真核细胞提取与酶切鉴定

关于真核细胞提取与酶切鉴定第一页，共三十五页，2022年，8月28日实验本身:实验室规则:时间、穿着、

仪器不能乱动、

赔偿制度、

整洁、卫生。实验报告（如实记录）

规范操作（辨认标签…）、

污染物、毒物、废弃物

（酸碱烧伤大量自来水冲洗）规则实验

第二页，共三十五页，2022年，8月28日实验报告要求题目，组号实验目的实验原理实验操作：如实记录实验结果及结果分析：实事求是讨论或小结：认真分析，仔细思考第三页，共三十五页，2022年，8月28日4真核细胞基因组DNA的分离提取及酶切电泳第四页，共三十五页，2022年，8月28日

实验目的1.掌握人外周血基因组DNA的提取原理、提取方法和注意事项。2.学习琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和技术。第五页，共三十五页，2022年，8月28日基因组DNA提取的操作流程

〖实验步骤〗第六页，共三十五页，2022年，8月28日１、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml

Eppendorf离心管中。

抗凝剂

EDTA-Na2、枸橼酸钠或肝素作为抗凝剂

第七页，共三十五页，2022年，8月28日２、加入1mlSTMT，充分混匀

使其溶血。STMT（破坏细胞膜)sugar：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。Tris·HCl:不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性。MgCl2:提供Mg2+，稳定DNA。TritonX-100:非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及细胞核。第八页，共三十五页，2022年，8月28日３、10000g离心2min，弃上清。注意离心机的使用⑴配平⑵上清丢弃到废液缸，尽量空净。第九页，共三十五页，2022年，8月28日4、用0.4ml生理盐水洗沉淀，10000g

离心2min，弃上清。注意离心机的使用⑴配平⑵上清丢弃到废液缸，尽量空净。第十页，共三十五页，2022年，8月28日５、加450μlNE溶液将沉淀重新悬浮。NENaCL:50mmol/LEDTA:1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶；

2.降低细胞膜的稳定性第十一页，共三十五页，2022年，8月28日６、加50μl10%SDS，迅速混匀;再加50μl蛋

白酶K，轻轻摇匀后置50℃水浴1h。SDS

1.溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2.溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3.对RNA、DNA酶有抑制作用4.与蛋白质形成R-O-SO3….R蛋白质复合物，使蛋白质变性蛋白酶K(或链霉蛋白酶)

广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。第十二页，共三十五页，2022年，8月28日７、加入TE饱合酚500μl，轻摇2min，10000g离心

1min，将上层水相移至另一新Eppendorf管内。酚能有效地使蛋白质变性；酚不能抑制RNAase的活性；酚能溶解入10％一15％的水分。第十三页，共三十五页，2022年，8月28日８、加入酚－氯仿－异戊醇混合液500μl，轻摇

1min，10000g离心1min，将上层水相移至另

一Eppendorf管内。氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。氯仿有助于加速有机相和水相的分离；使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽提，还可克服酚的缺点。第十四页，共三十五页，2022年，8月28日９、加入氯仿－异戊醇混合液500μl，轻摇

1min，10000g离心1min，将上层水相移至另

一新Eppendorf管内。（定体积）移上清时要定量，宁少勿多氯仿：①将残留在水相中的酚带走②也可以再次使蛋白变性异戊醇：①降低分子表面张力，减少气泡产生②有助于分层上层为水相中间为变性的蛋白下层为有机相第十五页，共三十五页，2022年，8月28日10、向上清中加入1/10体积的NaAc，并混匀。

再加入2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀，

于－80℃放置10min。核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多1价、2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用的沉淀剂为1价钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。第十六页，共三十五页，2022年，8月28日11、10,000g离心5min，弃上清,将小管倒置于滤纸上。室温干燥10min。第十七页，共三十五页，2022年，8月28日12、加入20μl双蒸水溶解基因组DNA。基因组DNA8μl10XH缓冲液1μlEcoRⅠ1μl离心甩一下，37℃温浴1h。另外剩余的10μl留做电泳分析用。酶切体系第十八页，共三十五页，2022年，8月28日

酶切注意事项按顺序加样，每加一个样品更换一次tip头一定要将酶加进去加酶的时候一定保证低温，在冰上操作加完后要充分混匀，用离心机“甩”一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）第十九页，共三十五页，2022年，8月28日13、1％琼脂糖凝胶电泳检测(上样量10μl)10μL酶切后基因组DNA2μL6×Loadingbuffer10μ基因组DNA2μL6×Loadingbuffer10μLMarker1×TBE恒压100V电泳0.5-1h第二十页，共三十五页，2022年，8月28日

实验原理核酸：包括DNA、RNA两种分子。

DNARNA多呈单链线性分子双链线性分子双链环状分子第二十一页，共三十五页，2022年，8月28日

真核生物DNA95%存在于细胞核5%存在于细胞器真核生物RNA10%存在于细胞核15%存在于细胞器75%存在于细胞质第二十二页，共三十五页，2022年，8月28日

分离纯化核酸总的原则应保证核酸一级结构的完整性排除其它分子的污染第二十三页，共三十五页，2022年，8月28日

完整性的保证尽量简化操作步骤，缩短提取过程减少化学因素对核酸的降解减少物理因素对核酸的降解如机械剪切力、高温防止核酸的生物降解

DNA酶、RNA酶第二十四页，共三十五页，2022年，8月28日

纯度的保证核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度排除其它核酸分子的污染第二十五页，共三十五页，2022年，8月28日

从全血中制备基因组DNA

首先用去污剂TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细胞核；用SDS破坏核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使DNA释放入水相中。用酚／氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNA溶液中残存的蛋白质及酚；用无水乙醇沉淀水相中的DNA，即可获得基因组DNA。破裂细胞→消化蛋白质→有机抽提除去蛋白质→沉淀水相中的DNA第二十六页，共三十五页，2022年，8月28日DNA抽提示意图第二十七页，共三十五页，2022年，8月28日

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠMolecularscissor第二十八页，共三十五页，2022年，8月28日

均来自微生物，并据此而进行命名；识别序列长度常为4－8核苷酸序列;大部分酶识别序列呈二元旋转对称结构即回文结构;

其切割后的DNA可产生不同的末端。限制酶的特点（Ⅱ类酶）第二十九页，共三十五页，2022年，8月28日

DNA的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比DNA的空间构型不同，即使分子量相同其迁移率也不相同

第三十页，共三十五页，2022年，8月28日

核酸电泳的染色剂

最常用的是溴乙锭染色法。(ethidiumbromide，EB)对1ngRNA，DNA均可显色。EB染料是一种强烈的诱变剂，操作时应注意防护，应戴上聚乙烯手套。在紫外线激发下，发出红色荧光(590nm）。

第三十一页，共三十五页，2022年，8月28日

实验结果酶切后的基因组DNA第三十二页，共