细胞培养基本技术

细胞培养基本技术体外培养（Invitro）**

细胞培养(cellculture)：

是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，然后进行培养生长。**

组织培养(Tissueculture)：

把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。

**器官培养(Organculture)：系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。基本概念原代培养源自体内新鲜组织的细胞在体外条件下生长，在传代之前称为原代培养。传代培养细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中

基本概念细胞系(cellline)初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。有限细胞系:细胞系的生存期有限

无限细胞系:已获无限繁殖能力、能持续生存的细胞系

（1）只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性－－转化细胞系

（2）不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化－－恶性转化细胞系细胞株(cellstrain)从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。细胞培养技术的主要优点㈠研究的对象是活的细胞。㈡研究的条件可以人为的控制。㈢研究的样本，可以达到比较均一性。㈣研究的内容便于观察、检测和记录。㈤研究的范围比较广泛。㈥研究的费用相对较经济。

在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至量评估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，控制包括PH、温度、O2张力、CO2张力等物理化学的条件进行实验、观察。通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。需要时并可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。通过倒置相差显微镜外接照相,摄影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。活细胞相差摄影25×1016×10箭头所示分裂相细胞。

BGC-823细胞多种学科均可利用细胞培养进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体内实验经济的多。例如，一个需要100只鼠才能得出结论的实验可能用100片盖玻片或几个多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期贴附生长型细胞

必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。见于各种实体瘤细胞悬浮生长型细胞

不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。见于各种造血系统肿瘤细胞

培养细胞的生长方式及类型贴附生长型细胞细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板++++++++++++细胞的贴附过程贴附物质带正电荷细胞带负电荷成纤维细胞：梭形、三角形、2-3个突起上皮细胞：扁平、多角形、园核可连成单层悬浮生长型细胞

每代贴附生长细胞的生长过程游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。

10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟--4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）潜伏期

此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。

对数生长期：

细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞的生长过程

单个细胞的生长过程

细胞系的生长过程细胞周期间期M期（有丝分裂期）G1期（DNA合成前期）S期（DNA合成期）G2期（DNA合成后期）

细胞系的生长过程原代培养期传代期衰退期为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时期。原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至2个或更多的新的培养器皿中，即传代，此即成细胞系。一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰退死亡。消化传代的步骤培养细胞生长的条件细胞的营养需要细胞的生存环境温度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4

渗透压无污染无毒无毒：无毒是培养细胞的必需条件。凡与细胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。无污染微生物的污染不同细胞类型的交叉污染细菌霉菌支原体等细菌污染

能改变培养液的pH值，使培养液变混浊。

细菌生长迅速，能消耗营养液和产生毒素。

抑制细胞的生长，毒性大的细菌可很快导致细胞崩解死亡。荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体扫描电镜法显示支原体附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体实验准备实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160℃，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒

超净台

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。滤器

CO2培养箱

CO2培养箱设定的条件为37℃,5％

CO2

。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的

问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内加灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水于槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器纯水仪酶标仪微孔板震荡器培养板

培养瓶

细胞培养所用玻璃

及塑料制品的清洗与消毒清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿干净透明无油迹不能残留任何物质浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时清洁液常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液63∶1000∶200次强清洗液120∶200∶1000弱清洁液100∶100∶1000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色

冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹最好用洗涤装置如用手工操作需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5次，晾干备用胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用消毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染消毒灭菌方法物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min干烤：160℃,2小时过滤：0.22μm化学消毒灭菌法70%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20加水至1000ml细胞培养用液的配制蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。

胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用消化液培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点（1）来源受限。（2）成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。（3）易发生支原体污染

合成培养基合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。

血清中含有：①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分血清的成分一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞．无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定抗菌素的使用完全培养基的组成基础培养基80％一95％血清5％一20％碳酸氢钠2.0g/L青、链霉素各100卑位／毫升培养基的配制

RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠2.0g青、链霉素各100单位／毫升加三蒸水至1000ml,过滤除菌。

调节pH值至7.2

加血清（终浓度10％）

细胞传代方法

根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。

1悬浮生长细胞传代离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法1.吸光培养瓶中的培养液2.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5.吸取1/10—1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。7.将后者放入培养箱中培养。细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。

任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1细胞克隆形成率实验

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠2.台盼蓝法活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力

已淘汰3.四唑盐（MTT）比色法四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长570纳米）。记录结果，绘制操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克／毫升的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升／孔），将培养板置于微