰。共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像质量。5.扫描模式一.X—Y轴扫描二.Z轴扫描X—Y轴扫描（1）单光束扫描模式其中最常见的扫描安排结合了两个独立的扫描镜，具有中继光学系统。移动的垂直轴的反射镜即在试样上产生X—Y平面的扫描。但中间需要增加高级别的像差校正光学系统，导致发光效率降低。X—Y轴扫描（1）单光束扫描模式X—Y轴扫描（2）多光束扫描（尼普可夫圆盘扫描）多光束扫描技术提供了一个替代的单光束扫描配置照明效率低，而且扫描速度更快。其中旋转盘扫描仪有数百个孔，其功能作为照明和探测的针孔。由于磁盘扫描显微镜形成的实像，可以直接位于CCD照相机的图像平面中。尽管这方面的优势，它允许实时聚焦和成像的动态过程，有几个缺点限制了磁盘扫描共聚焦系统的实际效用。其中最严重的是典型的依赖于传统的广谱光源，和在磁盘发生极端的光损失。X—Y轴扫描（2）多光束扫描X—Y轴扫描奥林巴斯FluoView300激光共聚焦扫描系统同样可以实现

X—Z轴，Y—Z轴扫描Z轴扫描通常的方法是通过计算机控制的马达以预先设定的步距移动显微镜的镜台然后采集图像。（当然也有通过改变焦平面位置的方法）光学切片

通过精细平面光切，形成生物样品不同平面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴重叠就可形成一个完整的三维图象光学切片切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。6.整体结构7.应用激光扫描共聚焦显微镜的应用范围广泛，主要在于生物领域，包括多种神经解剖学和神经生理学的研究，广泛的细胞和组织的形态学研究，共振能量转移技术，干细