高效液相色谱法维护

高效液相色谱操作及维护高效液相色谱仪(HPLC)目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、岛津公司等，国内有大连依利特公司、上海分析仪器厂、北京分析仪器厂等。

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日本岛津Waters高效液相色谱仪

日本岛津高效液相色谱仪开机前的准备工作1、将试验要求的流动相配制好。2、流动相要过滤脱气。3、装好试验要求的色谱柱。流动相:溶剂的沸点和粘度低沸点的溶剂通常其粘度低，但它在泵中易形成气泡而影响泵的精度，还因易蒸发而改变混合流动相的组成。高沸点的溶剂通常会因其粘度而降低柱效。对于有缔合倾向的溶剂（特别是水和乙腈，水和甲醇），它们的粘度随组成的变化是不规律的。例如：水：乙腈（35：65），水：甲醇（50：50）时，其粘度最大。开机前的准备工作流动相要过滤:以除去其中的微粒物质。滤膜：(0.45μm)①脂溶性滤膜（有机滤膜），②水溶性滤膜，③通用型滤膜(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)。HPLC级溶剂（色谱纯）使用时不必再过滤了，因生产工艺中已用0.2μm的过滤装置过滤过了。开机前的准备工作脱气：为了防止在泵中、流路中、及检测器中产生气泡，而影响泵不稳定性（使流速不稳）和增加检测器的噪声，流动相必须脱气。混合流动相比纯溶剂更能溶解空气，极易饱和形成气泡，有水的流动相特别明显。脱气方法：①氦气脱气，②真空脱气（用真空过滤流动相脱气，在线脱气机脱气），③超声脱气，④加热脱气。以不使流动相中混合物浓度发生变化为原则。贮液瓶贮液瓶是用来装流动相的容器，里面还含有一个不锈钢烧结过滤器。泵进液管路一般用聚四氟乙烯管。不锈钢烧结过滤器套在进液管路上，有两个功能：一是防止微粒物质进入泵，二是作为进液管路的重物，所以常被称为“沉子”。贮液瓶如被污染了可能会阻塞过滤片，影响泵的性能(使流速不稳)，出杂峰或产生噪声。反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为极性强的水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

反相色谱柱以硅胶为基质的液相色谱填料多为反相柱，正相柱不太多。①常用硅胶健合C18、C8等填料柱。②对硅胶做碱性脱活的反相柱（在高温下硅烷化封闭硅羟基），（这类填料对碱性物质如对胺有很小的吸附性）。③高稳定性反相柱（这种柱可以经过酸和碱的作用）。硅胶为基质的一些缺点：①在碱性介质中（pH＞8）不稳定。②在孔隙中大分子扩散困难，降低柱效。③硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。反相色谱法中应注意：尽量不使用乙酸盐缓冲溶液，因为它和带阳离子的溶质会形成非极性络合物。不使用卤化物，以免腐蚀液相色谱仪。对水的质量要求很高。一般应用新鲜的高纯水。乐百氏也可以用。每次试验用水都应更换新鲜的水，因水易变质，不能长时间不更换。正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。常用的有硅胶柱。

反相HPLC

极性:固定相<流动相固定相-极性弱流动相(甲醇,乙腈等)-极性强极性大物质先出峰正相HPLC

极性:固定相>流动相固定相-极性强流动相(己烷,庚烷)-极性弱极性小物质先出峰正相色谱20%反相色谱80%正相色谱20%反相色谱80%主流固定相与流动相物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径键合类型碳覆盖率封端化学性质固定相-填充材料物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度固定相-填充材料键合类型碳覆盖率封端化学性质固定相-填充材料固定相-填充材料色谱柱常用的pH值:随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH1.5~10范围操作。色谱柱色谱柱开机顺序：1、打开主机，检测器，色谱工作站等电源开关。2、将配制好的流动相放入流动相通道内，旋开排液（或灌液）旋钮，将流动相管路中存放的老溶剂替换掉。3、关上排液（或灌液）旋钮，逐渐将流速升高。平衡至少30分钟后准备进样。替换掉管路中存放的老溶剂替换掉管路中存放的老溶剂进样前准备——样品过滤一次性注射器针式（头）过滤器样品瓶

六通阀/定量环进样器仪器：手动进样器-六通阀/定量环

手动进样器工作原理

装填状态样品注入手动进样器

液相色谱中，用定量环进样时，注射器的抽取量不得少于环容积的5倍。

仪器：检测器UV/Vis双灯，全波长检测ＤＡＤ检测器流路仪器：检测器-紫外反射镜1＃反射镜2＃氘灯光源透镜滤光片（钬玻璃/遮光）入射狭缝光栅分光器参比光电二极管数模转换板样品光电二极管数模转换板流通池紫外检测器工作原理Agilent1100可变波长紫外检测器(G1314A)荧光检测器蒸发光检测器质谱检测器基本概念和术语

色谱图(chromatogram)——样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elutionprofile)。基线(baseline)——经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)——基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移基本概念和术语色谱峰(peak)——组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(leadingpeak)和拖尾峰(tailingpeak)。前者少见。峰底—基线上峰的起点至终点的距离。峰高(peakheight，h)—峰的最高点至峰底的距离。

基本概念和术语峰宽（peakwidth，W)—峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W＝4σ半峰宽（peakwidthathalf-height，W1/2)—峰高一半处的峰宽。W1/2＝2.355σ峰面积(peakarea，A)—峰与峰底所包围的面积。保留时间(retentiontime，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。基本概念和术语理论塔板数(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。分离度(resolution，R)——相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。《中国药典》规定R应大于1.5。理论塔板数(N)分离度(R)基本概念和术语拖尾因子(tailingfactor，T)——用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetryfactor)或不对称因子(asymmetryfactor)。《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T＜0.95为前延峰，T＞1.05为拖尾峰。定性或定量通过与对照品保留时间的一致性来进行定性。定量常用:a:外标法b:内标法液相色谱分离定量常用的基本公式a:外标法

含量（CX）=CR×AX/AR

CX为供试品浓度AX为供试品峰面积CR为对照品浓度AR为对照品峰面积液相色谱分离定量常用的基本公式b:内标法

校正因子（f）=

AS×CR/CS×AR

含量（CX）=f×

AX×CS/ASAX为供试品峰面积CX为供试品浓度

AR为对照品峰面积

CR为对照品浓度

AS为内标峰面积CS为内标浓度对仪器的一般要求

:除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。报告书书写内容：检品名称：******片批号：200702016检验项目：中国药典2005年版二部附录ⅤD标准规定：含******应为标示量的90.0%～110.0%仪器编号：YQ.H.测定日期：室温：℃色谱柱编号：色谱柱规格：4.6mm×250mm色谱柱：固定相C18柱温：25℃检测器：紫外检测器检测波长：260nm流动相：水—乙腈（60∶40）流速：1ml/min进样量：20μl报告书书写内容：理论板数规定值：按******峰计算不低于1000测定值：分离度规定值：大于1.5测定值：对照品名称：******对照品批号：123-200701对照品来源：中国药品生物制品检定所报告书书写内容：试验方法试验计算试验结果试验结论HPLC日常维护－总结定期检查溶剂过滤器查看过滤器是否变色．临时取下过滤器，检查柱前压力是否正常．清洁溶剂过滤器将堵塞的溶剂过滤器从瓶头组件中拿下。先用水冲洗残留之溶剂，然后将过滤器放在装有浓硝酸（35％）的烧杯里浸一小时，不要使用超声波清洗。用二次蒸馏水彻底冲洗过滤器。建议不使用超声波清洗机清洗。将过滤器重新装好。定期检查溶剂过滤器建议定期清洗溶剂过滤器及溶剂瓶，每三个月至少清洗一次。注意：不要使用没有安装溶剂过滤器的系统．可能会严重堵塞系统.日常维护流动相应经过0.45um或更小孔径的滤器过滤，如果使用滤膜，注意有机膜与水膜的区别(聚四氟乙烯能适用于所有溶剂)注意不同检测器流通池耐压问题，尽量避免使用pH>9.5的流动相，以防腐蚀流通池石英窗，避免使用可能析晶的流动相，防止流通池堵塞使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。

使用PEEK管路和接头需要注意什么问题？另一个需要考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。如何预防液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:

1)用高质量试剂和HPLC级溶剂；

2）过滤流动相和溶剂；

3）脱气；

4）每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；

5）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；高效液相色谱中

常遇见的问题及处理方法

基线噪音大可能由那些原因引起

可能原因是：泵压不稳，流动池有气泡，流动池被污染，对紫外检测器可将流动池移走即可确认。色谱柱污染，系统管路污染。灯能量不足，光学系统老化或污染，参数设计不合理。外界因素影响，如电源，温度和湿度，震动，等。峰面积重现性不好1.首先观察压力是否稳定，以及观察峰面积变化是否有规律。若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。

2.若压力稳定但峰面积呈无规律变化，请检查样品是否足够，确认样品的稳定性，必要时重新配制。检查进样阀是否漏液。等。

3.若压力稳定且峰面积呈规律变化，多数为色谱柱未平衡好。保留时间不稳定1.

首先观察保留时间是否有规律的变化，并同时观察压力是否稳定，若压力稳定而保留时间呈有规律变化，多数是色谱柱未平衡好，特别是含有的流动相，需较长的时间去平衡。2.若压力稳定而保留时间无规律变化，请检查溶剂过滤头及真空腔是否有堵塞。再平衡色谱柱足够时间，如仍然不佳，可更换一色谱柱。3.若压力不稳定，请检查造成压力不稳定的因素，如：漏液，排液时间不足够，盐浓度过高导致盐析，主动阀比例阀内漏，等。一、保留时间缩短

1.流速增加2.样品超载3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度增加1.检查泵,重新设定流速2.降低样品量3.流动相PH值保持在3～7.5

检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温二、保留时间延长

1.流速下降2.硅胶柱上活性点变化3.键合相流失4.流动相组成变化5.温度降低1.管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡2.用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱3.流动相PH值保持在3～7.5检查柱的方向4.防止流动相蒸发或沉淀5.柱恒温三

、出现肩峰或分叉

1.样品体积过大2.样品溶剂过强3.柱塌陷或形成短路通道4.柱内烧结不锈钢失效5.进样器损坏1.用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%2.采用较弱的样品溶剂3.更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件4.更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品5.更换进样器转子四、鬼峰

1.进样阀残余峰2.样品中未知物3.柱未平衡4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱)5.水污染(反相)1.每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗2.处理样品3.重新平衡柱,用流动相作样品溶剂

(尤其是离子对色谱)4.每天新配,用抗氧化剂5.通过变化