基因工程原理与技术

基因工程原理与技术授课教师：参考书：

1、《基因工程原理》吴乃虎主编

2、《植物基因工程原理与技术》王关林主编第一章绪论第一节基因工程的概念基因工程(geneengineering)是现代生物技术的核心内容。

基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，是指将一种或多种生物体的基因分离出来或人工合成基因，按照人们的愿望，进行严密的设计和体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞中遗传表达并获得新的遗传性状而形成新的生物类型的生物技术。

基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA体外重组)。基因工程的四大要素(或基本条件)：目的基因、载体、工具酶、受体。

相关名词：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆、基因无性繁殖。基因工程的突出特点：打破物种间基因交流的界限。

第二节基因工程的诞生与发展

基因工程诞生于1973年。一、基因工程诞生的理论和技术基础1、理论基础

①DNA是遗传物质；

②DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；

③遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式。2、技术基础

①限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；

②DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；

③基因工程载体的构建与应用。

二、基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学P.Berg研究小组的DNA体外重组实验。

1973年，斯坦福大学的S.Cohen研究小组的DNA体外重组和大肠杆菌转化实验。(见下两张幻灯片)同年，加利福尼亚大学的H.Boyer也进行了类似的实验。这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973年被定为基因工程诞生的元年。

pSC101抗四环素pR6-5抗卡那霉素DNA连接酶重组DNA分子EcoRI抗卡那霉素基因培养平皿卡那霉素平板四环素\卡那霉素平板大肠杆菌四环素平板三、基因工程的发展

分为艰难阶段、逐渐成熟阶段、迅速发展阶段、鼎盛发展阶段。1、基因工程的艰难阶段(1973~1976，载体和受体系统的安全性改造)

基因工程的安全性问题，导致许多国家限制基因重组的实验。2、基因工程的逐渐成熟阶段(1976~1982，基因工程药物的研制)1976年,Genentech(GeneticEngineeringTechnology)公司成立(byRobertSwansonandHerbBoyer)。

1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽(见下图)；1978年Itakura（板仓）等使人生长激素191肽在大肠杆菌中表达成功；1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中，并通过发酵生产人胰岛素。从而揭开了基因工程产业化的序幕。

大肠杆菌生长激素释放抑制因子重组体+SS基因目的基因基因载体从动物脑中提取5mg---50万只羊脑9升工程大肠杆菌培养液3、基因工程的迅速发展阶段(1982~2000，动植物基因工程育种与基因治疗)

发展了一系列新的基因工程操作技术，构建了多种转化原核生物和动物、植物细胞的载体。

1982年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物——转基因小鼠。

1983年采用农杆菌介导法培育出世界上第一例转基因植物——转基因烟草。1990年美国政府首次批准一项人体基因治疗临床研究计划，对一名因腺苷脱氨酶基因缺陷而患有重度联合免疫缺陷症的儿童进行基因治疗获得成功。1991年，美国提出人类基因组计划并实施。4、鼎盛发展阶段(21世纪)

2005年完成人类基因组计划。至今，基因工程药物上市的有几十种，上百种正在进行临床试验。

转基因植物迅速发展，目前至少有150种转基因植物问世。自从1986年抗除草剂转基因烟草被首次批准进入田间试验以来,至今国际上已有30个国家批准上千例转基因植物进入田间试验,涉及的植物种类达50多种。自从1994年转基因延熟西红柿获准上市以来，目前至少有51种转基因植物上市。

虽然转基因动动物比转基因因植物诞生早早，但其发展展比转基因植植物要慢得多多！主要原因是动动物转基因技技术操作烦琐琐、困难，动动物细胞培养养要求高，不不易再生出个个体。荷兰的GenPharm公司用转基基因牛生产乳乳铁蛋白，预预计每年从牛牛奶生产出来来营养奶粉的的销售额是50亿美元。。英国罗斯林研研究所研制成成功的转基因因羊，其乳汁汁中含有α[1]-抗抗胰蛋白酶，，可治疗肺气气肿病。这种种病在北美比比较常见，病病人以前只能能依赖于注射射人的α[1]-抗胰蛋蛋白酶做替代代疗法，价价格昂贵，而而现在用转基基因羊来生产产，每升这种种羊奶可售6000美元元。中国工程院院院士曾溢涛教教授研究小组组获得5只转转基因山羊。。其中一只奶奶山羊的乳汁汁中，含有堪堪称血友病人人救星的药物物蛋白——有有活性的人凝凝血因子Ⅸ。。第三节基基因工程研研究的主要内内容一、基因工程程研究的主要要内容主要包括：基础研究（载体的研究究、受体系统统的研究、目目的基因研究究、工具酶的的研究、转化化方法的研究究、生物基因因组学研究））和应用研究等。1、载体的研研究构建各种用途途载体及提高高外源基因表表达的效率。。2、受体系统统的研究包括细菌、真真菌、植物、、动物。受体系统的安安全性及转化化效率。3、目的基因因研究目的基因的分分离、克隆及及改造。4、工具酶的的研究开发新的工具具酶。5、转化方法法的研究开发各种受体细胞胞的高效转化化方法。6、生物基因因组学研究具有重要经济济价值的各种种生物的基因因组测序、挖挖掘新的基因因等。7、应用研究包括基因工程程药物研究、、基因疫苗研研究、转基因因植物研究、、转基因动物物研究以及在在酶制剂工业业、食品工业业、化学与能能源工业及环环境保护等方方面的应用。。二、基因工程程的基本操作作程序①分离获得带带有目的基因因的DNA片片段及载体选选择与构建。。②限制性核酸酸内切酶分别别切割外源DNA和载体体。③通过DNA连接酶将外外源基因DNA片段连接接到载体上，，形成重组DNA分子。。④将重组DNA分子引引入到受体细细胞(转化)。⑤带有重组体体细胞(转化体)的扩增及选选择培养。⑥转化体的鉴鉴定，获得外外源基因高效效稳定表达的的基因工程菌菌或细胞。⑦目的基因的的进一步研究究分析，并设设法使之实现现功能蛋白的的表达(基因因功能研究或或基因改造研研究)。三、基因工程程的基本操作作内容基因工程的主主体战略思想想是外源基因因的稳定高效效表达。为达达到此目的，，可从以下几几个方面进行行操作。①选用高拷贝贝载体，增加加外源基因在在受体细胞中中的剂量；②筛选、修饰饰和重组启动动子、增强子子、终止子等等基因的转录录调控元件，，并将这些元元件与外源基基因精细拼接接，强化外源源基因的转录录水平。③选择、修饰饰和重组核糖糖体结合位点点及密码子等等mRNA的的翻译调控元元件，强化受受体细胞中蛋蛋白质的生物物合成过程。。④构建融合表表达载体或分分泌表达载体体，增加外源源蛋白的可溶溶性。第四节基基因工程的的意义与发展展前景一、基因工程程研究的意义义①大规模生产产其他生物体内内含量极微但但却具有较高高经济价值的的生物分子；②设计构建新新物种(新性状乃至全全新物种)；③搜寻、分离离和鉴定生物物体尤其是人人体内的遗传传信息资源(基因)。。二、基因工程程发展前景基因工程问世世以来短短的的三十年，显显示出了巨大大的活力，基基因工程的前前景将更加灿灿烂辉煌。今今后，基因工工程的重点研研究方向是基基因组学、基基因工程药物物、动植物生生物反应器和和环保等方面面。第二章基基因工程程的工具酶工具酶是指基因工程程操作中所使使用的核酸酶酶类。根据其其用途分为四四类：限制性内切酶酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。第一节限限制性核核酸内切酶一、宿主的的限制-修修饰现象(见下图)限制作用(restriction)：指一定定类型的细细菌可以通通过限制酶酶的作用，，破坏入侵侵的噬菌体体DNA，，导致噬菌菌体的寄主主幅度受到到限制。这这是维护宿主遗遗传稳定的的保护机制制。修饰作用(modification)：指寄寄主本身的的DNA，，由于在合合成后通过过甲基化酶酶的作用得得以甲基化化，使DNA得以修修饰，从而而免遭自身身限制性酶酶的破坏。。这是宿主细胞识识别自身遗遗传物质和和外来遗传传物质的作作用机制。。R/M系统统①DNA甲基基化酶②限制性核酸酸内切酶R/M系统统的作用①限制作用②修饰作用1953年年，Arber发现现限制-修修饰现象，，预见限制制性核酸内内切酶的存存在；1970年年，H.O.Smith从流流感嗜血杆杆菌中分离离出第一个个II型限限制性核酸酸内切酶HindII。。Nathans首次次用限制性性酶切割SV40DNA。根据限制-修饰系统统的遗传分分析，大肠肠杆菌K12有以下下4种表型型：①rk+mk+：野生型，，具有完整整的限制和和修饰功能能。②rk-mk+：限制缺陷陷型，不能能降解外源源DNA，，但具有修修饰功能，，这类突变变株经常用用于基因工工程的受体体。③rk-mk-：限制和修修饰缺陷型型，既无限限制功能，，又无修饰饰功能，也也常用于基因工程的的受体。④rk+mk-：修饰缺陷陷型，缺乏乏修饰自身身DNA的的功能，但但具有限制制功能，故故也称为““自杀性表表型”(suicidephenotype)。特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶分子结构功能辅助因子识别序列切割位点切割方式应用价值举例异源三聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列距识别序列1kb处随机性切割无EcoK、EcoB同源三聚体限制Mg2+

4-6bp回文序列识别序列内或附近特异切割广泛EcoRI、HindIII…异源二聚体限制与修饰ATPMg2+SAM非对称序列识别序列下游24-26bp处随机性切割小EcoPI三、限制性性核酸内切切酶的命名名1973年年H.O.Smith和D.Nathams提提出命名系系统，1980年Roberts在此此基础上进进行了修改改。①限制性核核酸内切酶酶第一个字字母(大写，斜体体)代表该酶酶的宿主菌菌属名(genus)第一个个字母；第第二、三个个字母(小写，斜体体)代表宿主主菌种名(species)前两个字字母。②第四个字字母代表宿宿主菌的菌菌株名的第第一个字母母(小写，正体体)或染色体体外成分(质粒或噬噬菌体，大写，正体体)。③若从一种种菌株中发发现了几种种限制性核核酸内切酶酶，即根据据发现和分分离的先后后顺序用罗罗马字母表表示(正体)。Haemophilusinfluenzaed流感嗜血杆杆菌d株HindⅡHindⅢ四、II型限制性核核酸内切酶酶的基本特特性1、II型型限制性内内切酶的识识别序列一般为4～～6bp的的回文序列列。也有6bp以上上的，如NotI，称为稀有切割限限制酶。有些为反向重复序序列(间断断回文序列列)，如SfiI。有些II型型限制酶的的识别序列列中，某一一位或二位位碱基并非非严格专一一，如HindII可可识别4种核苷酸酸序列。酶识别序列酶识别序列BamHIG↓GATCCPstICTGCA↓GBglIIA↓GATCTSalIG↓TCGACEcoRIG↓AATTCSau3AI↓GATCHindIIGTPy↓PuACSfiIGGCCNNNN↓NGGCCHindIIIA↓AGCTTSmaICCC↓GGGKpnIGGTAC↓CXbaIT↓CTAGANotIGC↓GGCCGCXhoIC↓TCGAG2、II型型限制性核核酸内切酶酶的切割方方式大多数II型限制性性核酸内切切酶均在其其识别位点点内部切割割双链DNA，水解解磷酸二酯酯键中3’’位的酯键键，产生3’端为羟羟基、5’’端为磷酸酸基团的片片段。有三三种切割方方式：①在识别序序列的对称称轴的5’’末端切割割，产生5’黏性末末端，如EcoRI②在识别序序列的对称称轴的3’’端切割，，则产生3’黏性末末端，如PstI③在识别序序列的对称称轴上切割割，产生平平头末端，，如PvuII有些识别序序列为间断断型回文序序列的II限制酶，，其切点位位于不确定定核苷酸中中，如：BglIGCCNNNN↓NGGCSfiIGGCCNNNNN↓NGGCCXmnIGAANN↓NNTTC有极少数II型限制制性核酸内内切酶的切切割位点远远离识别序序列，如MboII识别GAAGA序序列，切割割位点则是是：5’－GAAGANNNNNNNN↓N－－3’3’－CTTCTNNNNNNNN↓N－5’’同裂酶是指识别序序列相同、、切割方式式相同或不不同、来源源不同的II限制性性核酸内切切酶。如：HpaII与MspI的识别序序列和切割割位点都相相同(C↓↓CGG)，但MspI还可以识识别已甲基基化的序列列CmCGG；SmaI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓↓CCGGG)，识识别序列相相同，但切切割位点不不同。同尾酶是指来源各各异、识别别序列不同同，但产生生相同的黏黏性末端的的II限制制性核酸内内切酶。如：BamHI(5’-G↓GATCC-3’)BglII(5’-A↓↓GATCT-3’’)3、II型型限制性核核酸内功酶酶不具有甲甲基化功能能如EcoRI限制性核核酸内切酶酶与EcoRI甲基化酶酶，两者均均识别GAATTC序列，而而前者能对对G↓AATTC序序列进行切切割，后者者的作用是是使第二个个A甲基化化。目前已已经分离到到许多II型限制性性核酸内切切酶与其对对应的甲基基化酶。4、II型型限制性核核酸内切酶酶对单链DNA的切切割有一些II限制性核核酸内切酶酶，除双链链DNA外外，还可以以特异识别别并切割单单链DNA的相应位位点，只是是切割效率率比较低。。如HhaI能切割单链链噬菌体ФФX174和M13mp18DNA，只是是切割单链链DNA比切割双双链DNA效率低低50％。。五、Ⅱ限制制性核酸内内切酶的主主要用途①产生具有有相同粘性性末端的DNA片段段，以便重重组克隆；；②建立DNA分子的的限制酶图图谱；③构建基因因文库；④构建载体体。六、II型型限制性核核酸内切酶酶的酶切反反应1、标准酶解体体系的建立立反应体积一一般为20μl(根据DNA量可可适当扩大大)。①10×酶切切缓冲液2μl(大部分分酶反应缓缓冲液基本本相似：50mmol/LTris-HClpH7.0~7.5、0~100mmol/LNaCl、10mmol/LMgCl2、1mmol/LDTT)②酶(根据酶活活力大小及及工作性质质确定酶量量，不超过过反应总体体积10％％③DNA样品品(μg~mg)④无菌水限制性核酸酸内切酶的的一个活力单单位(U)为：：在合适的的温度和缓缓冲液中，，在20μL反应体系系中，1h完全降解解1ug标准DNA所需需要的酶量量。2、酶解反反应①混匀②酶解(温温度、时间间)③酶解鉴定定④终止a、加EDTA至至10mmol/L；b、加SDS至0.1%(W/V)；；c、65℃℃水浴保温温20min(有些些最适反应应温度较高高的酶不能能使之完全全失活，如如AceIII、BelI、BstXI、TaqI)；d、酚/氯氯仿抽提酶酶，乙醇沉沉淀DNA3、限制性性核酸内切切酶对DNA的不完完全酶解(见下图)不完全酶解解对于构建建物理图谱谱和基因组组文库是非非常必要的的。其方法法有减少酶酶量、增加加反应体积积、缩短反反应时间和和降低反应应温度等。。incomplete1231+3incompletedigestion123SmaIcomplete1+2+34、Ⅱ限制制性核酸内内切酶操作作的注意事事项①商品化的的限制性核核酸内切酶酶均为浓缩缩液，每次次操作时应应使用新的的吸头去取取酶；②加入酶的的体积应不不超过总体体积的10%，否则则酶液中的的甘油浓度度超过5%时将会抑抑制酶的活活性；③整个操作作应在0℃℃进行，即即在冰浴中中进行，而而且是在加加入其它试试剂之后，，最后加入入酶；④尽可能使使反应体积积减到最小小，即尽可可能少加水水；⑤当切割大大量DNA时，通常常采用延长长反应时间间，减少酶酶的用量；；⑥当DNA需2种或或以上酶切切时，应用用通用缓冲冲液。若没没有通用缓缓冲液时，，只有用1种酶切完完后，纯化化酶切产物物，再进行行下一个酶酶切反应。。七、影响限限制性核酸酸内切酶活性与酶切效果的因素1、酶的纯度；要求不存在在其他核酸酸内切酶或或外切酶的的污染。2、DNA样品品的纯度；DNA样品品中的蛋白白质、苯酚酚、氯仿、、乙醇、EDTA、、SDS、、高NaCl等，都都能抑制酶酶活性。样样品中DNase会降解DNA，影影响酶切。。3、酶切反应的的温度、时间；多数II型型限制酶最最适反应温温度是37℃，但SmaI为25℃℃或30℃℃，SfiI为50℃℃，TaqI为65℃℃。反应温度过过高或过低低都会影响响酶活性，，甚至导致致酶失活。。4、DNA的甲甲基化程度度；限制性核酸酸内切酶不不能切割甲甲基化的核核苷酸序列列。这一特性有有特殊用途途：①改变变某些限制制性核酸内内切酶的识识别序列；；②产生新新的限制酶酶识别序列列；③保护护限制性核核酸内切酶酶的切点；；④利用一一些同裂酶酶对甲基化化的敏感性性不同，研研究细胞DNA位点点专一性甲甲基化的程程度和分布布。大肠杆菌中中的DNA腺嘌呤甲甲基化酶(dam)在5’GATC3’序列中中的腺嘌呤呤N6位引入甲基基，受其影影响的酶有有BclI、MboI等，但但BamHI、BglII、Sau3AI不不受影响。。大肠杆菌中中的DNA胞嘧啶甲甲基化酶(dcm)在在5’CCAGG3’或5’’CCTGG3’序序列中的胞胞嘧啶C5位上引入甲甲基，受其其影响的酶酶有EcoRII等，，但BglI、KpnI不受影响响。采用去甲基化酶酶的大肠杆杆菌菌株来制备质粒粒DNA，，可防止DNA的甲甲基化。5、DNA分子子的构型限制性内切切酶对不同同构型DNA分子的的酶切效果果是不同的的，例如超超螺旋DNA酶解所所需要的酶酶量，比线线性DNA酶解所需需要的酶量量高许多，，甚至可高高达20倍倍。有些限制性性核酸内切切酶对于同同一DNA分子上上不同位置置的识别序序列，切割割效率明显显不同。例例如，EcoRI、HindIII对λDNA的酶切切。6、反应缓冲液液主要成分：：pH(Tris-HCl)、离子强强度(NaCl)、、Mg2+；辅助成分：：β-巯基基乙醇或二二硫苏糖醇醇(DTT)防止酶氧化化；牛血清蛋白白(BSA)组分V对于某些些酶是必需需的，可防防止酶在低低浓度蛋白白质溶液中中变性。星号活性是指在极端端非标准反反应条件下下，限制性性核酸内切切酶能切割割与特异识识别序列相相似的序列列的特性。。例如EcoRI在高pH(＞8)、低盐盐(50mmol/L)和高高浓度甘油油(＞5％％)存在的的情况下，，其识别序序列由GAATTC改变为NAATTN。以EcoRI表示其星号号活性。引起星号活活性的原因因有：①高甘油油含量，大大于5%；；②酶用量量过大，大大于100U/微克克DNA；；③低离子子强度，小小于25mmol/L；④④高pH，，大于8.0；⑤含含有机剂，，如乙醇、、二甲基亚亚砜、二甲甲基乙酰胺胺等；⑥Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离离子的存在在。常发生星活活性的内切切酶有：EcoRI、HindⅢ、KpnI、PstI、SalI、HinfI等。第二节DNA连接酶1967年年几个实验验室几乎同同时发现DNA连接接酶。一、定义与与反应机理理DNA连接接酶是指能催化化双链DNA分子内内或分子间间的5’-磷酸基和和3’-羟羟基生成磷磷酸二酯键键而使DNA链连接接的一类酶酶。大肠杆菌和其他细菌：NAD+动物细胞和噬菌体：ATPT4DNA连接酶酶连接DNA/RNA杂合分分子中DNA链的切切口DNA连接酶无连接DNA连接接酶的作用用机理二、DNA连接酶的的种类1、T4噬噬菌体DNA连连接酶(T4DNA连连接酶)T4DNA连接酶DNA/RNARNA平头末端的的Km比黏黏性末端的的Km高约约1000倍。提高高平头末端端连接效率率的方法：：①加大酶浓度(10~100倍于粘性末末端)；②加大底物浓浓度；③加入适量的的一价阳离离子(150-200mmol/LNaCl)；④加入低浓度的PEG(10%PEG8000)。ATP的最适终终浓度为0.5mmol/L。2、大肠杆杆菌DNA连接酶E.coliDNA连接酶DNA/RNAE.coliDNA连接酶无连接3、T4噬噬菌体RNA连接酶酶用途：RNA末端标标记pNpNNNNT4RNA连接酶三、DNA连接酶的的反应体系系DNA连接接酶的活性性单位较通通用的是韦氏(Weiss)单位，一个韦氏氏单位是指指在37℃℃，20min内内催化从γγ,β-32P-ATP的焦磷酸酸根置换出出1nmol32P所需要的的酶量。M-L单位位：以d(A-T)n作为底底物黏性末端连连接单位：：以λDNA/HindIII片段为底底物一个韦氏单单位相当于于0.2个个M-L单单位或者60个黏性性末端连接接单位。反应体系：10μL或或20μL，DNA片段段，连接酶，Buffer，温度(12~16℃或<30℃)，时间(4~16h)Buffer：50mmol/LTris-HClpH7.6，10mmol/LMgCl2，0.5mmol/LATP，5mmol/LDTT四、影响连连接反应的的因素1、DNA末端的浓浓度连接产物的的分子构型型(线形或环状)与DNA浓度及DNA分子子长度存在在密切关系系。在一定定浓度下，，小分子DNA片段段进行分子子内连接，，有利于形形成环化分分子。对于于长度一定定的DNA分子，其其浓度增加加有利于分分子间连接接。此外，，分子间连连接还与两两种片段的的末端浓度度的比例有有关。原则则上一种片片段的浓度度大于另一一一种片段段的浓，如如：在克隆隆中，插入入片段:载载体片段=2:1。。2、反应温度介于最适温温度与其Tm之间。。＞30℃℃会导致T4DNA连接酶酶的不稳定定。3、ATP浓度ATP最适适的终浓度度为0.5mmol/L，浓浓度过高会会抑制连接接。第三节DNA聚聚合酶DNA聚合合酶分为：：①依赖于于DNA的的DNA聚聚合酶；②②依赖于RNA的DNA聚合合酶。常用的DNA聚合酶酶：大肠杆杆菌DNA聚合酶I、Klenow片片段酶、T4噬菌体体DNA聚聚合酶、T7噬DNA聚合酶酶、TaqDNA聚合酶、、逆转录酶酶。酶聚合反应速度5’→3’外切酶活性3’→5’外切酶活性持续合成能力E.ColiDNA聚合酶I中速有低低Klenow酶中速无低低T4DNA聚合酶中速无高低T7DNA聚合酶快速无高高修饰T7DNA聚合酶快速无低或无高TaqDNA聚合酶快速有无高逆转录酶低速无无中一、大肠杆杆菌DNA聚合酶I5’→3’聚合酶活性5’→3’外切酶活性：双链DNA带磷酸基团的5’端或DNA/RNA杂合分子中的RNA5’端3’→5’外切酶活性切口平移作作用DNAPolI主要用途：：切口平移法法制备DNA探针反应体系：：在25μμl反应体体系中含有有1μg纯化的特特定DNA片断，并并加入适量量的DNaseＩ、、PolＩＩ、α-32p-dNTPs和未未标记的dNTPs。DNaseI，Mg2+PolI，α-32p-dCTP，dNTPs二、Klenow片片段Klenow酶具有有5’→3’聚合合酶活性和和3’→5’外切切酶活性，，缺失5`→3`核酸外切切酶活性。。其主要用用途如下：：①补平限制性性核酸内切切酶产生的的5’黏性性末端；②标记3’’凹陷末端端的DNA分子或平平末端；DNA末端端标记一般般标记活性性不高，极极少用于分分子杂交探探针的标记记，主要用用于DNA序列测定定等所需片片段的标记记。③合成cDNA第二链链；④双脱氧末端端终止法测测定DNA序列；⑤在单链模板板上延伸寡寡核苷酸引引物，以合合成杂交探探针和进行行体外突变变。平末端标记记三、T4噬噬菌体DNA聚合酶酶具有5’→→3’聚合合酶活性和和3’→5’外切切酶活性，，缺少5’’→3’外外切酶活性性。其3’’→5’外外切酶活性性比Klenow酶酶高100~1000倍。在无dNTP时，可可以从任何何3`-OH端外切切(即可可降解dsDNA，，只是其活活性比ssDNA低低很多)，，在只有一一种dNTP时，外外切至互补补核苷酸，，在四种dNTP均均存在时，，聚合活性性占主导地地位。T4DNA聚合酶的置换合成作用无dNTP时，T4DNA聚合酶有dNTP时，T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶酶的用途：：①切平核酸酸内切酶产产生的3’’黏性末端端②末端标记记。特别是是不需要核核酸外切酶酶帮助就可可进行平末末端标记，，这种探针针标记方法法称为置换(取代)合成法。置换合成法法将产生一一组末端完完全标记、、而从末端端到中点其其标记量递递减的分子子。四、T7噬噬菌体DNA聚合酶酶与测序酶酶T7DNA聚合酶酶具有5`→3`聚聚合酶活性性及很强的的单链、双双链DNA的3`→→5`外切切酶活性，，但无5`→3`外外切酶活性性。其最大大特点是有有最强的持持续合成能能力。其用用途如下：：①用于长模板板(M13DNA)的引物延伸伸；(不受DNA二级级结构的影影响，聚合合能力较强强可延伸合合成数千个个核苷酸)②通过延伸或或取代合成成法标记DNA3’’末端；③将双链DNA的5’’或3’突突出末端转转变成平末末端的结构构。对天然的T7DNA聚合酶酶进行修饰饰，使之降降低或完全全失去3’’→5’的外切切酶活性，，而聚合酶酶活性增加加了3倍。。因此，修饰的T7DNA聚合酶主主要用于双双脱氧测序序，又称作为为测序酶。此外，还还用于末端标标记、探针针制备(可催化较低低水平<0.1μμmol/L的dNTP参参入)、体外诱变中中DNA链的合成。。五、TaqDNA聚合合酶TaqDNA聚合合酶具有5’→3’’聚合酶活活性和5’’→3’外外切酶活活性，缺少少3’→5’外切切酶活性。其最大特特点是热稳定(95℃以上上高温半小小时不失活活)，最适反应温温度高(7075℃)。因此，，其主要用途途是PCR及DNA测序(具有二级级结构的DNA)。。保真的PCR酶有有TmaDNA聚合合酶(Thermotoamaritima海栖热袍菌菌)、TliDNA聚合合酶(Thermococcuslitoralis海栖热球菌菌)、PfuDNA聚合合酶(Pyrococcusfuriosus激烈火球菌菌)、PwoDNA聚合合酶(Pyrococcuswoesi沃氏火球菌菌)。六、逆转录录酶①5’→3’聚合酶酶活性。逆逆转录酶能能以RNA或DNA为模板合合成DNA分子，但但是后者的的合成很慢慢；②RNA酶酶H活性。。能从5’’或3’方方向特异地地降解DNA/RNA杂交分分子中的RNA链。。商品化的逆转转录酶主要是是鸟类骨髓母细细胞瘤病毒(avianmyeloblastosisvirus，AMV)逆转录酶酶和Moloney鼠白血病病毒毒(Moloneymurineleukemiavirus，，Mo-MLV)逆转转录酶。其用途有：①合成cDNA第一链，构构建cDNA文库；②RT-PCR；③以RNA为为模板制备DNA探针；；④补平和标记记5’-末端端突出的DNA片段；⑤代替Klenow酶用用于DNA序序列分析。第四节修修饰酶一、末端脱氧氧核苷酸转移移酶(末端转移酶)末端转移酶能能在二价阳离离子作用下，，催化DNA的聚合作用用，但不需要模板板，将脱氧核糖糖核苷酸加到到DNA分子子的3’-OH末端。AAAAAAMg2+dATP末端转移酶效率高Co2+dATP末端转移酶AAAAAAAAAAAAAAAAAAA效率低用途：①给载体和和外源DNA(如cDNA或随机切割DNA)接上同聚物物尾，以便连连接；②末端标记二、核酸酶核糖核酸酶(RNase)：水解RNA脱氧核糖核酸酶(DNase)：水解DNA核酸酶(nuclease)：水解RNA和DNA(一)核糖糖核酸酶1、核糖核酸酸酶A(RNaseA)RNaseA是一种内切核糖核酸酸酶，可特异攻击击RNA上嘧啶残基的3’端磷酸酯酯键。其反应条件件极宽，且极极难失活。在在低盐浓度(0~100mmol/LNaCl)下，RNaseA切割单链链和双链RNA、DNA/RNA中中的RNA；；当NaCl浓浓度为300mmol/L或更高高时，RNaseA就就特异性切割割单链RNA。RNaseA的用途:①确定RNA或DNA中中的单碱基突突变的位置；；②通过RNA杂交技术检检测特定RNA(特异降解单链链RNA，对对杂交双链RNA不起作作用)，较northern杂交灵敏敏；③转录起始点点及内含子剪剪接位点的分分析，其灵敏度比S1核酸酶分析法法高数倍；④降解DNA样样品中的RNA分子。2、核糖核酸酸酶T1RNaseT1也是是一种内切核糖核酸酸酶，可特异攻击击RNA上鸟嘌呤残基的的3’端磷酸酸酯键。其催化活性性与用途类似似于RNaseA。3、核糖核酸酸酶HRNaseH特异地降解DNA/RNA杂交双链链中的RNA链，产生具有3’-OH和和5’-磷酸酸末端的寡核核苷酸和单核核苷酸，不能能降解单链或或双链的DNA或RNA。其用途是产生cDNA第二链合成成的引物。RNaseHPolIdNTPPolIdNTPDNA连接酶(二)脱氧核糖核酸酸酶IDNaseI是一种内切脱脱氧核糖核酸酸酶，可从嘧嘧啶核苷酸5’-端磷酸酸随机降解单单链或双链DNA，生成成具有5’-磷酸末端的的寡核苷酸。。Mg2+Mn2+用途：①产生大肠肠杆菌DNA聚合酶I切切口平移的切切口；②在Mn2+存在下，产生生构建基因因组文库的大大片段DNA；③DNasel足迹法测测定DNA结结合蛋白在DNA上的精精确结合位点点；④除去RNA样品中的的DNA。(三)S1核酸酶作用特点：①需要Zn2+和酸性条件(pH4.0~4.5)；②降解单链DNA或RNA，但降解解DNA的速速度大于降解解RNA的速速度(7倍)；③降解方式为为内切和外切切，内切为主主；④酶量过大时时也可降解双双链核酸，为为单链的1/75000。用途：①切掉DNA片段的单链链突出末端产产生平头末端端；②在双链cDNA合成时时切除发夹环环结构；③S1核酸酶作作图分析。如内含子的数数目、大小、、位置分析及及转录起始位位点与终止位位点分析等。。内含子数量及及大小的分析析DNAmRNA分子杂交RERES1核酸酶变性凝胶电泳MABM：分子量MarkerA：未经S1酶处理B：经S1酶处理但不能定位内内含子转录起始点的的定位分析RERERE酶切碱性磷酸酯酶酶多核苷酸激酶酶**变性后与mRNA杂交*S1核酸酶*变性凝胶电泳泳MAB三、核酸外切切酶核酸外切酶(exonuclease)是一类类从多核苷酸酸链的末端开开始逐个降解解核苷酸的酶酶。单链核酸外切酶：E.coliexoⅠ、exoⅦ双链核酸外切酶：exoⅢ单双链核酸外切酶：Bal31核酸酶1、大肠杆菌菌核酸外切酶酶VII3’→5’外切酶酶活性5’→3’外外切酶活性用途:①抹平DNA末端；②②回收dA/dT接尾克克隆的cDNA。2、大肠杆菌菌核酸外切酶酶III3’→5’外切酶酶活性ExoIIIMg2+核酸外切酶活性PPExoIIIMg2+3’磷酸酶活性ExoIIIMg2+

ssDNA无反应无嘌呤或无嘧啶位点ExoIIIMg2+核酸内切酶活性RNA/DNA构建单向缺失失突变体库3’突出黏性性末端5’突出黏性性末端ExoIIIS1核酸酶克隆单向缺失突变体克隆3、Bal31核酸酶酶Bal31核酸酶酶主要为3’’外切酶活性性，同时伴有有5’外切及及较弱的内切切活性，需要要Mg2+和Ca2+。①对于单链DNA，具有有特异的内切切酶活性，可可从3’-OH末端迅速速降解DNA，而5’端端切割速率较较慢；②对于双链DNA，具有有3’→5’’外切酶活性性和5’→3’外切酶活活性，以3’’外切酶活性性迅速降解一一条链，随后后在互补链上上进行缓慢的的5’端内切切反应，产物物大部分为5’端突出5个碱基的双双链分子(80%~90%)，少量量为带平头末末端的双链分分子(10%~20%)。对双链RNA分子也也能发生类似似反应；③当共价闭合合环型双链DNA上出现现单链缺口时时，通过其内内切酶活性，，将其切开成成线性双链DNA，并按按上述方式进进一步降解。。用途：与ExoIII相同，构建建双向缺失突突变体库，分分析大片段DNA。四、T4噬菌菌体多核苷酸酸激酶催化ATP的的γ-磷酸基基团转移到单单链或双链的的DNA或RNA的5’’-OH末端端。催化速度：双链>单链链>双链切口口或缺口；5’突出末端>平平末端>5’凹陷末端。T4多核苷酸激酶的激酶活性(正向反应)交换反应(过量ADP存在时)T4多核苷酸酸激酶的3’’磷酸酶活性性PPPPPPPNpPNPOHNpOHNOHOHT4多核苷酸激酶Mg2+pH6.0T4多核苷酸酸激酶的用途途①DNA的5’末端标记记(如DNA的化化学测序)；②使DNA5’末端磷酸酸化，以便连连接(如衔接头的克克隆方式)。

+五、碱性磷酸酸酶催化核酸分子子的脱磷作用用，使DNA或RNA或或核苷酸的5’磷酸变为为5’-OH末端。细菌碱性磷酸酸酶(BAP)、小牛肠碱性磷磷酸酶(CIP)CIP的活性性比BAP高高10~20倍，反应后后易失活(68℃10min)碱性磷酸酶的的用途①5’末端标记记前的处理；②去除载体片段段的5’磷酸酸基因，防止止载体自身连连接。基因工程中常常用的工具酶酶工具酶功能限制性核酸内切酶特异切割DNA，产生具有特定末端的DNA片段DNA连接酶DNA片段间连接，产生重组DNA分子DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子切口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等TaqDNA聚合酶PCR反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或末端标记碱性磷酸酶防止载体自身连接末端转移酶同聚物加尾连接9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Thursday,December29,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。11:16:5311:16:5311:1612/29/202211:16:53AM11、以我独沈沈久，愧君君相见频。。。12月-2211:16:531