细胞因子及其受体的检测

细胞因子及其受体的检测

第一节细胞因子检测概述一、细胞因子的类型与作用特点二、细胞因子检测的特点与方法由非神经—内分泌细胞产生的一大类与免疫应答活动密切相关的低分子蛋白与多肽。细胞因子细胞因子的类型与作用特点1、细胞因子的分类2、细胞因子的作用特点以生物学作用进行划分的分类白细胞介素（Interleukin）——IL-1、IL-2、……IL-18干扰素（Interferon）——IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor）——TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulatingfactor）——M-CSF、G-CSF转化生长因子（Transforminggrowthfactor）——TGF-趋化因子（Chemokine）——IL-8、GROs、MCP-1生长因子（Growthfactor）——EGF、FGF、IGF、PDGFTNFsILsIFNsTGFsChemokinesCSFs各类细胞因子间关系1、旁分泌（paracrine）、自分泌（autocrine）性2、多源与同源性3、高效性4、多效性（pleiotropy）5、丰余性（redundancy）6、协同性7、拮抗性8、网络性细胞因子细胞因子细胞因子受体细胞因子受体细胞因子的自分泌与旁分泌性

IL-2IFN-TNF-细胞因子的同源性与多源性IFN-T细胞T细胞NK细胞IL-4Th细胞肥大细胞Th细胞B细胞细胞因子的多效性Th细胞B细胞细胞因子的丰余性IL-2IL-4IL-5Th细胞B细胞细胞因子的协同性IL-4IL-5Th2细胞B细胞细胞因子的拮抗性Th1细胞IL-4IFN-细胞因子的网络性IL-3、IL-5、IL-4、IL-6、GM-CSFTNFTGFIL-1IFNIL-1IFNTNFIL-1TGFIFNIL2IL-4IFNIL2IL-4IL-5IL-6TNFIFNIL-1TGFTNFIL-1IFNIL-5GM-CSFG-CSFM-GSFTNFTNFIL-1TGFIL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIL-1IL-6IL-1IL-6GM-CSFG-CSFM-GSFIFN内皮细胞成纤维细胞TB细胞因子检测的特点与方法1、检测的特点2、检测的方法

细胞因子检测的特点免疫原性较弱样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差细胞因子检测的方法免疫学检测方法——抗原性检测细胞生物学检测方法——生物活性检测分子生物学检测方法——基因表达检测

第二节细胞因子检测的方法与原理一、细胞因子的细胞生物学检测二、细胞因子的免疫学检测三、细胞因子的分子生物学检测细胞因子的细胞生物学检测1、检测方法与原理2、检测中的操作注意要点

检测方法与原理细胞增殖或增殖抑制试验细胞病变抑制试验细胞毒试验细胞趋化试验滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意检测中的操作注意要点靶细胞的选择与培养检测标本的制备显示检测结果靶细胞的选择与培养1、对所测的细胞因子有特异的敏感性2、易培养、保存、生物学特性稳定3、有良好的生长状态4、种属适配各类细胞因子检测的常用靶细胞细胞因子实验系统干扰因素IL-1D10（M）增殖法IL-2、IL-4EL-4（M）增殖法IL-4A352（H）增殖抑制法IL-2CTLL（M）增殖法IL-4IL-3KG-1（H）增殖法

TF-1（H）增殖法GN-CSF、IL-5IL-6、EPOIL-4CTLL（M）增殖法IL-2IL-5BCL-1（M）增殖法IL-4各类细胞因子检测的常用靶细胞细胞因子实验系统干扰因素IL-6B9（M）增殖法IL-4、IL-11BM60（H）增殖法IL-7Clone-IXN/2b（M）增殖法IL-8中性粒细胞（M、H）趋化法GM-CSFTF-1（H）增殖法IL-3、IL-5IL-6、IL-5TNF/L929（M、H）细胞毒法IFNwish（H）病变保护法IFN-、IFN-L929（M）病变保护法IFN-、IFN-

检测标本的准备1、分离特定的产生细胞2、对产生细胞进行诱导、激活3、选择适当的收集时间显示检测结果1、细胞增殖状态的显示：放射性核素掺入法、胞内酶活性显示法活细胞染色法细胞荧光测定法2、细胞毒或细胞病变状态的显示活细胞染色法胞内酶活性显示法

DNA断片测定法直接计数法

简便、直观,但费时、主观因素影响大、难以标准化和自动化细胞代谢活性测定方法

3H-TdR、125I-UdR掺入法或MTT等比色法细胞代谢产物测定法代谢产物荧光强度测定法和指示细胞表面标记或可溶性分子测定法细胞增殖检测方法分类

通过检测细胞DNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，DNA合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3H/125I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定

优点缺点方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染(1)放射性核素掺入法特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关测定步骤类似相同点不同点与同位素掺入法相比掺入物：MTT而非3H-TdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同(2)MTT比色法敏感性较高特异性不高操作繁琐易受干扰生物学活性测定方法学评价细胞因子的免疫学检测分泌型细胞因子的检测细胞内细胞因子的检测敏感性偏低不能判断细胞因子的生物学活性。ELISA特异、简便易于推广和标准化等优点可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理细胞因子测定的首选方法优点缺点ELISPOT酶联免疫斑点试验(ELISPOT或ElisaSpot)在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同ELISA，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关基本原理细胞内细胞因子检测技术激活膜抗原标记细胞内细胞因子标记流式细胞分析法流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。1．分离和培养待检细胞2．细胞固定3．封闭非特异性结合位点4．染色与分析基本步骤使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：

Th1细胞IFN-γTh2细胞IL-4细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术直接或间接荧光抗体染色无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态四、免疫学测定方法学评价优点：特异性高

操作简便、快速，无需依赖细胞株影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系敏感性相对较低标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合细胞因子的分子生物学检测此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。方法：1、Northern印迹杂交法2、Southern印迹杂交法3、PCR与逆转录PCR4、原位杂交，原位PCR和原位RT—PCR

第三节常用细胞因子的检测方法一、IL-2的检测二、IFN-γ的检测三、TNF的检测待检样品（细胞上清）指示细胞（CTLL-2）按不同稀释度加入37ºC，16-20小时加入3HTdR（1-5Ci）37ºC，4-6小时收集细胞测定白细胞介素-2的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同稀释度加入37ºC，4小时37ºC，24-48小时弃取上清，加入VSV观察细胞病变（镜检或比色）干扰素的测定示意图肿瘤坏死因子的测定示意图待检样品（细胞上清）指示细胞（L929）按不同