天津大学生物化学06课件-《酶学》

第六章酶学1〔研究开展)我国几千年前就开始制作发酵饮料及食品。西方国家在19世纪初确定了发酵的总方程式：葡萄糖〔C6H12O6〕乙醇(CH3CH2OH)+2CO21857年微生物学家巴斯德〔Pasteur〕等人提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。1878年提出了“酶〞这个名称。1913年Michaslis和Menten提出了酶促动力学原理—米氏学说。1926年Sumner第一次从刀豆中提出了脲酶结晶，并证明此酶具有蛋白质的性质。第六章酶学2(总〕第一节酶与一般催化剂的比较第二节酶的分类和命名第三节酶的化学性质第四节酶结构与功能的关系、酶专一性第五节酶的作用机理第六节酶促反响的速度及其影响因素第七节酶的别离提纯及活力测定第八节酶的应用第一节酶与一般催化剂的比较一、与一般催化剂的共性

二、作为生物催化剂的特性

一、与一般催化剂的共性１．用量少而催化效率高。２．不改变化学反响的平衡点，仅能改变反响速度。３．可降低反响的活化能。活化能是指在一定温度下一摩尔底物全部进入活化态所需要的自由能。二、作为生物催化剂的特性1〔总〕1．催化效率高。2．具有高度的专一性。3．酶易失活。4．活力受调节控制。5．活力与辅酶、辅基有关。二、作为生物催化剂的特性2〔1〕催化效率高：比非催化反响高108－1020倍，比其它催化反响高107－1013倍双氧水裂解(过氧化氢酶〕1二、作为生物催化剂的特性32．具有高度的专一性：一种酶只能作用于某一类或某一种特定的物质。3．酶易失活：凡使蛋白质变性的因素〔强酸、强碱、高温等〕都能使酶被破坏而完全失活４．活力受调节控制：如抑制剂调节、共价修饰调节、反响调节、酶原激活及激素等的控制5．活力与辅酶、辅基及金属离子有关：有些酶是复合酶，假设将其中小分子物质〔辅酶、辅基及金属离子〕除去，酶就失去活性。第二节酶的分类和命名一、酶的分类1.根据催化反响类型分2.根据类别分二、酶的命名1.系统命名2.习惯命名第二节酶的分类和命名(分类1)1.根据催化反响类型分1.氧化复原酶〔脱氢酶与氧化酶〕(1)脱氢酶A-H2+B〔辅酶〕←→A+B-H2(2)氧化酶B-H2+O2←→BO+H2O2.转移酶A-X＋B←→A＋B-X3.水解酶A-B＋H2O←→AOH＋BH第二节酶的分类和命名(分类2)1.根据催化反响类型分4.异构酶5.裂解酶A←→B+C6.合成酶A+B+ATP←→C＋ADP(ATP起提供能量活化反响分子的作用)第二节酶的分类和命名(分类2)2.根据类别分：类、亚类、亚亚类等每一种酶都有由四个数字组成的编号，前加EC〔酶学委员会〕。四个数字分别表示：该酶属于在六大类中的归属、在亚类中的归属、在亚亚类中的归属及该酶在一定亚亚类中的位置，如：乳酸脱氢酶EC1．1．1．27四个数字分别表示：第一大类〔氧化复原酶〕、第一亚类〔氧化-CHOH〕、第一亚亚类〔氢受体为NAD＋、乳酸脱氢酶在此亚亚类中的序号)第二节酶的分类和命名(命名1)1．系统命名：底物的名称+反响的类型

如：乙酰磷酸转移酶、ATP：乙酰磷酸转移酶第二节酶的分类和命名(命名2)2．惯用命名：比较简短，使用方便，通常依据酶所作用的底物及其反响类型来命名。如催化乳酸脱氢变为丙酮酸的酶叫乳酸脱氢酶；水解蛋白的酶叫蛋白水解酶；从来源上还分为胰蛋白酶，胃蛋白酶等。第三节酶的化学性质〔总〕一、酶大多是蛋白质二、酶的辅因子一、酶是蛋白质1．对热不稳定。2．为两性电解质。3．引起蛋白质变性的化学及物理因素，同样也能使酶失活。4．具有胶体物质的一系列特性。5．受蛋白水解酶作用而丧失活性。6．酶的催化活性与蛋白质本性密切联系。7．许多酶的氨基酸排列顺序已陆续测出。酶有以下性质与蛋白质极为相似二、酶的辅因子辅因子：酶中除蛋白质外的非蛋白小分子物质。全酶=酶蛋白+辅因子辅因子类型：金属离子、小分子有机化合物、有时这两者协同作用。作用：作为电子、原子或某些基团的载体参与反响，并促进整个催化过程的进行。辅酶：用透析法可除去的小分子有机物，直接参加催化反响。辅基：用透析法不易除去的小分子物质，如金属离子，它间接参加反响。第四节酶结构与功能关系、专一性一、酶结构与功能二、酶作用的专一性

一、酶结构与功能〔一〕活性部位和必需基因〔二〕酶原的激活〔三〕同功酶〔一〕活性部位和必需基团1必需基团：酶分子的某些基团，经化学修饰改变后，那么酶的活性即会丧失。活性中心：是指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。活性部位活性中心〔一〕活性部位和必需基团2(1)结合基团催化基团酶活性部位上的基团有两类结合基团：参与和底物结合的基团〔一〕活性部位和必需基团2(2)催化基团：直接参与催化反响的基团。胰凝乳蛋白酶〔chymotrypsin〕

的活性中心〔一〕活性部位和必需基团2(3)

随肽链的盘绕折叠，构成酶活性部位的基团彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。〔一〕活性部位和必需基团3〔总〕1．酶的专一性研究2．酶分子侧链基团的化学修饰3．X－射线晶体衍射法确定酶的活心中心的方法〔总〕1．酶的专一性研究

通过研究酶的专一性底物的结构，判断和确定活性中心的结构特点。2．酶分子侧链基团的化学修饰1使用一些对酶分子侧链功能基团可进行共价修饰的试剂作用于酶，以查出哪些基团是保持酶活力所必需的。酶分子中可被修饰的基团：硫氢基〔巯基〕、羟基、咪唑基、氨基及羧基等。可用作化学修饰的试剂：用的较多的有DFP〔二异丙基氟磷酸〕。2．酶分子侧链基团的化学修饰2二异丙基氟磷酸〔DFP〕的作用3．X—射线晶体衍射法直接对酶三维空间结构进行分析实验证明，大多数酶分子的绝大局部非极性侧链聚集成三维结构的“骨架〞，而大局部极性侧链那么位于酶分子外表，这样的结构是有利于进行酶的催化反响的。

牛胰蛋白酶〔二〕酶原的激活1酶原的激活：由无活性的酶原变成活性酶的过程。举例：某些酶特别是一些与消化作用有关的酶。常见的酶原及其激活剂:(南大P274，表7-5)〔二〕酶原的激活2(胰蛋白酶的激活)缬天天天天赖异缬甘组SS丝SS肠激酶〔激活作用〕缬天天天天赖异甘组SS丝缬SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶〔三〕同工酶同工酶：具有不同分子形式，却催化相同的化学反响的酶。同工酶具有不同的理化性质、免疫学性质。这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同，或者由于mRNA或翻译产物是经过不同加工过程产生的。具有不同分子形式的同工酶之所以能催化相同的化学反响，是因为它们的活性部位在结构上相同或者至少非常相似。二、酶作用的专一性〔总〕含义：酶对所有作用的底物有严格的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类分子结构相似的物质，这种选择性作用称为酶的专一性。

1．结构专一性

2．立体异构专一性1．结构专一性各种酶对底物结构的专一性要求不同：有的酶只对底物分子中其所作用的键要求严格；而另一些酶对底物的要求更高些。α－葡萄糖苷酶:要求底物必须是D－葡萄糖通过α－糖苷键所形成的糖苷，不要求R基团。2．立体异构专一性几乎所有酶对立体异构体都具有高度的专一性。酶的立体专一性在实践很有意义乳酸脱酶：能催化L－乳酸脱氢变为丙酮酸，对D-乳酸那么无作用D－乳酸L－乳酸

乳酸脱酶－2H第五节酶的作用机理〔总〕一、酶的催化作用与分子活化能

二、与酶的高效率有关的因素

一、酶的催化作用与分子活化能1能阈:在一个反响体系中，只有那些含能到达或超过某一定限度的活化分子才能在碰撞中发生化学反响,这一限度即为能阈。使反响到达一定能阈的途径有两条：1．对反响体系加热或用光照射。2．使用适当的催化剂，降低反响的能阈，使反响沿着一个活化能阈较低的途径进行。一、酶的催化作用与分子活化能2其活化能正常为千焦耳。用胶态铂作为催化剂时，活化能降至千焦耳。用过氧化酶催化时，那么可降低至千焦耳反响速度增加一亿倍以上。过氧化氢分解成水和氧的反响：一、酶的催化作用与分子活化能3反响过程中能的变化一、酶的催化作用与分子活化能3反响过程中能的变化二、与酶的高效率有关因素〔总〕〔一〕底物与酶的靠近及定向〔二〕酶使底物分子中的敏感键“变形〞〔三〕共价催化—中间体学说〔四〕酸碱催化〔五〕酶活性中心是低介电区域〔一〕底物与酶的靠近及定向〔1靠进〕1．靠近效率：催化基团－COO－愈靠近底物酯键，那么反响速度愈快，在最靠近的情况下，速度可由开始的1增至53000倍。酯酯水解相对速度12053000〔一〕底物与酶的靠近及定向〔2定向1〕(1)锁钥学说(2)轨道定向〔一〕底物与酶的靠近及定向〔2定向2〕1890年有些学者提出的，强调酶对它所作用的底物有着严格的选择性，它只能催化一定结构或一些结构近似的化合物发生反响。(1)锁钥学说〔一〕底物与酶的靠近及定向〔2定向1〕1958年由Kosnland提出的，该学说认为酶外表并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状;反响后，释放出产物，酶的构象再逆转，回到它们的初始状态。〔2〕轨道定向假说〔诱导楔合学说〕〔二〕酶使底物分子中的敏感键“变形〞酶使底物中的敏感键发生“变形〞，而易于破裂。酶中的某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力〞，使敏感键的一端更加敏感，更易于发生反响，此学说的理论依据来源于羧肽酶的X—衍射分析结果。〔三〕共价催化—中间体学说1这种方式是底物与酶形成一个反响活性很高的共价中间物，它很易变成过渡态而大大降低反响的活化能。证明此学说的正确与否可用光谱法，甚至用电子显微镜观察中间产物的存在。〔三〕共价催化—中间体学说1S+E=SE→E+P←〔四〕酸碱催化酶活性部位上的某些基团〔如氨基、羟基、硫氢基、咪唑基等〕可作为良好的质子供体或受体，对底物进行酸碱催化。〔五〕酶活性中心是低介电区域酶的活性中心穴内相对地说是非极性的。因此，酶的催化基团被低介电环境所包围。在某些情况下，还可能排除高极性的水分子。这样，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反响力，这是有助于加速酶反响的。第六节酶促反响的速度及其影响因素一、酶反响速度的测量

二、影响酶促反响速度的因素一、酶反响速度的测量11．测量单位时间内底物的消耗量2．测量单位时间内产物的生成量一、酶反响速度的测量2产物的浓度酶反响的速度曲线从图中可见，开始一段时间，反响速度几乎维持恒定。但随时间的延长，曲线斜率逐渐减少，反响速度逐渐降低。斜率=浓度/时间

=vt一、酶反响速度的测量3〔1〕底物浓度降低、产物浓度上升而逐渐增大了逆反响。〔2〕酶本身在反响中失活，产物的抑制等。因此，一般测定酶促反响初期的速度，因为此时以上因素还来不及起作用，此速度称为“反响初速度〞〔条件：底物浓度足够大时〕其原因可能是二、影响酶促反响速度的因素〔总〕〔一〕酶浓度对酶作用的影响〔二〕pH对酶作用的影响〔三〕温度对酶作用的影响〔四〕底物浓度对酶作用的影响〔五〕激活剂对酶作用的影响〔六〕抑制剂对酶作用的影响〔一〕酶浓度对酶作用的影响反响的速度v酶的浓度〔[E])v=k[E]在底物足够过量而其他条件固定的条件下，酶促反响的速度和酶浓度成正比。〔二〕pH对酶作用的影响相对活力各种酶的pH值的活性曲线2468100最适pH:酶表现出最大活性的pH。生物体内大多数酶的最适pH接近于中性〔〕。胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5,胰蛋白酶的最适pH在9左右。溶液pH偏离最适pH时，酶的活性降低，偏离越远，活性越低。胃蛋白酶胰蛋白酶〔三〕温度对酶反响的影响1反应的速度v温度tOC低温时酶的活性低，酶促反响速度很慢。温度升高时，反响速度也逐步增加但当温度增加到一定程度以后，引起酶的变化，酶促反响减慢以至消失。〔三〕温度对酶反响的影响2最适温度:酶表现最大催化能力时的温度大多数酶的最适温度接近于体温370C。但也有个别的酶具有较大的抗热性。酶的反响活性在低温下并不丧失，只是催化活性很微弱，温度上升活性又可恢复。反应的速度v温度tOC最适温度〔四〕底物浓度对酶作用的影响1一级反响：当底物浓度较低时，反响速度与底物浓度成正比关系。混合级反响：随着底物浓度的增加，反响速度不再按正比升高。零级反响:随底物浓度的不断加大，反响速度不再上升，趋向一个极限，说明酶已被底物所饱和。一级反响v[S]Vmax1/2VmaxKm零级反响混合级反响〔四〕底物浓度对酶作用的影响2“中间产物〞假说为了解释上图所示现象，曾有许多假说，其中“中间产物〞假说是被大家公认的比较合理的假说。它认为酶与底物先结合成一个络合物，即中间产物。此中间产物亦被人们看作为稳定的过渡态物质，然后此络合物再进一步分解成为产物和游离态酶。E+SESP+EK1K2K3K4〔四〕底物浓度对酶作用的影响31．米氏方程的提出

2．米氏常数的意义及测定1．米氏方程的提出1(方程〕1913年Michaelis和Menten提出酶促动力学的根本原理，并归纳为一个数学式加以表达-米氏方程。米氏方程说明了底物浓度与酶反响速度间的定量关系，这就使“中间产物假说〞得到了人们的普遍成认，现在一般称为“米氏学说〞。1．米氏方程的提出2(解释1〕米氏方程圆满地表示了[s]和V之间的关系1当底物浓度较低时，Km＞＞[s]，分母中[s]可忽略不计，即：得：V=〔Vmax/km〕[s]即反响速度与底物浓度成正比，符合一级反响1．米氏方程的提出2(解释2〕米氏方程圆满地表示了[s]和V之间的关系2当底物浓度很高时[S]＞＞Km，Km可忽略不计，即：得：V=Vmax即反响速度与底物浓度无关，符合零级反响2．米氏常数意义及测定1(意义1〕当反响速度v等于最大的反响速度Vmax的一半时，即v=Vmax/2，代入方程得：简化得：

Km=[s]2．米氏常数意义及测定1(意义2〕当酶促反响速度到达最大的反响速度一半时的底物浓度。它的单位是mol/L，与底物浓度单位一致。不同酶促反响的Km可相差很大，一般在10-3－10-5mol/L之间。米氏常数在酶学研究中是一个极重要的数据。米氏常数的物理意义是：2．米氏常数意义及测定2〔Km特点〕〔1〕Km是酶的特征常数之一。〔2〕如果一种酶有几种底物，那么对每一种底物，各有一个特定的km值,因此，测定酶的Km可以作为鉴别酶的一种手段。〔3〕Km愈小〔1/Km愈大〕酶对底物的亲和力愈大，到达最大反响速度一半时需要的底物浓度就越小。因此Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。〔4〕可由所要求的v〔应到达Vmax的百分数〕，求出应当参加的[S]；反过来，也可根据的[S]，求出该条件下的v。2．米氏常数意义及测定3〔实际意义〕(1)鉴定酶(2)判断酶的最适底物(3)计算一定速率下的底物浓度(4)了解酶的底物在体内具有的浓度水平(5)判断反响方向和趋势(6)判断抑制类型2．米氏常数意义及测定4〔测定1[1]〕linewenver-Burk的双倒数作图法1

1Km11=

+

VVmax[S]Vmax假设以1/V对1/[S]作图,即得:即取米氏方程的倒数2．米氏常数意义及测定4〔测定1[2]〕斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmaxlinewenver-Burk的双倒数作图法2此法因方便而应用最广实验点过分集中于直线的左端，作图不易十分准确2．米氏常数意义及测定4〔测定2〕以v对v/[S]作图,得一直线其纵轴截距为Vmax横轴截距为Vmax/Km斜率为－Km法:

即把米氏方程改写为：VmaxvVmax/Kmv/[S]斜率为－Km〔五〕激活剂对酶作用的影响1(概念)激活剂:能增进酶的活性，加速酶促反响进行的物质。激活:使已有活性的酶活性增高。是由小到大的问题。致活:活性从无到有的问题。如Mg2+是各种磷酸激酶的激活剂；CO2+，Mn2+，Zn2+是某些肽酶的激活剂；Cu2+、Fe2+是某些氧化酶的激活剂。〔五〕激活剂对酶作用的影响2(机理)〔1〕可能是构成酶活性中心的成分之一，由于别离提纯而丧失，所以参加某些金属离子有助于增强酶的活性。〔2〕可能是酶与底物结合的桥梁。作用机理〔六〕抑制剂对酶作用的影响1抑制作用:使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。酶的抑制剂:对酶抑制作用的物质。失活作用:使酶变性的作用。抑制作用一般分为两类：

1．不可逆抑制作用

2．可逆的抑制作用1．不可逆抑制作用1定义:抑制剂与酶结合后，不能用透析的方法除去抑制剂而恢复酶活力。举例:二异丙基氟磷酸〔DFP)能够与胰凝乳蛋白酶或乙酰胆碱酯酶活力中心的丝氨酸残基反响，形成稳固的共价键，因而抑制酶的活性.不可逆抑制作用11．不可逆抑制作用2又如碘乙酸、碘乙胺对巯基酶的不可逆抑制不可逆抑制作用2

碘乙酸(碘乙胺)2．可逆的抑制作用可逆的抑制作用:抑制剂与酶的结合为一可逆反响,用透析等方法能除去抑制剂使酶恢复活力它又分为〔1〕竞争性抑制作用〔2〕非竞争性抑制作用〔3〕反竞争性抑制〔1〕竞争性抑制作用1(定义)定义:当抑制剂与酶结合后，阻碍了底物与酶结合，因而降低了酶的活力.〔1〕竞争性抑制作用2(举例)如琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢生成反丁烯二酸与琥珀酸结构近似的如草酸、丙二酸、草酰乙酸或戌二酸均可作为琥珀脱氢酶的竞争性抑制剂〔1〕竞争性抑制作用3(式子表示)

竞争性抑制作用可用下式表示：

Ki2〔1〕竞争性抑制作用4(速度方程1)

按推导米式方程的方法可导出竞争性抑制作用的速度方程

〔1〕竞争性抑制作用4(速度方程2)从上述速度方程可以看出：有竞争性抑制剂存在时，Km值增大1＋[I]/Ki倍，而且Km值将随着[I]增高而增大，当[S]＞＞＞km时〔也就是[s]使酶饱和时，方程即为v=V，最大反响速度不变。竞争性抑制剂存在时，改变Km而不改变V的作用。反映竞争性抑制作用的特点是底物浓度很高时，抑制作用可以被解除，竞争性抑制剂影响Km而不影响V.〔1〕竞争性抑制作用4(速度方程3)表达在图中，I存在时与I不在存在时所得直线都在纵轴上交于一点，即纵轴截距相等。而横轴截距负值减少，斜率增大。其作用机理可能是由于底物与抑制剂结合在酶分子的同一部位上，也可能是由于底物或抑制剂中的一个与酶结合后，引起酶发生变化，产生不利于另一个结合的构象.1/v1/[S]－1/km－1/km〔1+[I]/Ki〕Vmax正常[I]加大〔1〕竞争性抑制作用4(速度方程4)Vmax不变Km变大〔2〕非竞争性抑制作用1(定义1)定义1:有些抑制剂和底物可同时结合在酶的不同部位上，也就是说抑制剂与酶结合后，不阻碍酶再与底物结合。〔2〕非竞争性抑制作用1(定义2)

但所形成的酶－底物-抑制剂三元复合物[ESI]不能进一步分解为产物，因此酶活性降低。〔2〕非竞争性抑制作用2(式子表示)非竞争性抑制作用可用下式表示〔2〕非竞争性抑制作用3(速度方程1)推出的速度反响方程为双倒数法处理〔2〕非竞争性抑制作用3(速度方程2)

由方程可以看出：非竞争性抑制剂存在时，v减少1＋[I]/Ki倍。而且v将随[I]增大而降低，但Km值不变。当[S]无限增大时，有I存在时的曲线永远低于无抑制剂存在的曲线，彼此不能重合。因此，反映出此种抑制不能增大[S]来克服。这种影响v而不改变Km的作用为非竞争性抑制作用的特点〔2〕非竞争性抑制作用3(速度方程3)非竞争性抑制作用改变v而不影响Km的效应表现在：有I存在时得到的直线和没有I存在时所得的直线在横轴上交于一点，即横轴截距相等。都是－1/km。但纵轴截距和直线斜率增大，并将随着[I]增大而增大，这个特点也常用来做为判断非竞争性抑制作用的一个根据。1/v1/[S]－1/km正常[I]加大〔2〕非竞争性抑制作用3(速度方程4)Vmax变小Km不变〔2〕非竞争性抑制作用3(作用机理4)

抑制作用于酶活性部位中催化基团，也可能是与维持酶分子构象的必需基团作用，而使酶的活性降低。非竞争性抑制作用的机理可能是〔3〕反竞争性抑制1(式子表示)相对于上述两种抑制作用，反竞争性抑制存在着以下平衡，抑制剂只能与酶－底物中间复合物结合〔3〕反竞争性抑制2(速度方程)随着抑制剂的增加，Vmax和Km均变小，形成的三元复合物不能分解为产物，因此影响反响速度。这类抑制很少见。其动力学曲线的特征是3.三种不同抑制作用的特点工科P104，南大P2814.对酶的抑制作用研究的意义酶的抑制作用在医学、工农业生产及根底理论研究上都具有一定的意义。如人服用磺胺药物后，磺胺药物即作为竞争性抑制剂，可以和细菌体内利用对－氨基苯甲酸的酶结合。从而使细菌体内无法合成其生活所需物－叶酸，而导致代谢紊乱，细菌繁殖受到抑制；在农业上抑制作用常用于设计新农药第七节酶的别离提纯及活力测定一、酶的别离提纯二、活力测定一、酶的别离提纯(总)1．目的2．提纯3．制备战略1．目的〔1〕研究酶的理化特性、鉴定酶〔2〕生物试剂及用作药物〔高纯度〕2．提纯酶有两大类，胞外酶及胞内酶。胞外酶易别离。如收集动物胰液即可别离出其中的各种蛋白酶及脂酶。胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行别离。3．制备战略(总)〔1〕选材〔2〕破碎细胞〔3〕抽提〔4〕浓缩〔5〕纯化3．制备战略1〔1〕选材：含量高，易于别离。〔2〕破碎细胞：研磨，匀浆器，捣碎机。〔3〕抽提：抽提时注意的因素：pH、温度、盐及蛋白酶等。一般在低温下，调节pH至等电点，用盐析〔硫酸铵或氯化钠〕或有机溶剂〔乙醇、丙酮、异丙醇等〕使酶沉淀。酶是生物活性物质，一般在0—50C进行提纯。乙醇、丙酮等有机溶剂分级别离时必须在－150C—－200C进行，酶制品一般都应在－200C以下低温保存。3．制备战略2：

〔4〕浓缩：抽提液和发酵液中酶浓度一般都很低，所以，在纯化前要进行浓缩，常用的方法有：①蒸发：高真空的条件下，大面积热空气接触，使水分在瞬时蒸发，而到达目的。由于水分蒸发时能带走热量，所以，只要真空条件好，受热并不强。②超过滤。③凝胶过滤。④冰冻浓缩。⑤其他：如聚乙二醇浓缩等。3．制备战略3：

〔5〕纯化：首先了解所需纯化酶的理化性质〔溶解度、分子大小和解离特性〕，以及酶的稳定性等。判断所选方法与条件的适当性，控制操作条件。具体纯化方法有：①根据分子大小：凝胶过滤、超滤、超离心等。②根据解离性质：离子交换、电泳、等电聚焦等。③根据溶解度：盐析、有机溶剂沉淀等。④酶与底物、辅助因子及抑制剂的专一性亲和作用，可采用亲和层析。二、活力测定1．酶活力与酶反响速度

2．酶的活力(activity)单位

3．酶的比活力(specificactivity)1．酶活力与酶反响速度1从图中可知，反响速度只在最初一段时间内保持恒定，随时间延长，酶反响速度逐渐下降。研究酶反响速度，应研究酶促反响的初速度。因为此时反响速度是成直线上升。产物的浓度酶反响的速度曲线斜率=浓度/时间

=v酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化某一化学反响的反响速度来表示。酶反响速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示：V=[S]/t[P]t1．酶活力与酶反响速度2造成反响速度下降的原因：〔1〕底物浓度降低〔2〕酶局部失活〔3〕产物对酶抑制〔4〕产物浓度增加加速了逆反响的进行1．酶活力与酶反响速度3测定产物增加量或底物减少量的常用的方法：化学滴定法、比色、比旋光、气体测压、测定紫外线吸收、电化学法、荧光测定以及同位素技术等。在简单酶反响中，底物减少与产物增加的速度是相等的。但一般以测定产物为好。因为测定