在干旱和高温单一或共同胁迫下,麻风树抵御氧化性损伤光合变化和保护机制

在干旱和高温单一或共同胁迫下，麻风树抵御氧化损伤的光合变化和保护机制

主要内容引言材料与方法结果讨论引言干旱和高温是两种重要的非生物胁迫，能够影响农作物生长和产量，尤其是热带地区。在半干旱地区和干旱地区的野外条件下这些胁迫均是同时发生。近期的研究已经揭示了干旱和高温共同作用下的分子和代谢应答是特殊的，不能通过干旱或高温的单一作用来推测。光合作用是非生物胁迫影响的主要进程之一。高温使光合作用受到抑制，因为影响了电子传递，PSII的光化学效率下降，抑制了Rubisco活性。Rubisco活性下降已被证明，因为高温影响了Rubisco活化酶活性，并随升温而加剧。另一方面，干旱通过提高CO2从大气扩散到叶片或者从下气孔到羧化位点的阻力，可能是由CO2可利用率的降低，抑制光合作用。野外条件下，高温经常伴随缺水和气孔关闭，能够降低CO2利用率，使叶绿体中的CO2/O2比率下降。一旦植物因光合效率降低出现低的NADPH和ATP消耗，NADP+/NADPH也会下降，光合电子传递链会被过度还原。这种情况促进电子流向米勒反应产生的O2和超氧自由基(O2•−)。此外，当C3植物暴露于胁迫条件下时，光呼吸途径可能增强，因为它是ROS潜在的来源，特别是过氧化氢。ROS的产生作为植物细胞的光合和需氧代谢的天然产物。在低浓度时，ROS可在植物氧化还原信号转导途径中当作信号分子。可是，胁迫条件下植物细胞中ROS的过量产生，会损伤细胞组分，包括DNA，蛋白质和膜脂。有抗氧化系统的植物能够保护自身免受氧化胁迫的损伤。这些机制利用ROS清除酶，比如超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX），以及低分子量的抗氧化剂，如抗坏血酸（ASA）和谷胱甘肽。尽管近期有非生物因素相关的氧化胁迫报道，但少有研究干旱高温共同作用的。而且，这些结果通常是片面的，与重要过程如光化学和全部光合作用无联系。单一和共同非生物胁迫条件下，氧化代谢的调控机制仍少有了解，尤其是它与光合作用和相关进程的关系。目前关于这个问题的知识仍旧处于初始阶段和片面的。对于胁迫条件下作物繁育，发展耐受高产基因型非常必要。麻风树是生长在半干旱地区边缘，经常遭受干旱和高温，在那里很多作物难以生存。麻风树有成为非生物胁迫共同作用下作物抗性的生理和分子机制的优良模型的可能性。本次研究中，检测了麻风树可在干旱和高温胁迫下，有效保护植物免受氧化应激和光化学机制损伤的假说。我们测量了麻风树叶片在干旱、高温单一胁迫和共同胁迫气体交换，叶绿素荧光和抗氧化应答。结果表明干旱明显影响了光化学活性和氧化代谢，并被高温胁迫强烈促进。数据证明高温干旱共同作用引起了协同和拮抗作用的复合反应。这些生理应答对于植物抵抗非生物胁迫的重要性被加以讨论。材料与方法在温室培养，选择合适的相对平均气温，相对湿度，最大光辐照度及光暗周期。23天后，分组。水状态，电解液泄漏率（EL）和叶片干物质产量叶片气体交换和叶绿素荧光叶片过氧化氢含量和脂质过氧化抗坏血酸含量酶的提取纯化及活性测定实验设计和数据分析结果干旱，高温，干旱+高温处理组引起了叶片干重DW下降了35%，10%和41%，与27°水况良好组相比，但是并没观察到可见的胁迫症状。只有干旱组叶片的水势ψW显著下降，但是仍然与其他处理组的对照组相似(Fig.1A).。干旱胁迫的植物的相对高的叶片水势与好的叶片水合状态相关，因为高的相对水含量和叶片肉质化引起的，与对照组植物出现的相似(数据未显示)。叶片电解质渗透率，作为膜损伤的指示，在干旱、高温、干旱+高温条件下分别上升了15%，28%，122%(Fig.1B)，通过TBARS积累测得的脂质过氧化分别增加了100%，50%和200%，与对照相比(Fig.1C).。这些结果表明高温和干旱的共同作用是不利的。与对照相比，叶片的CO2同化率(PN)在所有实验组中明显下降（86%，41%and89%）(Fig.2A)。相似地，气孔导度(gS)和瞬时羧化作用(PN/CI)也因干旱和高温降低。与对照组相比，gS下降了80%,47%and94%,PN/CI比率下降了84%,35%and82%在干旱，干旱+高温，高温实验组(Fig.2BandC)。干旱和高温的共同作用对叶片气体交换并无相互影响，不管温度如何干旱的影响占优势地位。高温对这些测量结果没有干旱的影响明显。光化学通过实际光化学量子产额(△F/’FM’),非光化学荧光淬灭(NPQ)和表观电子传递速率(ETRS’).在遭受了干旱和联合胁迫的实验组中△F/’FM’和ETRS’值下降了56%and83%(Fig.3AandB).可是，与对照相比，胁迫组和无胁迫组的FV/FM都没有显著差异（数据未显示），只有干旱和联合胁迫组的qN显著上升(Fig.3C).。高温，干旱+高温处理组的ETRS’/Pn比率上升了大约50%，300%在干旱处理组(Fig.3D).这些数据表明干旱和高温在向CO2固定途径分配PSII的过剩电子有明显的正相互作用（协同作用）。单独的高温处理不会改变多数光化学参数的值(Fig.3)。可是，干旱引起的光合机构的损伤被高温增强（拮抗作用）。抗氧化酶，比如CAT,APX,andSOD,表明了对干旱，高温，高温+干旱的不同形式的应答。叶片CAT活性在高温下38%，但是在干旱和干旱+高温组分别强烈抑制了60%和36%。结果表明高温和干旱对CAT活性的拮抗作用(Fig.4A).。与非胁迫相比，所有胁迫条件下，APX活性上升（在遭受干旱，高温和共同胁迫条件下大约100%，100%和300%(Fig.4B)。因此，两种胁迫因子有协同作用。高温处理下SOD活性受激36%，可是活性不只受干旱单独影响，在共同胁迫条件下抑制了42%。这些结果表明干旱和高温强烈的拮抗作用(Fig.4C).。与无胁迫组相比，叶片H2O2浓度在胁迫组显著上升。胁迫组上升的大约27%相似(Fig.5A),表明干旱和高温无加成效果。相比之下，共同胁迫组的总抗坏血酸浓度（ASA+脱氢抗坏血酸（DHA））下降了13%。与对照组相比，共同胁迫组无显著性差异(Fig.5B).暴露于干旱和干旱+高温组的叶片ASA/DHA比率并无变化，在高温胁迫组上升了71%。通过雷达图数据分析(Fig.6)表明植物在遭受高温干旱共同胁迫时，有最显著的变化。例如，在平行于较高的APX组中观察到显著的膜损伤（上升的TBARSandEL引起的）。而且，与其他情况相比，在干旱条件下，植物表现出一个较高的可替电子吸收汇活性（highETRS’/PN)）和耗散过剩光能(highNPQ)的作用机理。另一方面，与干旱胁迫组相比，在高温胁迫下维持高的净光合速率(PN)引起低的ETRS’/PN值(Fig.6).。可是，这些结果不意味着可替电子吸收汇因为高温失活。麻风树遭受高温条件（6h），这个物种的光合机构可能变的对高温胁迫耐受。而且，干旱预处理和同时发生的干旱不会改善高温下麻风树的光合性能。这些结果与经干旱预处理后表现对高温胁迫适应性的其他报道不一致。讨论研究表明干旱，高温和高温+干旱胁迫能够引起麻风树关键生理学过程的主要变化，通过膜完整性的测量，叶片气体交换，叶绿素荧光，氧化损伤指示剂和ROS清除系统来表明。叶片CO2同化率下降，部分因为限定条件下气孔(lowgS)和代谢限制(lowPN/CI)，主要是在干旱条件下(Fig.2)。细胞间的CO2浓度的维持与低的CO2同化率为胁迫条件下麻风树无气孔限制光合作用提供额外的证据。可是，gS的下降与高温胁迫下低的叶片水势无关，表明气孔对升温的适应或者对增强的空气水汽压亏损的适应。除了在叶片观测气体交换的变化，光化学活动也受干旱和共同胁迫的影响，而不只是热胁迫。事实上，实际原初光化学量子产量和表观电子传递率因为胁迫强烈下降(Fig.3).。因为ETRS’可能被视为一个整体的光化学活性指数，数据表明干旱，干旱+高温处理引起了类囊体膜电子传递链的显著失活。这些变化可能与醌积累的降低引起的PSII初级电子受体损伤有关，通过△F/’FM’的显著下降表明。当麻风树暴露于单一干旱或共同胁迫条件下，NPQ上升。高的NPQ值表明非辐射能量耗散机制是活跃的，而且较高比例的能量以热能形式散失而非用于光合作用。过剩激发能的热耗散被认为是光保护机制，能维持PSII初级电子受体在氧化状态，减少光损伤的可能性。实际上，在干旱胁迫的植物中这种机制更活跃。另外，暴露在干旱条件下的麻风树高的ETRS’/PN率，表明更多的电子被传递给替代电子汇而不是CO2同化反应。这些替代电子汇给PSII活性提供了额外的保护，因为与那些干旱+高温组相比，△F/’FM’和ETRS’较少受到干旱胁迫的影响。干旱胁迫对叶片气体交换和光化学反应起最大的影响。而且，干旱+高温同时胁迫增强了干旱对光化学活性的抑制作用，在遭受干旱+高温胁迫组中观察到最低的△F/’FM’和ETRS’值(Fig.3)。干旱+高温处理对叶片气体交换和光化学活性最有害，与膜完整性(EL)和脂质过氧化(TBARSlevels)结果一致。EL上升与TBARS积累有正相关，表明干旱+高温胁迫引起的质膜损伤至少部分是氧化损伤的结果。很多研究已经证明非生物胁迫对植物细胞造成的损伤部分因为氧化胁迫引起的。SOD–APX–CAT系统保护光合机构在环境胁迫条件下免受氧化损伤。SOD清除叶绿体和线粒体电子传递链产生的O2•−，SOD活动产生的H2O2被不同细胞组分的APX清除。另外，CAT去除过氧物酶体内通过光呼吸途径产生的H2O2。在当前研究中，氧化胁迫明显存在于麻风树叶片所有胁迫实验中，被脂质过氧化的增强引起(Fig.1C)。脂质过氧化的强度在遭受共同胁迫的植物中更高，表明叶片组织中主要的氧化损伤的进展。研究报道TBARS在叶片中积累，是植物组织中氧化损伤的良好指示者。CAT和SOD活性受高温胁迫促进，却受共同胁迫条件的强烈抑制(Fig.4BandC).。因干旱和共同胁迫造成的CAT和SOD活性抑制，可能是基因表达的下调或降解、变性和这些蛋白的抑制或失活的结果。例如，总CAT蛋白和活性的光依赖的下降在在对盐分的反应中出现。而且，需要不间断的蛋白合成，以在降解超过再合成条件下维持CAT活性，否则会下降。反之，遭受高温的麻风树叶片中CAT和SOD活性的上升，可能是因为高温引起的基因表达上调或/和蛋白亚型的激活。与CAT和SOD活性相比，遭受胁迫处理的植物中APX活性上升，但是除了共同胁迫组。一些APX亚型广泛分布在几乎所有的细胞器中，非生物胁迫总是引起基因表达和APX总活性的共同增强，为了补偿CAT活性的缺失。可是，APX总活性上升不会直接补偿受损的CAT活性，因为H2O2在叶片组织中显著积累。过氧物酶体和叶绿体中产生的过量的H2O2可能扩散到细胞质中，通过Fentonreaction转化为羟基自由基。这些是毒害最强的ROS并与脂质过氧化直接相关。我们的结果表明ROS清除系统对于保护麻风树叶片免受氧化损伤，特别是那些遭受共同胁迫的，被高水平的脂质过氧化和H2O2积累确认(Figs.1Cand5A).。胁迫条件下麻风树叶片中过氧化氢的积累可能主要由光呼吸产生，主要位于过氧物酶体内的过程。这种假设是在实验条件下，被CAT活性的下降(Fig.4)和ETRS’/PN率的上升支持的(Fig.3D)。光呼吸是C3植物中一个主要的可替电子汇，可能被实验中的胁迫条件促进。ETRS’/PN率达到了很高的值（大约60），表示光合损伤。实际上，我们发现无胁迫条件下的生长季的柑橘ETRS’/PN率大约在10，当冬季水况良好时，这些植物的表观ETRS’/PN值大约是21。这些变化可能是由低温下受损的光合作用引起的，因为最大Rubisco羧化率和RuBP最大再生下降，都依赖于光化学电子传递的能量供应。从这项研究中得出的数据表明单一胁迫和联合胁迫条件下，光化学损伤和氧化胁迫之间关系的复杂性。实际上，光合作用和抗氧化酶活性的变化不足以解释麻风树的应答，特别是氧化损伤。作为一个指示者，干旱比高温更具胁迫性，依据对光合作用的干扰（CO2同化率和光化学活性）和氧化损伤。这些更为严重的不利影响与电子从PSII到羧化反应的大量损失，CAT和SOD活性和较高的H2O2积累有关。与对照组相比，干旱只大幅抑制CAT，促进APX和维持SOD活性，高温处理组显著促进所有三种酶的活性。同时，对高温的响应对于H2O2清除和超氧自由基极其有利，特别是在叶绿体和过氧物酶体。维持SOD，APX，和CAT之间的良好平衡对于避免ROS积累、保护光化学机构和避免现在的氧化损伤是很有必要的，正如在高温胁迫的植物中表现的。实际上，受损的光化学活性和光呼吸的激增是叶片ROS积累的主要原因。数据表明干旱+高温条件引起了膜完整性、光合CO2同化、光化学活性和氧化代谢的最不利的影响。实际上，我们观察到PSII活性损伤，CAT和SOD活性显著抑制和过氧化氢积累。暴露于联合胁迫的植物叶片中总APX活性的激增，不足以避免重要的氧化损伤或过氧化氢积累。共同胁迫可以引发细胞质中基因亚型的上调但不会显著影响叶绿体中亚型的表达。细胞质APX亚型对植物细胞氧化还原平衡维持非常重要。然而，在共同胁迫条件下，总APX活性被显著上调，但是总抗坏血酸浓度和它的氧化还原平衡没有变化。这些结果表明一部分作为APX活性底物的还原