原核生物及真核生物DNA复制

原核生物及真核生物DNA复制内容提要：●DNA的半保留复制●与DNA复制有关的物质●DNA的复制过程（大肠杆菌为例）●DNA复制的其它方式●真核生物中DNA的复制特点1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。（一）DNA的半保留复制（semi-conservativereplication）（二）与DNA复制有关的物质1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP)2、模板：以DNA的两条链为模板链，合成子代DNA3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。5、DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物●反应需要有模板的指导●反应需要有3-OH存在●DNA链的合成方向为53原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生链合成--+主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。修复紫外光引起的DNA损伤DNA复制的主要聚合酶，还具有3’-5‘外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性真核生物中的DNA聚合酶

α

β

γ

δ

ε定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核3‘-5’外切--+++酶活性功能引物合成修复作用线粒体DNA的复制核DNA的复制？

6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3’-OH，另一端是5‘-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来

DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用3‘5‘3‘5‘OHP7、DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase)：拓扑异构酶І：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。

例：大肠杆菌中的ε蛋白拓扑异构酶Π：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。例：大肠杆菌中的DNA旋转酶7、DNA解螺旋酶/解链酶（DNAhelicase)通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。rep蛋白沿3’5’移动，而解螺旋酶I、II、III沿5’

3’移动。9、单链结合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。（三）DNA的复制过程（大肠杆菌为例）双链的解开

RNA引物的合成

DNA链的延伸切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段1、双链的解开

DNA的复制有特定的起始位点，叫做复制原点。ori(或o）、富含A、T的区段。基本概念：从复制原点到终点，组成一个复制单位，叫复制子复制时，解链酶等先将DNA的一段双链解开，形成复制点，这个复制点的形状象一个叉子，故称为复制叉复制叉复制叉复制方向和速度：

单起点、双向等速多起点、双向等速双链解开、复制起始大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合2、RNA引物的合成DnaB蛋白活化引物合成酶，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸，DNA的半不连续复制（semi-discontinuousreplication)DNA复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉移动的方向相反，形成许多不连续的片段，最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。3、DNA链的延伸在DNA复制过程中，前导链能连续合成，而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段，这些不连续的小片段称为冈崎片段。4、切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链双链环状、θ型复制、双向等速（五）真核生物中DNA的复制特点1、真核生物每条染色体上有多个复制起点，多复制子2、真核生物染色体在全部复制完之前,各个起始点不再重新开始DNA复制；而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续开始新的复制(多复制叉)。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。3、真核生物有多种DNA聚合酶。1复制概况a、多个复制子，双向复制b、复制子相对较小(13-900kb),复制速度较慢，大约500~5000bp/min（3000bp/min）冈崎片段100～200bpc、复制终止通过复制叉的相遇而终止（五）真核生物中DNA的复制d.不同的发育时期，真核的复制起始点和复制子的大小会变化。有些复制起点在不同的发育阶段就不再发挥作用。如果蝇受精后复制原点从五千个上升到五万个。发育早期，每个复制子长7.9Kb，成体时，每个复制子长40Kb，很多Ori区不再起作用。真核生物DNA聚合酶及有关蛋白

表真核生物五种DNA聚合酶DNA聚合酶αδεβγ位置核核核核线粒体功能引发合成修复修复复制相对活性80%

10-15%2-15%分子量300K170-230K250K40K180-300K亚基催化核心（180K）两个引物酶(60,50K)一个未知催化核心(125K)一个未知(25K)催化核心一个未知催化催化3’→5’外切-++-+双脱氧T不影响不影响弱抑制抑制蚜黄素抑制抑制抑制不影响不影响

表真核复制需要的酶和蛋白蛋白亚基功能DNA聚合酶α/引发酶4引物合成DNA聚合酶δ2DNA合成PCNA1延伸（滑动钳作用）复制因子RF-C

3延伸（载体作用）复制因子RF-A3单链结合拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ

维持DNA的拓扑结构2

SV40复制

双链环状DNA，具有核小体，全长5243bp2.1复制起始区：具有2个位点位点2包括以下：10bp的前期区，27bp的T抗原结合位点，含GAGGC17bp的A-T丰富区。真核生物DNA复制叉结构示意图3酵母的自主复制区ARS(autonomouslyreplicatingsequence)序列，在酵母染色体复制和质粒复制中均发挥复制起点的功能。A、B起主要作用，C区作用微弱。ARS1分为A,B,C三个功能区：A区：15bp，其中11个保守，称ACS

：5′ATTTAT（T/C）TTTA3′有复制起始子的功能。B区：约80bp,含B1,B2,B3三个区。B3：ABF1（ARS-bindingfactor1）结合区ABF14真核生物DNA末端的复制

(1)端粒DNATTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含G链)

3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(富含C链)

（2）端粒酶：首先在四膜虫中发现端粒酶：特殊的反转录酶，由蛋白质和RNA组成。端粒酶以自身携带的150bp的RNA为模板，在随从链模板DNA的3′OH末端延长DNA，再以这种延长的DNA为模板，继续合成随从链。Greider和Blackburn(1989)，1）端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的RNA与凸出的3’引物配对；2）以RNA为模板，在3’端上从头合成六个Nt；3）合成一个重