同步荧光光谱法

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同步荧光光谱法(SynchronousFluorescence)1精选ppt一、同步荧光分析原理同步荧光技术是同时扫描激发单色器和发射单色器波长的情况下来测绘荧光光谱图。由测得的荧光强度信号对发射或激发波长作图，称为同步荧光光谱。2精选pptSYNCHR.EX.SCANNOR.EM.SCANNOR.EX.SANNOFLUORESCATTERLINE/nmnm3精选ppt1、固定波长的同步荧光光谱(Constantwavelengthsynchronousluminescence,CWSL)(1)在同步扫描中，使激发波长与发射波长保持固定的波长间距，即常数。将同步荧光信号对发射或激发波长测绘荧光光谱图，则为固定波长的同步荧光光谱。4精选ppt（2）定量依据激发光谱强度分布发射光谱强度分布（2）同步扫描激发波长时的发射光谱（3）同步扫描发射波长时的激发光谱（2）（3）（1）5精选ppt（3）同步荧光光谱的特点

a.同步光谱与激发光谱及发射光谱都有关系。它同时利用了化合物的吸收特性和发射特性，因而使光谱分析的选择性得到改善。b.有利于多组分混合物的分析。同步荧光光谱可以把强带增强而减小弱带的干扰。c.可消除Raylei干扰，使Roman强度降低且拉宽。6精选ppt（4）的选择只有当恰好相当于某吸收带和其发射带之间波长间距时，才能观察到同步信号。

=斯托克斯位移（发射波长与激发波长之差)

与狭缝宽度d的大致原则：只受瑞利：当同时受瑞利和拉曼散射干扰

—测定波—拉曼散射光的波长7精选ppt

2、固定能量的同步荧光光谱constantenergysynchronousluminescence(CESL)固定能量的同步荧光光谱，是指在同步扫描过程中，使激发波长与发射波长之间保持着固定的能量差。RayRoman8精选ppt常数表示波数差与

成正比拉曼光与入射光之间的频率差称为拉曼位移9精选ppt当或时固定能量的同步荧光光谱可消除瑞利散射和拉曼散射，而固定波长的同步荧光光谱只能消除瑞利散射，使拉曼散射拉宽。二者皆能降低光谱的复杂性，提高选择性。abcF10精选ppt二、同步扫描仪器设备1、固定波长的荧光光谱的获得

对于以光栅为单色器的荧光分光光度计，只要分别设置激发和发射两个单色器所需的起始波长，并使它们以同样的速率进行扫描，便可进行固定波长同步扫描荧光测定。2、固定能量同步扫描是非线性的可变角同步扫描，需通过微处理机控制而加以实现。11精选ppt三、应用1、在多环芳烃分析中的应用减小光谱的重叠（1）固定波长同步荧光法用于煤中多环芳烃的测定

苊(Ace)，2,3-苯并芴(BF)，蒽(Ant)，苯并芘(Bap)，苝(Per)用标准加入法计算2,3-苯并芴（2）低温固定能量同步荧光法12精选ppt煤液化样品中各种有机物的同步荧光光谱煤液化样品的固定波长同步荧光光谱13精选ppt2、同步荧光法在医药检验方面的应用（1）违禁药品中苯丙胺和吗啡加奎宁麦角酸二乙酰胺的测定（2）二苯并呋喃中痕量咔唑和蒽14精选ppt（3）酪氨酸和色氨酸严重重叠CWSL的同步荧光色氨酸的光谱特征的同步荧光酪氨酸的光谱特征

or70nm的二阶导数同步荧光可对Trp和Tyr分辨同步荧光可对Trp、Tyr、Phe分辨15精选ppt（4）维生素B1、B2混合物中维生素B1的测定用铁氰化钾将B1氧化硫胺荧（5）尿液中肾上腺素和去甲肾上腺素的同时测定16精选ppt总结：荧光测量稳态测量时间依赖的测量17精选ppt

4-4时间分辨荧光法（Time–DomainFluorometry）(Time–ResolvedFluorometry）18精选ppt一、时间分辨法原理用短脉冲光源激发的荧光体群体，随时间而衰变，其衰变率为受激分子的寿命19精选ppt用F(t)或N(t)对t作图1/eF(t)orN(t)tort荧光寿命为荧光强度衰变到初始值的1/e所需要的时间。20精选ppt特点：采用适当的激发光源和检测体系，可以得到在固定波长的荧光强度—时间曲线和在固定时间的荧光发射光谱。（1）可以对混合物中光谱重叠但寿命差异的组分进行分辨；（2）可消除杂质与背景荧光；（3）可测量溶剂松弛的时间。21精选ppt二、时间分辨仪器设备激发光源、时间延迟设备、激发单色器、样品池、荧光单色器及设有门控的检测器1、激发光源短脉冲的激发光源闪光灯氮闪光灯几条高强度射线氢闪光灯氘闪光灯连续线强度低22精选ppt激光器氮分子激光器337.1nm氩离子激光器351nm染料激光器所需波长光子通量大、峰值功率高、单色性好、发生的光脉冲持续时间短，激光荧光法具有较高的灵敏度和选择性。23精选ppt2、检测器如光电倍增管带有门控的24精选ppt三、时间分辨荧光的分析应用荧光体的荧光寿命的测定时间分辨荧光光谱荧光发射的衰变曲线25精选ppt1、荧光体混合物中两组分的同时测定例用8-羟基喹啉-5-磺酸(R)同时测定Al和Ga15.20ml样品+1ml0.045%R+

2ml20%NH4Ac(or20%NH4Cl)调pH至4.5，稀释至25ml氘灯激发测定荧光强度—时间曲线26精选ppt（1）测定荧光衰变曲线

Al–RGa–R可利用上述两个荧光化合物的差异对它们进行同时测定。27精选ppt（2）计算含量铝配合物和镓配合物的衰变曲线铝配合物和镓配合物的对数衰变曲线比较（1）和（4）的荧光强度得Al的含量比较（2）和（5）的荧光强度得Ga的含量28精选ppt2、芳基的测定例用ps双色荧光法对卤素芳族化合物光离解作用所产生的芳基进行检测（1）用25ps，266nm激光脉冲使1-(氯甲基)萘，1-(溴甲基)萘，2-(氯甲基)萘，2-(溴甲基)萘等化合物离解产生芳基。（2）在延迟60ps后，用25ps，355nm激光脉冲激发芳基的荧光，产生橙色荧光，600nm，

10ns，如图所示。29精选ppt（a）和（c）一致，是1-萘甲基所致（b）和（d）一致，是2-萘甲基所致30精选ppt3、溶剂松弛时间的分辨测量许多分子在基态时具有从中等到大的偶极矩，在激发态时偶极矩发生变化，从而引起周围溶剂分子中电子的重排和溶剂分子围绕激发态溶质分子偶极的重新定向，这个过程称为溶剂松弛，这个过程所需的时间叫溶剂松弛时间。在松弛过程中，能量有所降低，因而发射向长波位移。时间分辨荧光法可记录不同时间的发射光谱，因而可测量松弛时间。31精选ppt例14-氨基苯邻二酰亚胺（4-AP）的丙醇溶液在不同的温度下的时间分辨的荧光光谱图室温下，-132℃荧光光谱与时间t无关在-77K，荧光光谱与t有关在4ns，溶剂还未重新取向在23ns，溶剂取向已完成32精选ppt例22-对-苯甲基萘-6-磺酸盐染料溶剂甘油温度A图4℃1.8ns,8.0ns,12.2nsB图57℃1.8ns,8.0ns,12.2ns33精选ppt

4-5相分辨荧光法（Frequency-DomainFluorometry/Phase-ModulationFluorometry)34精选ppt

Theobjectiveofbothtime-domainandfrequency-domainfluorometryistorecovertheparameterdescribingthetime-resolveddecay.35精选ppt

一、相分辨法原理1、单指数衰变的荧光当样品被激发光激发而发射荧光时，如激发光的光强度被正弦调制，其角调制频率为，则发射光也同样被调制。由于吸收和发射之间的时间延迟，调制的发射光比起激发光在相上延迟了角。但发射光的调制比起激发光的调制小一些，也即是发射光的改变部分的相对幅度比起激发光要小些。36精选ppt—去调制因素激发光和发射光的光强正弦调制37精选ppt在测量相角（）或去调制因素（m）之后，可以计算该荧光体的荧光寿命。相分辨法是荧光寿命的测量方法之一。38精选pptm10MHz30MHz10MHz30MHz、m与的关系如下：39精选pptm随的增大而下降m=1发射光与激发光的调制幅度相同m越小发射光被调制的幅度越小随的增大而增大，寿命越长，延迟的越大。当荧光分子的寿命越长，发射相对于激发延迟的时间就越长。40精选ppt2、多指数衰变的荧光如果样品中含有两种荧光体，或者单一荧光体而进行进一步激发态反应，则荧光是双指数衰变。如果进行多步反应，则荧光是多指数衰变。

由和m所计算的是表观荧光寿命。如采用相灵敏检测器的相荧光计，—激发光的调制度（或振幅）—去调制因素单一荧光体41精选ppt对于相灵敏检测器—稳态荧光光谱—检测角度在不同相角测定荧光光谱，称为相灵敏荧光光谱，即为在固定时间的荧光光谱。42精选ppt若样品溶液中含有A、B两种荧光体，它们的荧光寿命分别为A和B。如，则该组分的发射被抑制43精选ppt

要得到混合物中组分A的稳态光谱，须把检测器相角调节至和组分B正交。这是很费时的，最好得到另外的信息:先得到任何一组分的稳态荧光光谱，然后调节检测器相角至该荧光光谱和混合物的荧光光谱重叠，则可得到与另一组分正交的相角。使用任何一组分的纯溶液以确定检测器的相角。44精选ppt

当用相灵敏检测器在各种不同检测器相角测绘样品的相灵敏荧光光谱。对于单一化合物，其荧光峰波长基本上保持不变而与检测器相角无关。如果不是均匀的发射，则荧光峰随着检测器相角而改变，在不同检测器相角得到的相灵敏光谱是鉴别不均匀发射的有力工具。45精选ppt3、相分辨荧光法与时间分辨荧光法比较用于荧光参数测量的仪器可分为两大类稳态测量steady-state时间依赖的测量timedependent相分辨荧光法与时间分辨荧光法本质上都是时间依赖或时间分辨的测量。46精选ppt（1）仪器时间分辨荧光法的局限性a.仪器常常非常复杂，常局限于有关专家使用；b.灵敏度常低于稳态测量。相分辨法的优点a.仪器类似于稳态测量的仪器，使用简单；b.灵敏度高；c.数据处理快。47精选ppt（2）测量参数

a.F(t)-t曲线时间分辨b.m..相分辨48精选ppt（3）从实验的观点，相分辨有下列优点：在时间分辨的方法中，测量的延迟信号的去卷积对于计算测量系统的限定时间的响应是必要的，而相分辨法不受此限制；相分辨法允许不同方向的直接测量。如在各向异性的延迟测量中，平行和垂直偏振成份的和m的测定；相分辨法为基于荧光寿命差异的光谱成份之直接分辨提供了一种简单、有效的方法。49精选ppt二、相分辨仪器设备

与一般荧光分光光度计大致相似，但增加了光调制器及测量相角和去调制因素的设备。50精选ppt1、光调制器（1）Kerr调制器不能透射UV（2）Pockels调制器需要较低电压，能透过紫外光，可在连续可变的频率下操作，但要求高度准直的光，适用于以激光器为光源的相分辨荧光计。（3）Dedye-Sears超声波调制器能透过紫外光，对光准直的要求不太高，可用于各种光源。

51精选ppt2、检测系统

由单色器，光电倍增管，锁定放大器组成。锁定放大器只检测与参比信号相同频率且具有一定位相关系的信号成份，从而大大提高了信噪比。52精选ppt三、相分辨荧光的分析应用1、荧光体两组分混和物中个别组分的荧光光谱的直接记录和荧光寿命的测定2－对－甲苯氨基－6－萘磺酸（TNS）和6－丙酰－2－（二甲基氨基）萘（PRODAN）混合物在乙醇溶液中稳态荧光光谱相灵敏荧光光谱调整DPRODAN被抑制TNS的荧光光谱，=3.6nsTNS被抑制PRODAN的荧光光谱，=11.6ns当当53精选pptTNS和PRODAN的稳态荧光光谱54精选pptTNS-PRODAN混合物的相灵敏荧光光谱55精选ppt从混合物直接记录下的TNS和PRODAN的荧光光谱56精选ppt2、溶剂松弛的相分辨在溶剂松弛过程中，一般情况能量有些降低，松弛态发射光谱红移。但降低温度会使光谱蓝移。

N-乙酰基-L-色氨酸胺（NATA）solvent:丙稀甘油（1）不同T下的荧光光谱（2）相灵敏荧光光谱在固定D即t下所得到的荧光光谱57精选pptNATA在丙烯甘油中的荧光光谱58精选pptNATA在丙烯甘油中的相灵敏荧光光谱59精选ppt

4-6荧光动力学分析法（FluorescentKineticAnalysis)60精选ppt一、动力学法原理由于化学反应的速率与反应物的浓度有关，在某些情况下与催化剂的浓度有关，因此可以通过测量反应的速率以确定待侧物的含量。光度法电位法荧光法测速率以荧光法监测反应速率，这种方法则称为荧光动力学分析法。61精选pptaA+bBnC+mD=k[A]a[B]ba=1b=1=k[A][B]62精选ppt1、荧光动力学分析的特点（1）优点a.只观测反应初期的速率，可用于某些反应速率慢、平衡常数小或可能发生副反应的化学反应；b.动力学分析是一种相对测量,动力学分析法有可能比平衡法具有更好的选择性;c.灵敏度高、操作较快、易于实现自动化。63精选ppt（2）局限性a.所使用反应的半衰期应在5ms到1h之间;b.必须严格地控制温度、pH、试剂浓度、离子强度等反应条件和其它可能影响反应速率的因素；c.动力学测量的信噪比在本质上要比平衡法小,只有反应的一小部分用于测定；d.试样基质的干扰问题仍可能发生,如降低有效浓度,与分析物结合。64精选ppt2、荧光动力学分析法非催化法催化法酶催化法（1）非催化法通过测量非催化反应的速率而测定某种反应物的浓度。65精选ppt（2）催化法以催化反应为基础来测定物质含量的方法。催化反应速率与催化剂的浓度成正比，因此可测定催化剂的浓度，也可用于测定某些对催化反应起助催作用或抑制作用的物质。例:8-羟基喹啉-5-磺酸+过硫酸铵Ag+66精选ppt(3)酶催化法基于酶催化的反应，这类反应的突出优点是它的特效性和高灵敏度,不仅可用来测定酶的活性,也可用来测定底物、活化剂和抑制剂.67精选ppt3、反应速率的荧光法监测假如化学反应的某种反应物或产物是荧光物质,便可利用荧光法来监测反应的速率。记F-t曲线可通过正切法(斜率法)或固定时间法或固定荧光强度法获得校正曲线。68精选ppt（1）正切法从F-t曲线求反应速率然后用作图c69精选ppt(2)固定时间法使反应准确地进行到某一固定的时刻t，立即测定F,得到F-c曲线cF70精选ppt(3)固定荧光强度法测量荧光强度的变化值达到某一规定值所需的时间t，得到1/t-c曲线。c1/t71精选ppt荧光动力学分析法的优点：灵敏度高、选择性好、线性范围宽缺点：a