食品微生物检验讲义

2010年颁布的十项标准1食品微生物学检验总则2食品微生物学检验菌落总数测定3食品微生物学检验大肠菌群计数4食品微生物学检验沙门氏菌检验5食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验6食品微生物学检验霉菌和酵母计数7食品微生物学检验乳与乳制品检验8食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验9食品微生物学检验乳酸菌检验10食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验

已于2010年6月1日实施2010年颁布的十项标准已于2010年6月1日实施GB4789.1—2010GB4789.2—2010GB4789.3—2010GB4789.4—2010GB4789.10—2010GB4789.15—2010GB4789.18—2010GB4789.30—2010GB4789.35—2010GB4789.40—20102食品微生物学检验

GB2010修改内容一、菌落总数测定•删除了PetrifilmTM测试片法•在“培养基和试剂”中增加了无菌生理盐水的配制方法二、大肠菌群计数•删除了PetrifilmTM测试片法•“第二法大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15CFU～150CFU”三、沙门氏菌检验•删除了科玛嘉、API和VITEK等商品名•个别培养基配方有变化—HE琼脂、三糖铁琼脂3食品微生物学检验

GB2010修改内容四、金黄色葡萄球菌检验•个别培养基配方有变化—7.5%氯化钠肉汤五、霉菌和酵母计数•删除了高盐察氏培养基，保留孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂•孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂的配方有所调整六、单核细胞增生李斯特氏菌检验•删除了VIDAS和BAX两种快速检测方法•新增含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤和含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂•显色培养基删除了商品名“科玛嘉”4食品微生物学检验

GB2010修改内容七、乳酸菌检验•修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。

八、阪崎肠杆菌检验•显色培养基不再专门指定使用DFI5食品微生物学检验

GB2010修改内容1、新增品种•含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤•含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂•P-109莫匹罗星锂盐2、改变配方的品种•HE琼脂•三糖铁琼脂•7.5%氯化钠肉汤•孟加拉红琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂3、删除了科玛嘉、API、VITEK等商品名4、删除了Petrifilm测试片法5、删除了VIDAS、BAX等快速检测方法GB2010修改内容小结6食品微生物学检验

总则1检验人员2仪器设备3检验培养基、试剂4采样5样品的接受和预处理6检验质量7参考菌株和及其保存GB4789.1-2010食品微生物检验的质量控制7食品微生物学检验

总则岗前培训、继续教育、参加水平测试和盲样测试、定期考核GB4789.1-20101检验人员8食品微生物学检验

总则高压灭菌锅灭菌物品不宜过多压力降至零再开锅干热灭菌锅

器皿和内层底板不能直接接触压力降至零再

开锅装有纸包装的物品灭菌温度不能超过160℃培养箱每天记录温度和湿度随手关门维持恒温培养物不宜与培养箱最底层直接接触GB4789.1-20102仪器设备显微镜注意防尘、清洁使用油镜后擦拭其他不同物品采用正确的灭菌方式已灭菌和为未灭菌用品应分开，且有明显标识9食品微生物学检验

总则培养基的制备和质量控制按照GB/T4789.28执行

培养基必须由专业厂家、质量必须符合有关质量标准干粉培养基防止潮解、结块GB4789.1-20103培养基和试剂培养基配置注意要点培养基配制过程主要为配制、溶解、矫正PH值、过滤澄清、分装及高压培养基的配制必须在玻璃容器、搪瓷缸中进行，不能用铜铁器皿分装培养基一般不超过容器的2/3；分装为试管容量1/5，斜面长度约为试管的2/3；新制成的平皿放置在37℃待平板表面干燥后再使用；10食品微生物学检验

总则冷冻食品应保持在冷冻状态直到检验；化冻时必须小心放置于细菌生长温度之下以免细菌数量增加冷藏样品应尽快放在冷藏温度下解冻，亦可放在适宜温度下（37℃）下短时间（15min）使其解冻；GB4789.1-20104采样5样品的接受和预处理所用接触样品的用具经过灭菌取样要均匀、特殊样品要控制温度11食品微生物学检验

总则GB4789.1-20106检验质量定量检验时一般固态样品宜用重量法，液体样品宜用体积法；对于黏性液体（如酸奶）如用体积会粘附一定量的样品在吸管上，此类样品最好用重量法

如检样需用无菌生理盐水稀释，最好用均质器

8000-10000r/min转速1min，制成均匀悬液；

微生物培养选择正确的培养温度和时间12食品微生物学检验

总则GB4789.1-20107参考菌株实验室要做好参考菌株的登记、验证记录、传代记录、销毁记录菌株由专人保管，做好菌株的进出登记13食品微生物学检验

总则对于微生物检验报告对照各类标准对食品卫生的微生物学质量进行全面准确的评价并作出合理的解释编制微生物学检验报告考虑引入不确定度概念；

GB4789.1-20108检验结果及结果的质量控制微生物测试的主要影响因素

取样样品量样品种类

目标微生物在样品中的分布样品中含有的微生物数量水平样品稳定性倍比稀释读数141菌落的定义：将细菌划线接种在固体培养基上经48∽72小时培养，长出肉眼可见有单一细菌生长繁殖而成的细菌集团。一概念2菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1ml（g）检样中形成的微生物菌落的总数。GB4789.2-2010食品微生物学检验

菌落总数测定15食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010二.1菌落总数的检验程序卫生学意义：反应了食品在加工、储存、运输过程中的污染程度。16食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010二.2菌落总数的检验程序1配制培养基3系列稀释6孵育2样品准备4平板接种5倾注放置平板8报告7阅读17食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010三系列稀释10-11ml10-410-310-210-510-61ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml9ml18食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

四菌落计数19食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010五菌落总数计算公式若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式计算。

式中：N——样品中菌落数；∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d——稀释因子（第一稀释度）。

20食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010六菌落总数的报告菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。21食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010七菌落计数实例例次

稀释液及菌落数菌落总数（个/g或个ml）报告方式（个/g或ml）10-1

10-2

10-3

1多不可计16420164001.6×104

2多不可计29562312723.1×104

多不可计271603多不可计多不可计3133130003.1×105

4271152702.7×102

5000<10

<10

6多不可计30512305003.0×104

22食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010八注意事项操作要在无菌的状态下进行。操作时间越短越好。样品不同选择的稀释倍数不同。培养基冷却温度不宜过高或过低。23食品微生物学检验

大肠菌群计数1大肠菌群（coliforms）定义：大肠菌群系指一群在一定条件下能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以次作为粪便指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。GB4789.3-2010一概念2MPN(mostprobablenumber)定义：最大或然数计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群,并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。基于泊松分布的一种间接计数方法。24食品微生物学检验

大肠菌群计数GB4789.3-2010二培养基和试剂

月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LaurylSulfateTryptose，LST）煌绿乳糖胆盐肉汤（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉汤结晶紫中性红胆盐琼脂（VioletRedBileAgar，VRBA）磷酸盐缓冲液无菌生理盐水无菌1mol/LNaOH：见附录A中A.6。无菌1mol/LHCl：见附录A中A.7。25食品微生物学检验

大肠菌群计数GB4789.3-2010三大肠菌群MPN计数法的检验程序26食品微生物学检验

大肠菌群计数GB4789.3-2010四大肠菌群平板计数法的检验程序27食品微生物学检验

大肠菌群计数GB4789.3-2010五大肠菌群平板计数的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10/g（mL）=6.0×10CFU/g（mL）。28食品微生物学检验

菌落总数测定GB4789.2-2010六注意事项

LST初管和BGLG复发酵管在灭菌以后要检查小导管内有无气泡,如果有气泡就不能再用了。计算产气管的数量时以BGLG发酵管产气管的数量为准。29食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌检验1金黄色葡萄球菌：革兰染色阳性球菌，呈圆球状，形似葡萄串状排列需氧或兼性厌氧，在肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好耐盐性很强可产生金黄色色素血琼脂上产生透明溶血环，且菌落较大能产生血浆凝固酶GB4789.10-2010一.1概念30食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌检验2金黄色葡萄球菌的致病物质：血浆凝固酶葡萄球菌溶血素肠毒素毒性休克综合毒素-1和SPAGB4789.10-2010一.2概念3金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病：食物中毒毒性休克综合征及假膜性肠炎31食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌检验4易受金黄色葡萄球菌污染的食物：火腿、肉馅及熟肉制品鱼贝类、蛤类乳制品及含奶的糕点：奶油蛋糕、牛角酥等果汁生菜沙拉GB4789.10-2010一.3概念32食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌检验GB4789.10-2010二主要培养基和试剂

10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤7.5%氯化钠肉汤血琼脂平板Baird-Parker琼脂平板脑心浸出液肉汤(BHI)兔血浆营养琼脂小斜面革兰氏染色液33食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌

GB4789.10-2010三金黄色葡萄球菌定性检验程序34食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌

GB4789.10-2010四金黄色葡萄球菌定性鉴定要点1Baird-Parker平板和血平板生长的典型菌落特征2革兰氏染色镜检典型形态3血浆凝固酶实验4葡萄球菌肠毒素的检验35食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌GB4789.10-20104.1Baird-Parker平板和血平板Baird-Parker平板

菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。血平板

菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。36食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌GB4789.10-20104.2.1革兰氏染色原理G+细胞壁结构G-细胞壁结构37食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌GB4789.10-20104.2.2金葡革兰氏染色金黄色葡萄球菌染色镜检革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5μm～1μm。38食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌GB4789.10-20104.3血浆凝固酶实验原理

致病性金黄色葡萄球菌产生一种游离的凝固酶，可使人或兔血浆中的协同因子激活变为凝血酶样物质后，使液态的纤维蛋白变为固态的纤维蛋白，从而使血浆凝固。操作要点

该实验必须用大量的菌和小量的血浆进行实验，血浆用量不要多，千万不要在血浆中做菌悬液最好用BHI增菌液，增菌效果好每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。-检查凝固形成时，不要振动试管，以免造成假阴性结果39食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌GB4789.10-20104.4葡萄球菌肠毒素实验A、B、C、D、E型金黄色葡萄球菌肠毒素分型ELISA检测试剂盒检测40食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌

GB4789.10-2010五结果判定与报告结果判定

符合血平皿及B-P平皿菌落特征、革兰氏染色特征和血浆凝固酶全部三项，可判定为金黄色葡萄球菌结果报告

在25g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。41食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌

GB4789.10-2010六金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数

适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数42食品微生物学检验

金黄色葡萄球菌

GB4789.10-2010七金黄色葡萄球菌MPN计数

适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。43食品微生物学检验

沙门氏菌检验1沙门氏菌：无芽孢革兰氏阴性杆菌营养要求不高，对胆盐耐受耐盐性很强大多数不发酵乳糖，不产生靛基质，不分解尿素大多数菌株产生H2S，发酵葡萄糖产酸产气抗原结构主要为O抗原和H抗原，及与毒力有关的Vi抗原O抗原即菌体抗原，主要为脂多糖H抗原即鞭毛抗原，化学成分为蛋白质，性质不稳定Vi抗原为不耐热的酸性多糖聚合体，加热60℃30min可破坏该抗原具有抗吞噬及阻止O抗原抗体凝集作用GB4789.4-2010一.1概念442沙门氏菌的致病物质：侵袭力:菌毛抗吞噬；Vi抗原内毒素:机体发热、白细胞变化微循环障碍肠毒素:腹泻一.2概念3沙门氏菌引起的食源性疾病：肠热症：慢性发热症状食物中毒：表现为恶心、呕吐、腹疼、腹泻慢性肠炎：表现为发热，粘液便败血症：表现为高热、寒战厌食和贫血症状食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010454

易受沙门氏菌污染的食物：生家禽肉制品及熟肉制品鱼贝类、蛤类乳制品水果蔬菜一.3概念食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-201046二主要培养基和试剂食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010

缓冲蛋白胨水（BPW）

四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）

亚硫酸铋琼脂（BS）木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD）沙门氏菌显色培养

三糖铁琼脂（TSI）

蛋白胨水、靛基质试剂尿素琼脂（PH7.2）

氰化钾培养基（KCN）赖氨酸脱羧酶试验培养基沙门氏菌O和H诊断血清47三.1沙门氏菌检验程序食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-201048三.2沙门氏菌检验程序食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-201049四沙门氏菌鉴定要点1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征2生化试验3血清学鉴定食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010504.1.1BS琼脂BS琼脂

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010514.1.2沙门显色培养基沙门显色培养基

紫色菌落食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010524.2.1生化鉴定食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-20101初步筛选534.2.1生化鉴定食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-20102进一步生化A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按下表可判定为沙门氏菌如有2项异常为非沙门氏菌。

A2：补做甘露醇和山梨醇试验沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。A3：补做ONPGONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。544.2.2TSI培养基试验原理

乳糖和蔗糖与葡糖糖比为10：1酚红指示剂，酸性为黄色，碱性为红色分解葡糖糖不分解乳糖和蔗糖，斜面为碱性，底层为酸性分解葡糖糖且分解乳糖和蔗糖，斜面和底层均为酸性细菌在酸性环境利用S产生黑色硫化亚铁沉淀结果判读

斜面碱性（红色）/底层碱性（红色）：产碱性，不发酵碳水化合物；斜面碱性（红色）/底层酸性（黄色）：发酵葡萄糖，不发酵乳糖和蔗糖斜面碱性（红色）/底层酸性（黑色）：不发酵乳糖，产H2S斜面酸性（黄色）/底层酸性（黄色）：发酵乳糖大肠菌群特征食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010554.2.3氨基酸脱羧酶试验原理

细菌产生分解鸟氨酸（或赖氨酸、精氨酸）的氨基酸脱羧酶，生成碱性的胺培养初期，葡糖糖发酵产生少量酸培养基变为黄色若氨基酸脱羧，形成碱性胺，培养基又变为原来的紫色结果判定

对照管：黄色阳性管:紫色阴性管：黄色空白管：紫色食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010阴性空白管对照管阳性564.2.3氨基酸脱羧酶试验操作及鉴定要点

接种前必须把所有管做好记号必须做对照管（不含检定氨基酸的培养基），对照管一直为黄色，如果为阳性（紫色），试验无效不能做出判定试验管和对照管必须用无菌石蜡封口，厌氧培养，防止假阴性结果至少培养18-24小时才能判断结果，过早判断可能造成假阴性该试验在孵育期间静置后可呈现两种不同颜色，判定结果前要轻轻摇动试管食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010574.3血清学鉴定依据抗原抗体特异性结合，通过凝集反应来判断食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-2010血清学鉴定操作要点与抗血清补凝集时，在玻璃试管内内将菌液制成菌悬液，煮沸15-30min,冷却后再做凝集试因为Vi抗原能阻断O凝集，而煮沸处理能破坏菌体表面的Vi抗原58五结果判定与报告结果报告

综合生化试验和血清学鉴定的结果报告报告在25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。食品微生物学检验

沙门氏菌检验GB4789.4-201059食品微生物学检验

霉菌和酵母计数霉菌和酵母真菌酵母为单细胞真菌霉菌为多细胞真菌，有菌丝和孢子GB4789.15-2010一.概念60二主要培养基和试剂食品微生物学检验

霉菌和酵母计数GB4789.15-2010

马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基孟加拉红培养基61三

霉菌和酵母计数的检验程序食品微生物学检验

霉菌和酵母计数GB4789.15-201062食品微生物学检验

霉菌和酵母计数GB4789.15-2010肉眼观察，必要时用放大镜，记录稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。

选取菌落数在10CFU～150CFU之间。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的课记录为多不可计。四菌落计数63食品微生物学检验

霉菌和酵母计数GB4789.15-2010五菌落总数的报告菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母。64食品微生物学检验

乳与乳制品检验样品应具有代表性采样过程采用无菌操作，采样方法和采样数量根据具体产品的特点和产品标准要求执行样品在保存和运输过程中，采取必要的措施防止样品中原有微生物数量变化，保持样品原有状态GB4789.18-2010一.采样方案65食品微生物学检验

乳与乳制品检验GB4789.18-2010二.检样的处理乳及液态乳制品的处理无菌操作，75%酒精棉球消毒盒盖或袋口体积稀释法，取25ml检样放入225ml灭菌生理盐水半固态及固态乳制品的处理重量稀释法，取25g检样放入225ml预热到45℃灭菌生理盐水66食品微生物学检验

乳与乳制品检验GB4789.18-2010三.检验方法参照各种微生物检