基因工程概论课件

第一章绪论第一节基因工程诞生的理论基础一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题1.肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。2.噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNA二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。

1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。三.提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说二.DNA分子的核苷酸序列分析

1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术,1980年Nobel化学奖三.载体的构建1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增四.转化技术

1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术

1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术1962年，Arber等人发现限制性内切酶1968年,

Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性内切酶HindIII

1967-1968年，发现了DNA连接酶，建立了DNA序列分析方法

1972年，得到了第一个重组的DNA分子

1973年，完成了第一个细菌基因的克隆

1974年，首次实现了异源真核生物的基因在大肠杆菌中的转化

1978年，用大肠杆菌表达人工合成的人脑激素和人胰岛素

1981年，成功获得了第一个转基因小鼠，培育出转基因果蝇

1982年，第一个由基因工程菌生产的药物:胰岛素

1983年，第一个转基因植物培育成功

1986年，基因工程生物在控制的情况下，实验性地释放到环境中

1988年，开始人类基因计划

1994年，基因工程西红柿在美国上市

2000年，人和拟南芥测序完成

第四节基因工程的定义及其主要的研究内容

一.基因工程的诞生1.Berg的开创性实验1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来(用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶)。Boyer-Cohen实验StanleyCohenHerbBoyer1986Nobel生理或医学奖2.特征(1)按照人们的主观愿望进行设计

(2)跨越物种屏障外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖(3)无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达3.基因工程（geneengineering）相关的概念：基因操作（genemanipulation），重组DNA技术（recombinantDNAtechnique），基因克隆（genecloning），分子克隆（molecularcloning）

4.Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体

Clone(动词)：是产生一个遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体的过程

5.研究内容(1)目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断(2)重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上(3)重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中(4)克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）(5)目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物第五节基因工程的安全性1996年美国国立卫生研究院公布了“重组DNA研究准则”

在实验室安全防护方面，明确规定了物理防护和生物防护两个方面的统一标准。物理防护为P1——P4四个等级，生物防护则分为EK1——EK3三个不同的等级

2.实验室的生物安全生物防护方面，EK1——EK3级是专门针对大肠杆菌而规定的安全防护标准。它是依据大肠杆菌在自然环境中的存活率为前提制定的。EK1级大肠杆菌菌株，在自然环境中一般都要死亡。而符合2-3级标准的大肠杆菌菌株，在自然环境中则是无法存活的。第一个安全的大肠杆菌是K12菌株，由于不适用于操作，目前广泛应用的是K12的派生菌株。

3.载体的安全应该是失去了自我迁移的能力，不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。

三.基因工程产物或产品的安全性

转基因作物对生态环境可能的影响，如产生超级杂草具有除草剂耐性因子的转基因作物的遗传因子可能通过授粉和种子迁移传播给野生植物。获得这些耐性后的野生植物有可能会变成对一般除草剂有耐性的“超级”杂草。为了清除这些杂草，将不得不使用更强大的，浓度更大的除草剂，这必然会引起土壤板结、土质变坏、药物残留等，从而对生态环境造成破坏。2.标记基因的传递可能引起的抗生素耐性基因工程技术中应用的标记基因通常是一类抗生素基因，人们担心食用含有此类标记基因的食品后，是否对肠道微生物产生影响或者抗生素类药物产生耐药性。3.转基因食品引起的食物过敏的可能性转基因食品引起食物过敏的可能性是人们关注的焦点之一。特别是如果转基因食品转入的蛋白质是新蛋白时，这些异种蛋白有可能引起食物过敏。4.毒性方面，如蛋白酶抑制剂，溶血剂，神经毒素许多食品原料生物本身会产生大量的毒性物质，如蛋白酶抑制剂、溶血剂和神经毒素等，那么转基因作物中是否有毒素以及毒素的含量就成为争议的重要内容之一5.伦理方面许多民族都有其独特的饮食习惯和制约，某些宗教团体禁止食用的动物基因转入他们通常食用的动物中（如将猪的基因转入绵羊中），这可能触犯某些民族的饮食戒律；另外将动物基因转入植物中可能使素食者感到困惑。6.其他除以上争论外，对转基因食品安全性的争议还表现在微生物作为宿主细胞的安全性问题，转基因动物激素、食品、饲料添加剂等对动物本身的生长、发育和繁殖的安全性问题等方面。基于上述诸多方面的异议，转基因食品的安全性问题的研究成为转基因技术研究的一个热点。所以关于GMO（geneticmodifiedoriganism）的争论主要集中于安全性，宗教，贸易

四.转基因生物安全性评价对转基因生物安全评价主要集中在环境安全性和食用安全性两个方面。1.环境安全性评价环境安全性评价的核心问题是转基因生物是否会将所转基因再转移到其它生物中，会不会破坏生态环境，打破原有生物种群的动态平衡，包括：①转基因作物本身成为杂草的可能性；②转基因作物便亲缘野生种成为杂草或超级杂草的可能性；③转基因作物可能产生新的病毒或疾病；④转基因作物对非目标生物的危害；⑤转基因作物作为外来种对新环境的入侵，使生物多样性受到威胁；⑥转基因作物对生态系统及生态过程的影响；⑦其他一些不可预计的风险。2.食用安全性评价食用安全性，主要包括营养成分、抗营养因、毒性和致敏性等。目前普遍公认的食用安全性评价的原则是经合组织（OECD）1993年提出的“实质等同性”（Substantialequivalence）原则。

（1）实质等同性原则实质等同性原则最早由国际经济互助开发组织于1993年提出并已被大多数国家采用。该原则认为如果导入基因后产生的蛋白质经确认是安全的，或者是转基因作物和原作物在主要营养成分（脂肪、蛋白质、碳水化合物等）、形态和是否产生抗营养因子、毒性物质、过敏性蛋白等方面没有发生特殊的变化的话，则可以认为转基因作物在安全性上和原作物是同等的，对人类的影响是相似的，则无需对它的安全性再作进一步的分析。根据“实质等同性”原则，转基因食品安全性分成三个等级：I级，转基因食品成分、营养价值、体内代谢途径、杂质水平和传统食品相同，或变异在已知的范围内，这类食品无需做进一步的分析评价；Ⅱ级，与传统食品极其相似，但产生或缺少某个新成分或特性，对不同成分或特性应作进一步的分析评价；Ⅲ级，与传统食品既不相同也不相似，需要作广泛的营养学和毒理学评价。（2）转基因食品的食用安全性转基因食品与相应的传统食品相比，至少存在以下两个不同点：一是转基因食品中含有利用转基因技术导入的外源基因，而传统的食品中不含有；二是由于外源基因的表达使转基因食品中含有了特定的外源基因表达产物(相应的蛋白质）。

A.外源基因的毒性及其水平转移问题转基因食品中外源基因含量很小，其化学组成与普通DNA并无差异。通过食用转基因食品而摄入体内的外源基因的数量与消化道中来源于其他食品中的DNA数量相比微不足道。因此，转基因食品中的外源基因本身不会对人体产生直接毒害作用。

转基因食品中的外源基因特别是抗生素抗性基因（Antibioticresistancegene）被摄入人体后，水平转移（Horizontalgenetransfer）至肠道生物或上皮细胞，从而对人体产生不利影响的可能性非常小，“消无基因从植物转移到肠道做生物的证据”，也没有在人类消化系统中细菌转化的报道。转基因食品中的卡那霉素、新霉素和潮霉素对人类不存在抗生素医疗安全性的问题。B.外源基因编码蛋白的毒性与过敏性问题评判转基因食品中外源基因编码蛋白的食用安全性的评定，一是根据外源基因编码蛋白的化学组成判断其毒性，二是采用动物试验或模拟试验的方法评判外源基因编码蛋白的毒性。由于各国政府对转基因食品的审批程序中，对外源基因编码蛋白的毒性评价都有严格的标准，因此通过严格审查后被批准商业化生产的转基因食品中的外源基因编码蛋白对人体均无直接毒性C.外源基因的次生效应及其安全性问题外源基因的次生效应是指由于外源基因的插入而对宿主体内某些基因的表达所产生的影响，现还无法对外源基因的次生效应进行控制和预测。对外源基因的次生效应可能对转基因食品食用安全性产生的影响，一般采用“实质等同性”原则和个案分析程序（case－by－caseprocedure）进行评价分析结论：对动、植物进行负责任的遗传修饰或使用转基因技术在实质上既不新也不会有危害性。传统的遗传育种与转基因技术相比缺乏灵活性和精确性，并因此而缺乏可预期性，其风险绝不比转基因技术低。夸大转基因食品的潜在危险性，缺乏研究依据的推测，可能会使消费者对食品安全产生认识混乱，从而在根本上阻碍转基因技术的发展第六节基因工程的应用一理论应用：分析基因的结构与功能二基因工程实际应用1基因工程与医药卫生目前，基因工程在医药卫生领域的应用非常广泛，主要包括以下两个方面：（1）生产基因工程药品如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等。基因工程药品是制药工业上的重大突破。如1克胰岛素（h-Insulin）要从7.5公斤新鲜猪或牛胰脏组织中提取得到，而目前世界上糖尿病患者有6000万人，每人每年约需1克胰岛素，这样总计需从45亿公斤新鲜胰脏中提取,利用基因工程的"工程菌"生产1克胰岛素，只需20升发酵液。生长激素释放因子“SRIH”的动物激素（一种十四肽，能抑制其他激素的释放和治疗糖尿病等），它原来要从羊的脑下垂体中提取，宰50万头羊也只能提取5mg的产品，而现在只要用10L发酵液就可获得同样的产量。商品名称英文名缩写开发公司胰岛素HumulinNovolinHumalogInsulinlispoinsulinLillyNovoNordiskLilly人生长激素ProtropinHumatropeNutropinAQrhuGHGenentechLillyGenentech干扰素IntronAReferonAAvonixBetaseronActimmuneAlferon-NrhuIFNa2brhuIFNa2arhuIFNrhuIFN1brhuIFN1brhuIFNa3ScheringRocheBiogenChironGenentechInterferonScience白细胞介素2ProleukinrhuIL2Chiron粒细胞集落刺激因子NeupogenrhuG-CSFAmgen粒细胞巨噬细胞集落刺激因子LeukinerhuGM-GSFImmunex红细胞生成素EpogenProcritrhuEPOAmgenOrtho组织溶纤原激活剂ActivaserhuTPAGenentech生长激素SerostinsomatotropinSerono促生长素NutropinSaizenGenotropinNorditropinBio-TropinsomatopinGenentechSeronoPharma/UpjohnNovoNordiskBiotechGeneralKogenateRecombinateFactorVIIIBayerBaxter葡萄脑苷脂酶CerezymeglucocerebrosidaseGenzyml脱氧核糖核酸酶PulmozymedomaseGenentech乙型肝炎疫苗RecombivaxHBEngerixBComraxHepatitisBvaccineMerckSmithKlineMerck甲型肝炎疫苗HavrixHepatitisBvaccineSmithKline体内用单克隆抗体ReoproOrthoOKT-3OncoScintCR/OVOncoScintOC103OncoScintCR103ProstascintMAB,bloodclotsMAB,KidneysupMAB,diaginjectCentocorOrthoBiotechCytogenCytogenCytogenCytogen鼠单克隆抗体PanorexMurineMABGlaxoWelcome药品名缩写开发生产公司批准时间适应症rhuINFa1b(外用）rhuINFa1brhuINFa2a长春生研所上海生研所深圳兴科长春生研所长生药业三生药业1989试1996正1996正1996正1997正1997正病毒性角膜炎HBV,HCVHBV,HCV尖锐湿疣，疱疹等HBV,HCVHBV,HCVrhuIFNa2b新大洲药业里亚哈尔华立达安科华新1997正1996正1997正1997试1997试HBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVHBV,HCVrhuINF上海生研所克隆丽珠生物工程1994试1995试1995试类风湿类风湿类风湿rhuIL2长春生研所长春药业四环制药华新三生药业深圳兴科中华合通金丝利康利制药1997正1997正1997正1997正1997正1997正1995试1995试1995试癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗癌辅助治疗rhuG-CSF九源1997试化疗生白血病rhuGM-CSF特宝1997试化疗生白血病rSK医大实业1996试心梗溶栓rhuEPO华欣永铭维沃1997试1997试再生障碍性贫血再生障碍性贫血bFGF（外用）珠海东大1996试创伤，烧伤国别

医药品市场基因工程药品市场基因工程药品占医药品市场%美国884809.0日本610294.8德国22019.58.9中国1201.21.0美、日、德、中医药品和基因工程药品市场(亿美元)2000年世界上具有10亿～35亿美元年销售额的基因工程药物药物适应症销售额(亿美元)EPO贫血35GH生长障碍30G-CSF中性粒细胞减少症，白血病，艾滋病16.5人胰岛素糖尿病15IFN-α癌症，丙肝10～20我国生物技术药物研究品种统计表分类天然生化药物基因工程药物蛋白质，多肽1666酶及酶抑制剂518动物毒素35单抗

5可溶性受体

4融合蛋白

17治疗基因

5多糖8

其他2

小计34120（2）用于基因诊断与基因治疗基因工程技术还可以直接用于基因的诊断和治疗。目前用基因诊断方法已经能够检测出肠道病毒、单纯疱疹病毒等许多种病毒。基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的，如恶性肿瘤、艾滋病、心血管疾病，以及糖尿病等，也都可以被人类征服3基因工程与农业、食品工业（1）培育高产、优质或具有特殊用途的动植物、微生物新品种（2）培育各种抗逆性的作物新品种（3）为人类开辟新的食物来源21个种植生物技术作物的国家包括11个发展中国家和10个工业化国家。按种植面积的大小顺序排列，它们分别是美国、阿根廷、巴西、加拿大、中国、巴拉圭、印度、南非、乌拉圭、澳大利亚、墨西哥、罗马尼亚、菲律宾、西班牙、哥伦比亚、伊朗、洪都拉斯、葡萄牙、德国、法国和捷克共和国。2005年，美国、阿根廷、巴西、加拿大和中国仍是全球主要的生物技术作物种植国。美国种植的4980万公顷生物