实验设计：卵清蛋白复习课程

鸡蛋清中卵清蛋白的提取(tíqǔ)及其活性测定生命科学学院生化实验操作(cāozuò)大赛第一页，共15页。Contents实验(shíyàn)目的实验(shíyàn)原理实验(shíyàn)方法实验材料及用品实验注意事项实验步骤第二页，共15页。实验(shíyàn)目的1.掌握提取鸡蛋清中卵清蛋白的基本原理和方法。2.掌握紫外分光光度计的使用方法及注意事项。3.掌握用紫外吸收(xīshōu)法测定蛋白质活性，了解其他测定蛋白质活性的方法。第三页，共15页。实验(shíyàn)原理一、沉淀法粗分离蛋白质沉淀法是分离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法等。蛋白质分子表面含有带电荷基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液的稳定性。如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，导致蛋白质分子表面电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。由于各种蛋白质分子表面的极性基团所带电荷数目不同，它们(tāmen)在蛋白质表面上的分布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗分离蛋白质的目的。第四页，共15页。实验(shíyàn)原理鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白（卵清蛋白），球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液(róngyè)中析出，而卵清蛋白则在饱和硫酸铵溶液(róngyè)中才能析出。蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因PH不同而变化，蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀，因此，在其他条件相同时，它的溶解度达到最低点。卵清蛋白的等电点为4.6-4.8，而球蛋白的等电点是5.1。第五页，共15页。蛋清中各种(ɡèzhǒnɡ)蛋白的理化性质名称比例分子量KDa等电点卵清蛋白52%454.5伴清蛋白13%786.6溶菌酶11%284.0-4.3卵类粘蛋白3.5%1410.7卵粘蛋白1.5%18(α)400(β)4.7免疫球蛋白<1.0%不同不同第六页，共15页。实验(shíyàn)原理二、蛋白质的活性测定根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除(xiāochú)其对蛋白质测定的影响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定280nm及260nm的光密度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。第七页，共15页。实验(shíyàn)方法一.蛋白质提取盐析+等电点沉淀法可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、硫酸铵等。其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大，25℃可达4.1mol/L的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他(qítā)盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来分离具有不同等电点蛋白质的方法。其他(qítā)方法（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法：低温有机溶剂沉淀法（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法：透析与超滤、凝胶过滤法（三）根据蛋白质带电性质进行分离：电泳法、离子交换层析法第八页，共15页。实验(shíyàn)方法二.蛋白质活性测定紫外吸收法紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。其他(qítā)方法凯氏定氮法，双缩尿法、Folin－酚试剂法、考马斯亮蓝法第九页，共15页。实验材料(cáiliào)及用品1、材料：新鲜鸡蛋2、试剂(shìjì)：饱和硫酸铵、硫酸铵结晶、生理盐水、1mg/mL标准牛血清白蛋白液3、器具：紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、冰箱、电子天平第十页，共15页。实验(shíyàn)步骤一.卵清蛋白(dànbái)的提取第十一页，共15页。实验(shíyàn)步骤二.卵清蛋白(dànbái)活性测定：（一）紫外吸收法测定卵清蛋白的含量1、标准曲线法（1）标准曲线的绘制(huìzhì)按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制(huìzhì)标准曲线。试管号试剂123456789提取液标准蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.01.0蒸馏水/mL4.03.53.02.52.01.51.003.0蛋白质浓度/mg/mL00.1250.250.3750.500.6250.751.0A280第十二页，共15页。实验(shíyàn)步骤（二）蛋白提取液中蛋白质含量测定1、提取液分别稀释1倍、10倍、20倍后，取待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准(biāozhǔn)曲线上查出经稀释的待测蛋白质的浓度。排除干扰：将待测蛋白质溶液适当稀释，在波长260nm和280nm处分别测出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质浓度。2.计算：蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260（式中A280和A260分别是该溶液在280nm和260nm波长下测得的光吸收值）第十三页，共15页。实验(shíyàn)注意事项1

23蛋白质提取过程中须注意温度(wēndù)的控制，一般在20℃以下进行调节等电点一定要准确(zhǔnquè)，在本实验中，球蛋白和卵