生物化学Ⅱ核酸

第四节核酸的性质一、一般物理性质二、核酸的水解三、核酸的两性性质四、核酸的紫外吸收性质五、变性、复性与杂交1、DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）2、DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。

DNA核蛋白RNA核蛋白0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-一、一般物理性质3、DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。4、核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。一、一般物理性质1酸水解碱水解酶水解二、核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解

1酸水解

糖苷键和磷酸键都能被酸水解,糖苷键比磷酸键更容易

嘌呤碱的糖苷键比嘧啶的对酸更不稳定,最不稳定是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键二、核酸的水解

2碱水解

DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解。

例如，室温条件下，在0.1mol/LNaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解；DNA在同样条件下则不受影响。但温度100度时，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。二、核酸的水解

二、核酸的水解

3酶水解

磷酸二酯酶:非特异水解磷酸二酯键核酸酶:特异水解核酸的磷酸二酯键

按底物分类:脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶

按底物作用的方式:核酸外切酶和核酸内切酶按磷酸二酯键断裂方式:3’OH与磷酸间;5’OH与磷酸间其他分类:双链酶,单链酶三、核酸的两性性质核酸含酸性的磷酸基团，又含弱碱性的碱基，为两性电解质，可发生两性解离，核酸的等电点比较低（DNA的等电点为4-4.5，RNA的等电点为2-2.5(低)。（核酸在其等电点时溶解度最小）核酸相当于多元酸，pH大时，呈阴离子状态；---向阳极迁移在核酸在260nm附近有最大吸收峰；据此特性可以定性和定量检测核酸。蛋白质在280nm有一定的吸收峰，因此利用D260/OD280比值可判断核酸样品的纯度。四、紫外吸收减色效应：核酸的光吸收值通常比各核苷酸成分的光吸收之和少30%-40%，这是有规律的双螺旋结构中碱基紧密堆积到一起造成的，此现象称为DNA减色效应。五、变性、复性与杂交（一）、DNA的变性1、概念2、变性因素3、变性的指标1、概念是指核酸双螺旋区的氢键断裂，双螺旋解开，变成无规则线团的现象。核酸变性其分子中的共价键并没有破坏，分子量也不改变，核酸的变性（denaturation

）2、DNA的变性的因素

温度升高；酸碱度改变、pH（>11.3或<5.0）；有机溶剂如甲醛和尿素、甲酰胺等；各种射线低离子浓度3、DNA的变性指标

1）熔解温度（MeltingTemperature,Tm）：DNA热变性发生在一个很窄的温度范围内，通常把热变性过程中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度。（一般DNA的Tm值在80-95C之间）

Tm与下列因素有关：

核酸的均一程度，均一性越高的样品，变性过程的温度范围越小。

Tm与G-C含量成正比。（（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44）

Tm与介质离子强度成正比。mol/LKCl温度/0CA2600.020.11.0

2）增色效应：天然DNA分子从双螺旋结构变为单链状态时，它在在紫外光260nm波长处的吸收值明显增加，此现象称为增色效应。1）熔解温度（Tm）：RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%.而RNA变性后，约增加1.1%。A260值增加粘度下降浮力密度增大分子量不变4.DNA变性后的表现（二）、DNA的复性1、概念：变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性；DNA的复性图示2、影响DNA的复性的因素分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。DNA的复性需要一定的盐浓度，增加盐浓度，复性速度加快将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。即淬火。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)

退火温度＝Tm－25℃（三）、分子杂交热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。

DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。SouthernBlot：DNA-DNA杂交NorthernBlot：DNA-RNA杂交

PCR技术核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。分子杂交的种类SouthernBlot：DNA-DNA杂交NorthernBlot：DNA-RNA杂交WesternBlot：抗原-抗体进行杂交原位杂交：活体组织上进行杂交，显出荧光第一节概述第二节核酸的化学组成第三节核酸的分子结构第四节核酸的性质

第五节核酸的研究方法第五节核酸的研究方法

一核酸的分离、提纯和定量测定二核酸的凝胶电泳三序列测定四PCR

五化学合成第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定

(一)核酸的分离、提纯

(二)定量测定第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定

(一)核酸的分离、提纯

1、DNA2、RNA目前分离DNA方法：盐抽提，用苯酚和氯仿去蛋白

SDS/CTAB

氯化铯密度梯度离心SDS法小量制备植物基因组DNA的原理

在含有去污剂，如SDS或CTAB的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组DNA，通过氯仿/异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组DNA分配在水相中。然后用乙醇(或异丙醇)将水相的DNA分子沉淀出来，最后溶于TE缓冲液或纯水中备用。剪取新鲜的植物叶片约20mg，剪碎置于1.5ml离心管中；向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；在液氮蒸发去2/3时，用自制研杵迅速磨碎叶片；立即加入300uL65℃预热的提取液摇匀，于65℃水浴约1hr，其间摇动数次；加等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，于12000rpm离心5分；转移上清液到另一干净1.5ml离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置2min，14000rpm离心5min；倾去上清液并用200uL预冷乙醇（70%）清洗DNA沉淀，14000rpm离心5min；用枪头小心吸去乙醇，自然风干DNA后溶于50uLddH2O中，置-20℃保存备用。植物基因组DNA的小量快速制备方案

2、RNA注意：用高温（180度）或DEPC处理加入RNasin第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定

(一)核酸的分离、提纯

(二)定量测定(二)定量测定

紫外分光光度法定磷法

定糖法

定磷法:磷含量相对恒定,(RNA9.4%;DNA9.9%)

有机磷水解成无机磷用浓硫酸或过氯酸磷酸+钼酸磷钼酸酸性条件还原剂钼蓝660nm光密度与磷含量成正比定糖法

(核酸含糖)

糠醛+与甲基苯二酚(地衣酚)鲜绿色(最大670nm)RNA+盐酸加热糠醛FeCl3催化剂DNA酸性溶液+二苯胺加热蓝色化合物(最大595nm)第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定

二核酸的凝胶电泳三序列测定四PCR

五化学合成

二核酸的凝胶电泳

（一）琼脂糖凝胶电泳（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳

DNA的凝胶电泳检测

通常，琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被用于核酸的分离研究、鉴定和纯化DNA分子。也可以用于蛋白质与核酸相互作用的研究。琼脂糖从红色海藻琼脂中提取的良好电泳介质，是D-和L-半乳糖残基通过和糖苷键交替构成的一种线状聚合物，琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。其密度由琼脂糖的浓度决定。DNA的凝胶电泳检测

（一）琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物操作简单、快速，且分离范围广

DNA在琼脂糖凝胶的迁移速度

1、核酸分子本身的大小：同分子的摩擦系数成反比的2、琼脂糖的浓度：迁移率与胶浓度成反比3、DNA的构型：超螺旋（I）、环状（II）、线状（III）4、所用的电压一般不大于5V/cm,一定范围内呈正比5、电泳缓冲液溴化乙锭(ethidiumbromide，简称EB)是一种核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300nm波长的紫外光照射下放射出橘红色的荧光，可用来显现凝胶中的核酸分子。在凝胶电泳中，溴化乙锭染料可对核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地检测出凝胶介质中DNA谱带。安全警示：EB是一种强的DNA诱变剂，使用时尽量避免触及皮肤。电泳时有时使用到较高的电压，要小心触电。DNA的凝胶电泳检测

DNA的琼脂糖凝胶电泳检测

+-仪器电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；药品Agarose、loadingbuffer、TBEbuffer、

EB（溴化乙锭）;上样缓冲液（6X）配方

0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯氰醇、

40%蔗糖；水溶液4℃保存。不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围琼脂糖浓度（％，W/V)DNA分子的有效分离范围（kb)0.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-2PCR扩增结果分析举例M1234567MM,marker;1-2,PCRforCP4-EPSPSgene;3-4,PCRfor35SPromoter;5-6,PCRforlectingene;7,Negtivecontrol.聚丙烯酰胺凝胶：在由TEMED(N、N、N`、N`-四甲基乙二胺)催化过硫酸胺还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线形长链，在交联剂N，N’-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯酰胺的交联链形成三维带状网格结构，链长和交联的程度就决定了凝胶的孔径，同时也决定了分离DNA的能力。聚丙烯酰胺凝胶琼脂糖凝胶制胶一般将EB直接加入而聚丙烯酰胺凝胶制胶时不能将染料加入，会影响聚合。<1000bp第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定二核酸的凝胶电泳

三序列测定四化学合成五PCR三序列测定

1DNA酶法测序

2DNA的化学法测序

3RNA的测序

DNA酶法测序

Sanger

于1975年设计快速测序方法”加减法”三序列测定

1DNA酶法测序

2DNA的化学法测序

3RNA的测序

2DNA的化学法测序

Maxam和Gilbert

于1977年发明基本原理:特异化学试剂作用与DNA分子中的不同碱基,然后切断反应碱基的多核苷酸链3RNA的测序第五节核酸的研究方法一核酸的分离、提纯和定量测定二核酸的凝胶电泳三序列测定

四PCR

五化学合成DNA聚合酶链式反应

Thepolymerasechainreaction(PCR)PCR技术是一种模拟DNA体内复制过程的体外DNA复制过程，在一个离心管的缓冲液体系

中，加入DNA模板，dNTPs,引物和DNA聚合酶，然后通过变性、退火、延伸三个温度的不断循环，使得目标DNA得到快速大量的复制。PCR反应体系的确立WaterBuffer（10×）Mg++（25mM）dNTPs（2mM）