在细胞和模型系统的反常次扩散是一个活跃的研究领域

生物物理学杂志103卷2012年12月2411–2422探索：反常次扩散的正控制MichaelJ.Saxton加州，戴维斯，加州大学戴维斯分校，生物化学与分子医学系摘要在细胞和模型系统中的反常次扩散是一个活跃的研究领域。主要的问题是扩散是反常还是正常，如果是反常，它的机制是什么。这个问题是有争议的，尤其是聚集导致反常次扩散的假设。反常次扩散测量将通过一个实验的标准得到加强。特别是一个能够通过交叉标准加强的不同类型的测量，标准校准标准被提出了。首先，在长度和时间尺度不同的测量下，扩散必须是反常的，长度尺度是根本，时间尺度可以通过介质的粘度调整。第二，标准在理论上必须是易理解的，有一个已知的反常次扩散指数，理想的情况下随时可调。第三，标准必须是简单，重现性好，和有独立的特征（比如，电子显微镜的纳米结构），候选实验标准可以得到评估，包括被阻碍的脂质双分子层；水系统被纳米柱阻碍；一个连续过滤系统，于此在一个普通的数组中的随机选择障碍的规定部分被消融；单行毛孔扩散；在数组中由于颗粒结合，瞬态反常次扩散，比如在随机DNA阵列中的转录因子；计算机生成的物理轨迹。介绍在细胞膜，细胞质和细胞核以及模型系统中大量研究反常次扩散，主要的实验问题是：扩散是异常还是正常，以及用什么参数描述它。主要的理论问题是：什么样的机制造成扩散异常。主题的问题可以通过“不同的机制怎样通过实验区分”联系起来。反常扩散机制及其鉴定都是非常活跃的研究领域。最近的研究开始于Magdziarz和Weron的著作(1)。这个领域是有争议的，尤其是聚集导致反常次扩散的假设。Ho¨fling和Franosch(2)指出“细胞聚集……缓慢的反常运输作为其最独特的指纹可以鉴别……”这种观点可以通过在不同模型系统下的几种实验证明(3–5)；Hellmann等人(6)也赞同上述观点；Dix和Verkman(7)争论“细胞中普遍反常扩散是分子聚集这一观点是不正确的……”并且指出，次扩散可能是可逆光物理过程的一种加工品、细胞自体荧光、或是在束和细胞结构的复杂事物。拥挤模型的实验证实了这种观点：荧光相关光谱（FCS）结果明确表明与正常扩散一致(8-10)。多种方法最直接的比较Shakhov(11)等的NMR研究，Shakhov等在聚集的右旋糖酐中发现正常扩散，就像Banks和Fradin(3)通过FCS发现反常次扩散一样。NMR研究成功地使NMR和FCS的长度尺度重叠、长度尺度的重叠在不同方法下区分交叉和不一致成为可能。两个方面的实验证据都有很大的局限性。一些反对反常次扩散没有正控制，一些反对它没有校准标准。在目前的实践中，通过控制，在简单液体中出现正常扩散，然后观察次扩散是否在实验中出现。在这个领域优先考虑的是设计出对异常次扩散的正控制。在关于模型聚集系统的研究中，扩散的不同可能由于长度尺度、浓度、示踪剂或示踪剂的相对大小的不同导致的，或由于实验材料导致的。有一种通用的标度有利于发现其他的复杂事物。在细胞的研究中，一种物理校准标准可以在实验室里通过减少利用细胞株和蛋白质来解决分歧。这种观点强调荧光测量：FCS(12–14)，漂白后的荧光恢复(FRAP)(15,16)和单粒子追踪(SPT)(17–20)。我们为这些测量假定通常的衍射极限尺度。脉冲梯度自旋回波(PGSE)也被称为脉冲梯度场(PFG)，NMR测量在这里不详细讨论了，但是它们最终是很重要的，因为是独立的扩散测量方法以及非标记分子互作技术。Ka¨rger和Stallmach检测了反常扩散的PGSE，NMR测量方法(21)。反常次扩散反常次扩散是阻碍性扩散，阻力会改变时间依赖性的实际形式，不仅仅是扩散系数的数值。位移的平方<r2>对于正常扩散对于反常次扩散，对于短暂的反常次扩散，t指时间，Do指扩散系数，a是指反常次扩散指数，tCR是交叉时间。换句话说，对于反常次扩散，时间关系是非线性的，是幂律模型；扩散系数是时间关系，不满足中心极限定理的条件(22)。Destainville等人（23）提出一种关于人为的反常次扩散的重要观点。为了改述他们的评论(23)和回复(24)，有2种类型的短暂反常次扩散，是过渡性的和真实的。在过渡性的类型中，一个机制的运作在很短的时间内，另一种是长时间的。比如，Kusumi的栈膜栅栏模型（25），在栈内以一定速度快速短距离的正常扩散由脂质粘度决定，缓慢远程的正常扩散由栈的大小和栈间跳跃率决定的。Destainville等（23）指出，在这两个极限之间，有一段明显的反常次扩散。<r2>和t的单调连续曲线在双对数坐标图有<1的区域。但在真实性的类型中，不同的参数增加反常次扩散的持续时间，适当的限制产生纯异常次扩散。比如，对于一个随机游动的阻碍格，随着障碍物浓度增加到渗流阈值，扩散会在较长的时间里变得更异常。在到达渗流阈值后，扩散会以已知指数一直变得异常。原则上，瞬态反常次扩散是常见的，是障碍物浓度低于逾渗阈值的阻碍扩散造成的；结合模型，有最深的陷阱，相应最长的解决时间；相应性是指较长的时间，不是无限的时间。不幸的是，检测它的工具很少。为了检测瞬态反常次扩散在FRAP,FCS,和PGSE，NMR的影响和验证在SPT的探测，具有可调交叉的实验系统是有帮助的。为什么反常次扩散很重要？第一，它会通过D(t)影响反应动力学。如果假设D是不变的，但事实上随时间变化的，反应物浓度随时间变化的分析是无益的.第二,反常次扩散可以探测亚组织,尽管不可逆。必要条件一个校准标准需要很多条件：条件1该标准作为常用的生物物理测量，必须实施在相同的长度和时间尺度上。所以在光测量、长度较短的超分辨光测量（26，27）、长度较长的条纹图FRA和PGSE，NMR测量下，扩散必须在几毫米和几秒内是异常的。长度规模是根本；时间刻度可通过介质的粘度调节。如果在光测量下是光的波长，我们需要特征尺度的结构。在渗流模拟中，我在周期性边界条件经常使用256x256格。实验晶格常数是采取的是10纳米，在FRAP和FCS测量的适度范围，相应的渗流集群是2.56毫米。如果特点是在以10纳米为中心的5纳米直径，数密度是1x1012/cm2，与孔密度、特征密度有关，或6.35x1012/in与每平方英寸密度的太比特有关。孔径是在介孔的范围，正如IUPAC的定义（28）。对于PGSE，NMR，一个高梯度磁场提供100nm的长度范围，同时被用来研究在双层液态有序/液体无序相分离（29）。对于反蛋白石结构，问题的一个特定方面被Cherdhirankorn（30）等人指出。如果孔隙大小与波束的大小相似，任何一个测量的结果对与孔隙有关的束的确切位置高度敏感。在没有原子模型下，大小的下线是结构应该足够宏观以至于示踪剂和障碍的相互作用可以简单地近似。特征尺寸的选择因此是要权衡的。在扩散测量中，小特征提供更好的平均特征结构，这种相互作用可能成为更复杂的代表。条件2标准必须从理论上易理解，有一个已知的反常次扩散指数，并且理想情况下可调。好理解的机制包括渗滤、连续时间随机游动、相关有限层次机制、孔隙中的单档运动、合成运动和分数布朗运动（尽管其微观机制仍然是一个活跃的研究领域）。机制不应该是一个主要的研究问题，比如，聚合物熔体的表层塌滑。我认为，聚集是一个不完全的理解机制。在几个实验室，重要的实验工作已经完成（3-5,11），但是理论与建模研究仍然是不完整的。你需要知道指数和交叉长度，作为移动障碍物浓度、大小和多分散性的函数以及不动障碍的影响。使用聚集作为校准标准是一种循环论证，但是，对于技术和实验室之间的比较，使用一个Banks、Fradin的异常系统（3）和一个正常的系统（8-10），聚集仍然是有用的。示踪剂和克罗德的扩散应该测量。条件3标准应该是简单，重现性好，和通用的，标准应该是有独立的特征—一个稳定的纳米结构的特征在于电子显微镜的某种形式或一个明确的统计结构。如果聚集能够充分理解被用来作为一个标准，所用的材料应该是可以在市场中买到的，从组合物、分子量和多分散性上易定义的。条件4如果出现瞬态反常次扩散，异常的机制应当延长两或三个数量级，因此，异常机制不同于转变的区域。正常的和异常的机制应该是很容易检测。在理想的情况下，交叉是可调的。数据应从一个时间相关指数方面分析：来显示转换的宽度。条件5对于交叉定标，示踪剂必须通过荧光和核磁共振(NMR)检测。在同一系统做光和核磁共振测量是有优势的，但是不同浓度的要求使它变得困难（31），FCS和SPT实验要求低浓度，FRAP需要适度的浓度，核磁共振(NMR)要求高浓度。条件6介质应该是透明的，无荧光的。不溶性将是有利的，以至于折射率匹配可用于消除散射光。另外一个好处是折射率匹配可以消除介质和示踪剂之间的范德华力（32）。条件7空间均匀性是有优势的，除了由于分形基板（所有尺度上的不均匀性是最重要的）造成的反常次扩散情况外。多样环境使对结果的解释变得复杂，正如，Sanabria等人(33)在研究中指出的运用硅溶胶凝胶作为阻塞扩散模型。条件8荧光不应该长期处于暗状态。评论在本次观点的一个关键思想是可调性—不断改变确定异常扩散指数或交叉时间的一些参数的能力。正如已经提到的，阻碍格中随机运动的调整参数是障碍浓度。Ho¨fling等人(34)关于三维连续体洛伦兹模型给出了调整障碍浓度的一个全面例子。在他们的模拟中，根据牛顿动力学，示踪剂在随机重叠的障碍之间移动，经历了硬球碰撞的障碍。根据障碍物的浓度,在短时间内,运动加速，较长时间里，为次扩散，长时间为扩散。这些模拟获得了log<r2>和logt的曲线，能清楚地显示各种机制，以及他们是如何改变障碍物的浓度。我们需要由于聚集导致反常次扩散的类似的结果。

在文献中的一个标准理念是反常次扩散的FCS曲线和双组分混合物的正常扩散曲线是难以区分的(35–37)。这两种情况可通过最大熵分析区分(38，39)。对于异构系统，最大熵算法产生与FCS数据一致的扩散系数的最广分布。这算法被用来从异常和双组分扩散方面分析实验(3，33)。一致性检查依次展开，其中最大熵谱分析用于测试候选校准标准的均匀性，校准标准是用来测试最大熵分析。这是一个仅基于在单组分和双组分体系的正常扩散的改进实验测试。交叉定标一些文章已报道过光学的交叉定标和正常扩散的核磁共振测量，或通过光学方法。Febo-Ayala(40)等在细胞膜上比较PGSE核磁共振技术和光脱色荧光恢复技术。Grunwald等人(41)指出在水溶液中的两种蛋白质的SPT和FCS扩散系数在数值上相同。为了解决发光量的FCS测量的核心实验问题，Gendron等人(42)在水溶液中通过核磁共振测量各种罗丹明标签的扩散。常用已知的荧光作为校准标准(12)。此外，Stasevich等人(43)用交叉校准FRAP和FCS来量化漂白效果，以及Adkins等人（44）比较在细胞中的FRAP和FCS的扩散。最近在由Feil等人(31)发表的文章中，比较在多孔纳米玻璃中的罗丹明荧光的NMR和SPT测量，这种多孔纳米玻璃事专门为这个实验合成的。这项工作被用来作为遍历假说的实验测试，并且表明在SPT的脉冲液体射流泵时均值差和脉冲梯度场核磁共振整体平均值差相似。正如作者的详细讨论，SPT需要低浓度的示踪剂，同时脉冲场梯度核磁共振需要高浓度，因此测量不能在相同的浓度下进行。但是，在只有一个数量级内的浓度差时，这项工作和我们所做的很相近。候选标准：异常由于篇幅限制，不允许在对于异常次扩散或受阻正常扩散的候选实验标准文章中详细讨论。在这里，我们给出了一个概述。在辅助材料中，我们详细地审查可能的实验系统，从纳米技术、生物物理、软物质物理、工程文献中汇集工作。我们讨论的几何形状，长度尺度，扩散测量，并提供文献中的关键字和出发点。在可能的情况下，我们使用生物物理的例子。这里的讨论和在辅助材料的讨论遵循相同的大纲。在辅助材料中，有广泛的参考文献。对于反常次扩散，我们主要讨论了光学系统的二维情况。对于受阻的正常扩散，我们考虑三维情况。纳米加工技术第一种类型的候选系统是以纳米加工技术为基础，纳米加工技术提供了受阻扩散的多种结构。我们认为纳米点阵列、纳米孔和纳米柱在这里是等效的。在许多情况下，它们中的任何一个都可以用模板制造另一个。这次审查的水平，足够可以确定具有适当特征尺寸、间距、随机性的数组。重点是障碍，而不是流体相。对于非零半径的示踪剂，受阻扩散由被被排除区分数决定，不仅仅是障碍的区域分数，因此，障碍可以通过改变扩散种类的大小来调整。在渗流阈值附近，扩散对障碍的大小高度敏感。规则晶格在平面基板上的纳米球可以自组装成一个三角形晶格，它的顺序受到干燥时毛细管的力影响。纳米阵列可以被用来作为金属沉积或基板蚀刻的模板。由此产生的两维栅栏样结构，被预料可以在栅栏里提供自由的正常扩散和缓慢的正常扩散，同时，异常的次扩散在有限的长度尺度，长度尺度可通过改变示踪剂大小调整。规则排列的平行电化学腐蚀毛孔可以生成。它们可能被用来作为纳米柱的模板，或可以在大量平行单个扩散系统中进行FRAP实验。扰动晶格为了延长反常次扩散的长度尺度，我们考虑扰动晶格结构。一种可能性是多分散纳米微球的自组装体变成不规则栅栏。另一种可能性是嵌段共聚物的自组装体。嵌段共聚物是一类两亲分子，这种两亲分子是由通过共价键链接的两个不同的不相容聚合物组成。共价键使不混溶的聚合物分离以保持聚合物链的长度尺度。一些嵌段共聚物形成胶束的规则排列，胶束可用来制作金属点的一个对应的数组。半导体制造是主要的应用，所以我们在文献中的目标是在硅晶片的长度尺度上制造均匀金属点的晶格。条件规律已被详细研究。对于校准问题，规律性降低。随机纳米结构接下来，我们考虑随机结构。一个用于校准的理想随机结构恰好在阈值时是渗流集群—一个在物理文献中广泛被研究的系统。扩散在所有的长度尺度上是反常的，并且指数是已知的。受阻的脂质双分子层一个解决生物物理问题的重要工具是具有不动障碍的支撑双分子层，比如凝胶相脂质域，固定化的跨膜蛋白，或非双层的纳米加工结构。随机吸附纳米球到目前为止，我们已经考虑纳米球的有序和扰动阵列，但另一种可能性是在基板上使用纳米球的随机沉积，基板粘度很大，以至于微球不能退火形成局部有序的结构。由于溅射造成的渗透渗透集群的一个早期实验成果是在平面基板上的溅射金属。系统的电导率可作为金属沉积量的函数来被测量，导电率为渗流阈值时大幅上升。纳米柱关于所谓的碳纤维纳米柱森林或碳纳米管的大量的工作已经做了，包括在阻碍纳米柱的水相中非常有趣的扩散测量。在障碍晶格中的连续渗流我们提出一个在障碍晶格连续渗流的问题，与标准渗透相关，但可被采用来促进纳米加工。最初，大量规则障碍晶格是由标准纳米技术制造的，比如在极端紫外线下的二维的干涉图样。然后随机选择的障碍被选择性地消融，例如利用聚焦离子束铣。最后，当它是在一个完整的障碍的补丁时，扩散被衡量为足够大的被捕获的示踪剂。由于消融障碍的部分增加，扩散的范围增加，最终，系统达到渗流阈值。渗流阈值可以通过标准的蒙特卡洛方法得到，并且反常次扩散可被描述。一个重要的实验特点是扩散可通过改变示踪大小和障碍晶格间距的比率得到改变。如果系统在示踪剂的渗流阈值，其中示踪剂直径略低于晶格间距，较小的示踪剂将显示瞬态反常次扩散以及较大的示踪剂将被捕获。针孔一种具有随机针孔的薄膜可以作为制作障碍的模板。商业膜商业过滤膜是由核径迹蚀刻或氧化铝的氧化铝产生的。不幸的是，对于校准问题，孔的密度太低，因此将需要定制膜。关于纳米线阵列类似的工作已进行了高密度优化并且可能更适用。三维分形三维分形孔结构可通过三维随机分形的自组装体制造，其中三维随机分形的自组装体可被用来作为生成多孔固体的模板。任意模式纳米技术方法的最后组是能够形成任意模式的完善的种类。它们在制造纳米结构时有优势，因为反常扩散特性在计算机模拟中很好理解，如渗滤集群。缺点是，光刻法受到空间分辨率的限制，并且电子束光刻受到吞吐量的限制。粘合物候选系统的第二种类型以结合一个有限的结合位点的层次结构为基础，其中弱结合位点是常见的，强结合位点是少见的。扩散是瞬时性反常，阻碍层的加层使扩散在较长时间里更反常。有关生物的结合位点阵列，如DNA，蛋白质，适配体可通过标准方法得到，给出所需浓度和结合能的分布。在这里，一个特殊的要求是阵列必须在分子水平上是随机的，没有按照相同的结合位点安排。另外的一个特殊要求是一种初始状态，在该状态中示踪剂不处于结合位点的热平衡中。这种非平衡态可通过示踪剂的快速混合或示踪剂结合位点的光活化产生。如果示踪剂处于结合位点的平衡中，扩散将一直是缓慢的、正常的。毛孔中的单一扩散第三类是基于毛孔中的单一扩散，由它产生了具有固定的1/2指数的一维反常次扩散。由于相关性，扩散是反常的。如果粒子必须在单一文件中移动，一个粒子的运动需要许多相邻粒子的集体运动。合成运动第四类是人工合成的运动，其中，它可以通过在压电阶段增加点荧光基团和驱动使用一些反常次扩散算法阶段直接生成反常次扩散。这种方法的优点是运用了反常次扩散的不同理论机制、测试了整个光学系统的实际响应函数、合成运动测试了离轴畸变的影响。聚合物溶液最后一种系统类型使用聚合物作为示踪剂，障碍，或两者，具体的是，在溶剂中标记的聚合物链，在聚合物溶液中的荧光球体或在聚合物溶液中标记的聚合物链。局限性是反常次扩散的短程和动力学的复杂性。候选标准：正常具有受阻三维正常扩散的标准也是有用的。严格地说，这些可能有过渡反常次扩散的短期阶段，但扩散近似正常。蛋白石蛋白