光谱分析法-研究生课件

常见现代仪器分析技术：光谱分析技术：紫外-可见分光光度计、荧光分析仪器、原子光谱分析仪显微镜:光学显微镜和电子显微镜分离分析技术：离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电泳仪细胞及分子生物学技术：培养箱、PCR基因扩增仪波谱分析技术：质谱仪常规仪器分析技术：生物安全柜、免疫分析仪2常见现代仪器分析技术：光谱分析技术：紫外-可见分光光度计、荧第一章

光谱分析法（Spectrum

Analysis）2第一章

光谱分析法（SpectrumAnalysis本章提要第一节光谱分析法概论第二节紫外/可见光吸收光谱法光谱分析法及其特点电磁辐射的基本性质电磁辐射的特性光谱分析法的分类分子光谱法基本原理紫外/可见分光光度计构造紫外/可见分光光度计类型3本章提要第一节光谱分析法概论第二节紫外/可见光吸收光谱法第三节

分子发光光谱法

光致发光

分子荧光和磷光光谱基本原理影响荧光强度的因素

分子荧光光谱仪

分子荧光光谱法的应用磷光光谱法

化学发光法4本章提要第三节分子发光光谱法光致发光4本章提要第一节

光谱分析法概论5第一节5是电磁辐射按照波长的有序排列。光谱(spectrum)：第一节光谱分析法概论6是电磁辐光谱第一节光谱分析法概论6一、光谱分析法及其特点

光谱分析(spectralanalysis)：

对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。

电磁辐射范围：射线（10-10m）～无线电波（103m）所有范围；

相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；

应用：光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；7一、光谱分析法及其特点光谱分析(spectr（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。

基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。三个基本过程：一、光谱分析法及其特点8（1）能源提供能量；三个基本过程：一、光谱分析法及其特点8二、电磁辐射的基本性质

电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播的能量；

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λc：光速；λ：波长；ν：频率；σ：波数；E：能量；h：普朗克常数

电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；9二、电磁辐射的基本性质电磁辐射（电磁波）：以接近光速三、辐射能的特性：

(1)吸收

物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；(2)发射

将吸收的能量以光的形式释放出；

(3)散射

由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去；

(4)折射

折射是光在两种介质中的传播速度不同；

(5)反射光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质中；

(6)干涉

干涉现象；(7)衍射

光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；

(8)偏振

只在一个固定方向有振动的光。10三、辐射能的特性：(1)吸收物质选择性吸收特定频率常用三种光分析法测量过程示意图

11常用三种光分析法测量过程示意图11四、光谱分析分类光谱分析法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法12四、光谱分析分类光谱分析法原原原X原紫红核紫红分分核化原原分五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级1.电子相对于原子核的运动--电子能级;

单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.

三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.13五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级13分子的能级图与跃迁Sn:

电子能级Vn:

振动能级Jn:

转动能级分子的总能量

=E电子+E振动+E转动14分子的能级图与跃迁Sn:电子能级Vn:振动能级Jn:转

分子光谱分析法的分类分子光谱分子吸收分子发光光致发光其它发光形式UV-Vis（紫外-可见）IR（红外）如：荧光和磷光如：化学发光等15分子光谱分析法的分类分子光谱分子吸收分子发光光致发光其它发第二节

紫外/可见光吸收光谱法16第二节16紫外/可见光吸收光谱分析法：

利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为200~800nm。历史悠久、应用广泛：分析化学药物分析临床检验等第二节紫外/可见光吸收光谱法17紫外/可见光吸收光谱分析法：历史悠久、应用广泛：分析化学第二即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的λ、吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。比尔定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的λ、液层厚度b

一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。一、基本原理I0It入射光透过光18即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、基本原理19朗伯-比尔定律意义:A=lg(I0/It)=kbc一、基透光率（透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbc吸光度A

（Absorbance）一、基本原理20透光率（透射比）T（Transmittance）A=l吸光度A、透射比T与浓度c

的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20一、基本原理21吸光度A、透射比T与浓度c的关系AT(%)cA=kbck吸光系数（Absorptivity）

（1）当c的单位用g·L-1表示时，用a

表示，

A＝abca的单位:L·g-1·cm-1的单位:L·mol-1·cm-1（2）当c的单位用mol·L-1表示时，用ε表示，

A＝ε

bc

（3）当c的单位用g·100mL-1表示时，用表示,A＝bc，叫做比吸光系数。一、基本原理22k吸光系数（Absorptivity）（溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx一、基本原理26溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法朗伯-比尔定律的分析应朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光

应选用max处或肩峰处测定。3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强。2.吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系,

应控制条件(酸度、浓度、介质等)。一、基本原理27朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光3.稀溶液2吸光度的加和性与吸光度的测量

A=A1+A2+…+An用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。一、基本原理28吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+二、紫外/可见分光光度计主要部件光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成习惯上将工作波段在200nm~800nm的分光光度计称为紫外-可见分光光度计。优点：通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。波长可调,故选择性好,准确度高。29二、紫外/可见分光光度计主要部件光源单色器吸收池检测系统分光/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯氢灯强度光源（发出所需波长范围内的连续光谱）

可见光区：钨灯，卤钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯(180～375nm)

氙灯、汞灯：紫外、可见光区均可用作光源要求：有足够的光强度，稳定。二、紫外/可见分光光度计主要部件30/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯氢灯氙灯氢灯钨灯31氙灯氢灯钨灯31单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400二、紫外/可见分光光度计主要部件32单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜：依据不光栅：（利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光的装置）光栅衍射示意图光屏透镜平面透射光栅M1M2出射狭缝在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。优点：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。二、紫外/可见分光光度计主要部件33光栅：（利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光的装置）光栅检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。如：光电池，光电管，光电倍增管吸收池（比色皿）：用于盛待测及参比溶液。二、紫外/可见分光光度计主要部件34检流计（指示器）：检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号1.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图三、紫外/可见分光光度计的基本类型351.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意2.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或单色器放大器样品池光源

hv光子检测器反光镜反光镜透明部分扇形镜正面图扇形镜反光镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响。可变波长双光束紫外-可见分光光度计示意图362.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或放大器样品池光源第三节

分子发光光谱法37第三节37分子发光光致发光化学发光生物发光光致发光（Photoluminescence）:物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。PhotoluminescenceMolecularLuminescenceChemiluminescenceBioluminescence38分子发光光致发光化学发光生物发光光致发光（Photolumi1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，GeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，分子荧光首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。

分子荧光技术的发展391575年，西班牙医生N.Monardes发现。分子荧光技TheDiscoveryandDevelopmentoftheGreenFluorescentProtein,（GFP）绿色荧光蛋白2008诺贝尔化学奖OsamuShimomura1960sMartinChalfie1990sRogerY.Tsien’s,today40TheDiscoveryandDevelopment一、分子荧光（磷光）发生的原理41一、分子荧光（磷光）发生的原理41

。物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发态后，电子由第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级，以光的形式放出末态两个能级的能量差额称为荧光。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。42。物质的基态分子受1.分子的多重态：单线态、激发单线态、激发三线态单线态(S0)

一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。多数有机物分子的基态是单线态。当基态一对电子的一个被激发到较高能级时，激发单线态(S)

自旋方向不改变，分子仍处于单线态。激发三线态(T)

有两个电子的自旋不配对而平行的状态。分子的激发与失活43分子的激发与失活43S0ST分子的多重态ET1<ES1

S0→T

：禁阻跃迁，进入的几率小；

M=2S+1

S:为电子自旋量子数的代数和(0或1)；电子激发态的多重度：44S0ST分子的多重态ET1<ES1M=2S+1无辐射跃迁振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。系间窜越：同一电子能级激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。

激发态分子的失活45无辐射跃迁激发态分子的失活45辐射跃迁荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1

。

磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，寿命较长。激发态分子的失活46辐射跃迁激发态分子的失活46荧光与磷光的产生过程47荧光与磷光的产生过程47图荧光与磷光产生示意图激发单线态激发三线态~~~~~~~S1T1S2S0吸收（A）荧光（F）磷光（P）λ2λ1λ3λ448图荧光与磷光产生示意图激发单线态激发三线态~~~~~~~S荧光S1→S0跃迁波长短几率大速度较大寿命短，10-9~10-7s磷光

T1→S0跃迁波长长几率小速度较小寿命长，为10-4~10s荧光与磷光的比较49荧光S1→S0跃迁磷光T1→S0跃迁荧光与磷光的比较二、激发光谱与荧光(磷光)光谱（吸收光谱与发射光谱）50二、激发光谱与荧光(磷光)光谱50

1.荧光(磷光)的激发光谱(excitationspectrum)

固定测量波长（选最大荧光/发射波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与照射光波长的关系曲线。2.荧光光谱(或磷光光谱)（fluorescencespectrum）

固定激发光波长（选最大激发/吸收波长），

化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。3.最大激发波长(λex)和最大荧光波长(λem)激发光谱与荧光(磷光)光谱511.荧光(磷光)的激发光谱(excitationsp室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱λexλem菲200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱52室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱λexλem菲2002603激发光谱与发射光谱的关系Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，无辐射跃迁消耗了能量。

发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

3)。

镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱/激发光谱成镜像对称关系。

53激发光谱与发射光谱的关系Stokes位移53镜像规则的解释吸收光谱荧光光谱54镜像规则的解释吸收光谱荧光光谱54镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

S1S055镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第三、影响荧光强度的因素56三、影响荧光强度的因素56分子产生荧光必须具备的条件：

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如ki>>kf，不出现荧光发射；荧光的产生与分子结构的关系（1）具有合适的结构；

（2）具有一定的荧光量子产率。

荧光量子产率（f）：57分子产生荧光必须具备的条件：荧光量子产率与某些化合物的荧光效率化合物 荧光效率 溶剂荧光素 0.92（0.1MNaOH）曙红 0.19 （0.1MNaOH）罗丹明B 0.97 （乙醇）蒽 0.31 （己烷）核黄素 0.26 （水，pH7.0）菲 0.10 （乙醇）萘 0.12 （乙醇）酚 0.22 （水）叶绿素 0.32 （苯）58某些化合物的荧光效率化合物 荧光效率 化合物的结构与荧光具有共轭双键体系的分子59化合物的结构与荧光具有共轭双键体系的分子59（a）萘：

荧光效率为0.29；荧光波长为310nm。（b）蒽：荧光效率为0.46；荧光波长为400nm。多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。

ex=386nmem=430nm3，4-苯并芘强致癌物!60（a）萘：（b）蒽：多环芳烃是重要的环境污染具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光例61具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光例61反式：平面构型

强荧光体顺式：非平面构型

非荧光体例1，2-二苯乙烯62反式：平面构型顺式：非平面构型例金属螯合物滂铬BBR本身不发荧光Al3+滂铬BBR发红色荧光63例金属螯合物滂铬BBR本身不发荧光Al3+滂铬BBR发苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强：-OH、-OR、-NH2、-CN等。吸电子基团会使荧光减弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。

卤素取代基:

随着取代基中卤原子系数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。64苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强温度：温度越高，荧光降低环境对荧光的影响溶剂：极性增加，荧光增强，荧光波长发生红移pH值：电离平衡的改变导致荧光强度的差异猝灭剂：动态猝灭、静态猝灭、自猝灭表面活性剂：保护处于激发单重态的荧光物质分子，

提高荧光效率。65温度：温度越高，荧光降低环境对荧光的影响溶剂：极性增加，荧光pH对荧光强度的影响

共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光66pH对荧光强度的影响共轭酸碱两种体型具有不同四、荧光光谱仪67四、荧光光谱仪67测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：1.有两个单色器2.光源与检测器通常成直角。仪器结构69测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器荧光光度计光路图电源光度计记录仪光电倍增管试样液池光源光栅光栅反射镜反射镜激发单色器发射单色器90°70荧光光度计光路图电源光度计记录仪光电倍增管试样液池光源光栅光荧光分光光度计的的主要部件激发光源：稳定、具有一定强度（300~400nm)样品池：低荧光材料，常用石英池，方形检测器：较高灵敏度单色器（激发单色器和发射单色器）：光栅仪器结构71荧光分光光度计的的主要部件仪器结构711个光子可产生106～107个电子光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)721个光子可产生106～107个电子光电倍增管(Photomu仪器的使用维护注意事项电源：触发电压、工作电流、稳定性光源：启动预热、冷却重启、保持清洁单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射样品池：插放方向、避免摩擦、清洗个人防护

：

避免紫外线损伤

73仪器的使用维护注意事项73五、荧光分析方法与应用74五、荧光分析方法与应用74优点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～3个数量级；（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少、方法简便、提供比较多的物理参数缺点：应用范围小。60余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。荧光分析法的特点75优点：荧光分析法的特点75荧光信号荧光寿命荧光光谱荧光强度随光谱变化成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）强度寿命76荧光信号荧光寿命76可获得的信息分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的产生分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等77可获得的信息分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光分析法对物质的定性或定量分析定性分析：依据不同结构的物质所吸收波长和发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。78荧光分析法对物质的定性或定量分析定性分析：依据不同结构的任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光激发光谱（吸收光谱）—固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。荧光发射光谱（荧光光谱）—固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。荧光分析法定性依据79任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光分析法定(1)定量依据

荧光强度F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率f

：F=fIa

由朗-比耳定律：Ia=I0-I=I0(1-10-

lc

)F=fI0(1-10-

lc

)=fI0(1-e-2.3

l

c)

浓度很低（

lc<0.05）时，将括号项近似处理后：

F=2.3fI0

lc=Kc

荧光分析法定量依据和方法80(1)定量依据荧光分析法定量依据和方法80荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcI0IFIa条件:溶液浓度较稀81荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcI0IFIa一般当εbc0.05时,F与c呈线性关系浓度对荧光强度的影响Fc82一般当εbc0.05时,F与c呈线性关系浓度对荧单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化合物化学反应荧光猝灭88单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化学反(1)无机化合物的分析

可测量约60多种元素：

铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光配合物分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。

单组分的荧光测定89(1)无机化合物的分析单组分的荧光测定89(2)有机化合物的分析

芳香族化合物具有共轭不饱和体系，多能发生荧光。

脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。

胺类、甾族化合物、蛋白质、酶和辅酶、维生素等均可以用荧光法分析。90(2)有机化合物的分析

芳香族化合物具有共

蛋白质荧光探针就是利用荧光探测剂（小分子荧光化合物），使其与荧光较弱或不发荧光的物质共价或非共价地结合，以形成发强荧光的络合物，然后测定络合物的荧光。荧光探测剂必须满足以下3个条件：1.与蛋白质的某一微区专一而牢固地结合；2.荧光参数对于结合点的微环境变化很敏感；3.结合以后不改变蛋白质的构象。93蛋白质荧光探针就是利用荧光探测剂（小分子六、磷光光谱法92六、磷光光谱法92磷光光谱法

磷光分析法是以分子磷光光谱来鉴别有机化合物和进行定量分析的一种方法。93磷光光谱法磷光分析法是以分子磷光磷光光谱法

磷光光谱分析法的分类

低温磷光

室温磷光1、固体表面室温磷光法（SS-RTP）2、胶束增稳室温磷光法（MS-RTP）94样品管镀银未镀银Io液氮磷光光谱法磷光光谱分析法的分类1.稠环芳烃分析2.农药、生物碱、植物生长激素的分析

3.药物分析和临床分析

磷光光谱法的应用951.稠环芳烃分析磷光光谱法的应用95七、化学发光光谱法96七、化学发光光谱法96基本原理在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，称为化学发光。

A+B=C+D*D*→D+h97基本原理在化学反应过程中，某些化化学发光的特点能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当E=170～300kJ/mol；位于可见光区；发光持续时间较长，反应持续进行；

98化学发光的特点能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物化学发光的效率化学效率：发光效率：99化学发光的效率化学效率：发光效率：99时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：化学发光的效率100——

是与分析物有关的化学发光效率;dc/dt——分析物参加反应的速率；φcl化学发光分析法定量分析依据：

从上式可以看出：发光总强度与分析物浓度成正比。时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：化学发直接发光A+BC*+DC*C+h化学发光反应类型1.直接化学发光和间接化学发光间接发光A+BC*+DC*+FF*+EF*F+h2.气相化学发光和液相化学发光101直接发光化学发光反应类型1.直接化学发光和间接化学发光间接灵敏度极高仪器设备简单发射光强度测量无干扰线性范围宽分析速度快化学发光分析法的特点102灵敏度极高化学发光分析法的特点102内容小结第一节光谱分析法概论光谱分析

(spectralanalysis)：

对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。（三个基本过程、三个特点）电磁辐射具有波粒二象性：波动性和微粒性

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λ物质分子内部运动形式及其对应能级光谱分析法分类（吸收光谱法/发射光谱法；原子光谱法/分子光谱法）内容小结第一节光谱分析法概论光谱分析(spec内容小结第二节紫外/可见光吸收光谱法定量分析的依据

——朗伯-比尔定律A=lg(I0/It)=kbc（朗伯-比尔定律的分析应用/适用条件）分光光度计的基本组成光源单色器吸收池检测系统紫外/可见分光光度计的类型内容小结第二节紫外/可见光吸收光谱法定量分析的依据

——朗内容小结第一激发单线态基态分子光辐射激发态振动驰豫内转换荧光发射第一激发三线态体系间跨越磷光发射第三节

分子荧光和分子磷光光谱法分子荧光和磷光发生的机理内容小结第一激发基态分子光辐射激发态振动驰豫内转换荧光发射第内容小结Stokes位移发射光谱的形状与激发波长无关镜像规则激发光谱与荧光(磷光)光谱内容小结Stokes位移激发光谱与荧光(磷光)光谱荧光的产生与分子结构的关系内容小结分子产生荧光必须具备的条件荧光量子产率f合适的结构苯环上取代基的类型具有刚性平面结构的分子环境对荧光的影响（温度、溶剂、pH值、表面活性剂、猝灭剂）具有共轭双键体系的分子荧光的产生与分子结构的关系内容小结分子产生荧光必须具备的条件内容小结荧光光谱仪检测器光源激发单色器样品池发射单色器分类主要部件使用和维护内容小结荧光光谱仪检测器光源激发单色器样品池发射单色器分类荧光定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KC内容小结荧光定性分析荧光激发光谱荧光发射光谱标准曲线法比例法解线性方程法分析方法荧光定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KC内容小结荧光定内容小结磷光光谱法荧光分析法的应用单组分的荧光直接测定和间接测定多组分的荧光测定分类、仪器特点及其应用化学发光光谱法基本原理、特点、化学发光效率、反应类型内容小结磷光光谱法荧光分析法的应用单组分的荧光直接测定多组分复习思考题什么叫做光谱分析？其主要过程和特点有哪些？紫外/可见分光光度法的基本原理是什么？紫外/可见分光光度计的主要构造是怎样的？分子的去活化过程有哪些？什么是物质的激发光谱和荧光光谱？二者之间有什么关系？影响荧光强弱的因素有哪些？分子磷光和化学发光法的特点有哪些？复习思考题什么叫做光谱分析？其主要过程和特点有哪些？Thanks!Thanks!常见现代仪器分析技术：光谱分析技术：紫外-可见分光光度计、荧光分析仪器、原子光谱分析仪显微镜:光学显微镜和电子显微镜分离分析技术：离心机、色谱仪、电泳仪、毛细管电泳仪细胞及分子生物学技术：培养箱、PCR基因扩增仪波谱分析技术：质谱仪常规仪器分析技术：生物安全柜、免疫分析仪2常见现代仪器分析技术：光谱分析技术：紫外-可见分光光度计、荧第一章

光谱分析法（Spectrum

Analysis）2第一章

光谱分析法（SpectrumAnalysis本章提要第一节光谱分析法概论第二节紫外/可见光吸收光谱法光谱分析法及其特点电磁辐射的基本性质电磁辐射的特性光谱分析法的分类分子光谱法基本原理紫外/可见分光光度计构造紫外/可见分光光度计类型3本章提要第一节光谱分析法概论第二节紫外/可见光吸收光谱法第三节

分子发光光谱法

光致发光

分子荧光和磷光光谱基本原理影响荧光强度的因素

分子荧光光谱仪

分子荧光光谱法的应用磷光光谱法

化学发光法4本章提要第三节分子发光光谱法光致发光4本章提要第一节

光谱分析法概论5第一节5是电磁辐射按照波长的有序排列。光谱(spectrum)：第一节光谱分析法概论6是电磁辐光谱第一节光谱分析法概论6一、光谱分析法及其特点

光谱分析(spectralanalysis)：

对物质发射辐射能的能谱分析或对辐射能与物质相互作用引起的能谱改变的分析。

电磁辐射范围：射线（10-10m）～无线电波（103m）所有范围；

相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；

应用：光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；7一、光谱分析法及其特点光谱分析(spectr（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。

基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。三个基本过程：一、光谱分析法及其特点8（1）能源提供能量；三个基本过程：一、光谱分析法及其特点8二、电磁辐射的基本性质

电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播的能量；

c=λν=ν/σ

E=hν=hc/λc：光速；λ：波长；ν：频率；σ：波数；E：能量；h：普朗克常数

电磁辐射具有波动性和微粒性（波粒二象性）；9二、电磁辐射的基本性质电磁辐射（电磁波）：以接近光速三、辐射能的特性：

(1)吸收

物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；(2)发射

将吸收的能量以光的形式释放出；

(3)散射

由传播介质的不均匀性引起的光线向四周射去；

(4)折射

折射是光在两种介质中的传播速度不同；

(5)反射光射到不同的介质介面时，部分光自介面射回原介质中；

(6)干涉

干涉现象；(7)衍射

光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；

(8)偏振

只在一个固定方向有振动的光。10三、辐射能的特性：(1)吸收物质选择性吸收特定频率常用三种光分析法测量过程示意图

11常用三种光分析法测量过程示意图11四、光谱分析分类光谱分析法原子发射原子吸收原子荧光X射线荧光原子吸收紫外可见红外可见核磁共振紫外可见红外可见分子荧光分子磷光核磁共振化学发光原子发射原子荧光分子荧光分子磷光X射线荧光化学发光吸收光谱法发射光谱法原子光谱法分子光谱法12四、光谱分析分类光谱分析法原原原X原紫红核紫红分分核化原原分五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级1.电子相对于原子核的运动--电子能级;

单重态：激发态与基态中的电子自旋方向相反.

三重态：激发态与基态中的电子自旋方向相同.2.原子核在其平衡位置附近的相对振动--振动能级;3.分子本身绕其重心的转动--转动能级.13五、分子光谱法物质分子内部运动形式及其对应能级13分子的能级图与跃迁Sn:

电子能级Vn:

振动能级Jn:

转动能级分子的总能量

=E电子+E振动+E转动14分子的能级图与跃迁Sn:电子能级Vn:振动能级Jn:转

分子光谱分析法的分类分子光谱分子吸收分子发光光致发光其它发光形式UV-Vis（紫外-可见）IR（红外）如：荧光和磷光如：化学发光等15分子光谱分析法的分类分子光谱分子吸收分子发光光致发光其它发第二节

紫外/可见光吸收光谱法16第二节16紫外/可见光吸收光谱分析法：

利用溶液中分子吸收紫外和可见光产生跃迁所记录的吸收光谱图，可进行化合物结构分析，根据最大吸收波长强度变化可进行定量分析。属于分子吸收光谱法，分析波长范围一般为200~800nm。历史悠久、应用广泛：分析化学药物分析临床检验等第二节紫外/可见光吸收光谱法17紫外/可见光吸收光谱分析法：历史悠久、应用广泛：分析化学第二即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)

A=lg(I0/It)=k1b

当入射光的λ、吸光物质的c一定时，溶液的吸光度A与液层厚度b成正比。比尔定律(1852)

A=lg(I0/It)=k2c

当入射光的λ、液层厚度b

一定时，溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比。一、基本原理I0It入射光透过光18即光吸收基本定律朗伯定律:(1760)A=lg(I0朗伯-比尔定律意义:

当一束平行单色光通过均匀、透明的吸光介质时，其吸光度与吸光质点的浓度和吸收层厚度的乘积成正比。A=lg(I0/It)=kbc一、基本原理19朗伯-比尔定律意义:A=lg(I0/It)=kbc一、基透光率（透射比）T（Transmittance）A

=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT

=kbc吸光度A

（Absorbance）一、基本原理20透光率（透射比）T（Transmittance）A=l吸光度A、透射比T与浓度c

的关系AT(%)cA=kbc1.00.80.60.40.2100

80

60

40

20一、基本原理21吸光度A、透射比T与浓度c的关系AT(%)cA=kbck吸光系数（Absorptivity）

（1）当c的单位用g·L-1表示时，用a

表示，

A＝abca的单位:L·g-1·cm-1的单位:L·mol-1·cm-1（2）当c的单位用mol·L-1表示时，用ε表示，

A＝ε

bc

（3）当c的单位用g·100mL-1表示时，用表示,A＝bc，叫做比吸光系数。一、基本原理22k吸光系数（Absorptivity）（溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法(校准曲线)朗伯-比尔定律的分析应用

01.02.03.04.0c(mg/mL)A。。。。*0.800.600.400.200.00Axcx一、基本原理26溶液浓度的测定A＝bc工作曲线法朗伯-比尔定律的分析应朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光

应选用max处或肩峰处测定。3.稀溶液

浓度增大，分子之间作用增强。2.吸光质点形式不变

离解、络合、缔合会破坏线性关系,

应控制条件(酸度、浓度、介质等)。一、基本原理27朗伯-比尔定律的适用条件1.单色光3.稀溶液2吸光度的加和性与吸光度的测量

A=A1+A2+…+An用参比溶液调T=100%（A=0），再测样品溶液的吸光度，即消除了吸收池对光的吸收、反射，溶剂、试剂对光的吸收等。一、基本原理28吸光度的加和性与吸光度的测量A=A1+A2+二、紫外/可见分光光度计主要部件光源单色器吸收池检测系统分光光度计的基本组成习惯上将工作波段在200nm~800nm的分光光度计称为紫外-可见分光光度计。优点：通过色散原件（棱镜或光栅）得到一束近似的单色光。波长可调,故选择性好,准确度高。29二、紫外/可见分光光度计主要部件光源单色器吸收池检测系统分光/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯氢灯强度光源（发出所需波长范围内的连续光谱）

可见光区：钨灯，卤钨灯(320～2500nm)

紫外区：氢灯(180～375nm)

氙灯、汞灯：紫外、可见光区均可用作光源要求：有足够的光强度，稳定。二、紫外/可见分光光度计主要部件30/nm钨灯（热辐射光源）4006008001000氙灯氢灯氙灯氢灯钨灯31氙灯氢灯钨灯31单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同。玻璃350～3200nm,石英185～4000nm入射狭缝准直透镜棱镜聚焦透镜出射狭缝白光红紫λ1λ2800600500400二、紫外/可见分光光度计主要部件32单色器（将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置）棱镜：依据不光栅：（利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光的装置）光栅衍射示意图光屏透镜平面透射光栅M1M2出射狭缝在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、2400条/mm)。优点：波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便。二、紫外/可见分光光度计主要部件33光栅：（利用光通过光栅时发生衍射和干涉现象而分光的装置）光栅检流计（指示器）：低档仪器：刻度显示中高档仪器：数字显示，自动扫描记录检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号。如：光电池，光电管，光电倍增管吸收池（比色皿）：用于盛待测及参比溶液。二、紫外/可见分光光度计主要部件34检流计（指示器）：检测器：利用光电效应，将光能转换成电流讯号1.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意图三、紫外/可见分光光度计的基本类型351.单光束分光光度计可变波长单光束紫外-可见分光光度计示意2.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或单色器放大器样品池光源

hv光子检测器反光镜反光镜透明部分扇形镜正面图扇形镜反光镜栅镜双光束型可以消除光源强度变化的影响。可变波长双光束紫外-可见分光光度计示意图362.双光束分光光度计参比池检测器滤光片或放大器样品池光源第三节

分子发光光谱法37第三节37分子发光光致发光化学发光生物发光光致发光（Photoluminescence）:物质当受到光的照射吸收了某种波长的光后，会发射出波长相同或比吸收波长更长的光，这种现象称为光致发光。PhotoluminescenceMolecularLuminescenceChemiluminescenceBioluminescence38分子发光光致发光化学发光生物发光光致发光（Photolumi1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，GeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，分子荧光首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。

分子荧光技术的发展391575年，西班牙医生N.Monardes发现。分子荧光技TheDiscoveryandDevelopmentoftheGreenFluorescentProtein,（GFP）绿色荧光蛋白2008诺贝尔化学奖OsamuShimomura1960sMartinChalfie1990sRogerY.Tsien’s,today40TheDiscoveryandDevelopment一、分子荧光（磷光）发生的原理41一、分子荧光（磷光）发生的原理41

。物质的基态分子受一激发光源的照射被激发至激发态后，电子由第一激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级，以光的形式放出末态两个能级的能量差额称为荧光。基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光谱法。42。物质的基态分子受1.分子的多重态：单线态、激发单线态、激发三线态单线态(S0)

一个所有电子自旋都配对的分子的电子状态。多数有机物分子的基态是单线态。当基态一对电子的一个被激发到较高能级时，激发单线态(S)

自旋方向不改变，分子仍处于单线态。激发三线态(T)

有两个电子的自旋不配对而平行的状态。分子的激发与失活43分子的激发与失活43S0ST分子的多重态ET1<ES1

S0→T

：禁阻跃迁，进入的几率小；

M=2S+1

S:为电子自旋量子数的代数和(0或1)；电子激发态的多重度：44S0ST分子的多重态ET1<ES1M=2S+1无辐射跃迁振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。系间窜越：同一电子能级激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用、能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。

激发态分子的失活45无辐射跃迁激发态分子的失活45辐射跃迁荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109s-1

。

磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。

产生伴随自旋多重态的改变，辐射速度远小于荧光，寿命较长。激发态分子的失活46辐射跃迁激发态分子的失活46荧光与磷光的产生过程47荧光与磷光的产生过程47图荧光与磷光产生示意图激发单线态激发三线态~~~~~~~S1T1S2S0吸收（A）荧光（F）磷光（P）λ2λ1λ3λ448图荧光与磷光产生示意图激发单线态激发三线态~~~~~~~S荧光S1→S0跃迁波长短几率大速度较大寿命短，10-9~10-7s磷光

T1→S0跃迁波长长几率小速度较小寿命长，为10-4~10s荧光与磷光的比较49荧光S1→S0跃迁磷光T1→S0跃迁荧光与磷光的比较二、激发光谱与荧光(磷光)光谱（吸收光谱与发射光谱）50二、激发光谱与荧光(磷光)光谱50

1.荧光(磷光)的激发光谱(excitationspectrum)

固定测量波长（选最大荧光/发射波长），化合物发射的荧光(或磷光)强度与照射光波长的关系曲线。2.荧光光谱(或磷光光谱)（fluorescencespectrum）

固定激发光波长（选最大激发/吸收波长），

化合物发射的荧光(或磷光)强度与发射光波长关系曲线。3.最大激发波长(λex)和最大荧光波长(λem)激发光谱与荧光(磷光)光谱511.荧光(磷光)的激发光谱(excitationsp室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱λexλem菲200260320380440500560620荧光激发光谱荧光发射光谱磷光光谱52室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱λexλem菲2002603激发光谱与发射光谱的关系Stokes位移

激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，无辐射跃迁消耗了能量。

发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图

2,

1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如

3)。

镜像规则

通常荧光发射光谱与它的吸收光谱/激发光谱成镜像对称关系。

53激发光谱与发射光谱的关系Stokes位移53镜像规则的解释吸收光谱荧光光谱54镜像规则的解释吸收光谱荧光光谱54镜像规则的解释

基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；

S1S055镜像规则的解释基态上的各振动能级分布与第三、影响荧光强度的因素56三、影响荧光强度的因素56分子产生荧光必须具备的条件：

荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如ki>>kf，不出现荧光发射；荧光的产生与分子结构的关系（1）具有合适的结构；

（2）具有一定的荧光量子产率。

荧光量子产率（f）：57分子产生荧光必须具备的条件：荧光量子产率与某些化合物的荧光效率化合物 荧光效率 溶剂荧光素 0.92（0.1MNaOH）曙红 0.19 （0.1MNaOH）罗丹明B 0.97 （乙醇）蒽 0.31 （己烷）核黄素 0.26 （水，pH7.0）菲 0.10 （乙醇）萘 0.12 （乙醇）酚 0.22 （水）叶绿素 0.32 （苯）58某些化合物的荧光效率化合物 荧光效率 化合物的结构与荧光具有共轭双键体系的分子59化合物的结构与荧光具有共轭双键体系的分子59（a）萘：

荧光效率为0.29；荧光波长为310nm。（b）蒽：荧光效率为0.46；荧光波长为400nm。多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定。

ex=386nmem=430nm3，4-苯并芘强致癌物!60（a）萘：（b）蒽：多环芳烃是重要的环境污染具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光例61具有刚性不饱和平面结构的分子化合物的结构与荧光例61反式：平面构型

强荧光体顺式：非平面构型

非荧光体例1，2-二苯乙烯62反式：平面构型顺式：非平面构型例金属螯合物滂铬BBR本身不发荧光Al3+滂铬BBR发红色荧光63例金属螯合物滂铬BBR本身不发荧光Al3+滂铬BBR发苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强：-OH、-OR、-NH2、-CN等。吸电子基团会使荧光减弱：-COOH、-NO2、-SH、-X等。

卤素取代基:

随着取代基中卤原子系数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。64苯环上取代基的类型：化合物的结构与荧光给电子基团常使荧光增强温度：温度越高，荧光降低环境对荧光的影响溶剂：极性增加，荧光增强，荧光波长发生红移pH值：电离平衡的改变导致荧光强度的差异猝灭剂：动态猝灭、静态猝灭、自猝灭表面活性剂：保护处于激发单重态的荧光物质分子，

提高荧光效率。65温度：温度越高，荧光降低环境对荧光的影响溶剂：极性增加，荧光pH对荧光强度的影响

共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。离子化后，荧光消失pH≈1有荧光pH≈13无荧光66pH对荧光强度的影响共轭酸碱两种体型具有不同四、荧光光谱仪67四、荧光光谱仪67测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。

特殊点：1.有两个单色器2.光源与检测器通常成直角。仪器结构69测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器荧光光度计光路图电源光度计记录仪光电倍增管试样液池光源光栅光栅反射镜反射镜激发单色器发射单色器90°70荧光光度计光路图电源光度计记录仪光电倍增管试样液池光源光栅光荧光分光光度计的的主要部件激发光源：稳定、具有一定强度（300~400nm)样品池：低荧光材料，常用石英池，方形检测器：较高灵敏度单色器（激发单色器和发射单色器）：光栅仪器结构71荧光分光光度计的的主要部件仪器结构711个光子可产生106～107个电子光电倍增管(PhotomultiplierTube,PMT)721个光子可产生106～107个电子光电倍增管(Photomu仪器的使用维护注意事项电源：触发电压、工作电流、稳定性光源：启动预热、冷却重启、保持清洁单色器：防潮、防尘、防污和防机械损伤光电倍增管：避免高压时受到外来光线直射样品池：插放方向、避免摩擦、清洗个人防护

：

避免紫外线损伤

73仪器的使用维护注意事项73五、荧光分析方法与应用74五、荧光分析方法与应用74优点：（1）灵敏度高比紫外-可见分光光度法高2～3个数量级；（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；（3）试样量少、方法简便、提供比较多的物理参数缺点：应用范围小。60余种元素，尤其适用于有机物和生物大分子的检测。荧光分析法的特点75优点：荧光分析法的特点75荧光信号荧光寿命荧光光谱荧光强度随光谱变化成像（荧光物质在样本中分布的空间信息）强度寿命76荧光信号荧光寿命76可获得的信息分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光物质的荧光强度随溶剂极性的变化等等分子浓度信息：荧光强度增强或猝灭分子在溶剂中的状态：荧光光谱的红移或者蓝移，静态或动态猝灭，荧光寿命的变化等等分子间的相互作用：荧光猝灭，荧光寿命，共振能量转移、新的荧光峰的产生分子的大小：分子的转动速度对偏振光的消偏等77可获得的信息分子结构信息：荧光发射波长，荧光寿命，大分子表面荧光分析法对物质的定性或定量分析定性分析：依据不同结构的物质所吸收波长和发射的荧光波长不同；定量分析：同种物质的稀溶液，其产生的荧光强度与浓度呈线性关系。78荧光分析法对物质的定性或定量分析定性分析：依据不同结构的任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光激发光谱（吸收光谱）—固定某一发射波长，测定该波长下的荧光发射强度随激发波长变化所得的光谱。荧光发射光谱（荧光光谱）—固定某一激发波长，测定荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱。荧光分析法定性依据79任何荧光化合物都具有两种特征光谱：荧光分析法定(1)定量依据

荧光强度F正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率f

：F=fIa

由朗-比耳定律：Ia=I0-I=I0(1-10-

lc

)F=fI0(1-10-

lc

)=fI0(1-e-2.3

l

c)

浓度很低（

lc<0.05）时，将括号项近似处理后：

F=2.3fI0

lc=Kc

荧光分析法定量依据和方法80(1)定量依据荧光分析法定量依据和方法80荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcI0IFIa条件:溶液浓度较稀81荧光的定量分析荧光强度与溶液浓度的关系：F=KcI0IFIa一般当εbc0.05时,F与c呈线性关系浓度对荧光强度的影响Fc82一般当εbc0.05时,F与c呈线性关系浓度对荧单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化合物化学反应荧光猝灭88单组分的荧光直接测定和间接测定荧光物质大多数无机和有机化学反(1)无机化合物的分析

可测