基因重组技术课件

基因重组技术基因重组技术121概述

1.1定义

基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说，就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复制繁殖或产生大量基因表达产物。21概述

1.1定义基因重组技术是一种在3别称：基因工程（Geneengineering）

DNA重组(DNArecombination)

遗传工程(Geneticengineering)

基因操作(Genemanipulation)

基因克隆(Genecloning)

分子克隆(Molecularcloning)……3别称：4目的基因的分离；重组载体的选择和制备；目的基因与载体的重组；重组体导入受体细胞；重组克隆的筛选与鉴定；目的基因在受体细胞中的表达及表达产物的分离纯化。3基因重组技术

1概述

1.2基因重组技术的主要内容和步骤基因重组技术的主要内容4目的基因的分离；3基因重组技术

1概述

1.2基因重5分离重组转化表达筛选

载体基因重组技术的主要步骤5分离重组转化表达筛选载体基因重组技术的主要步骤6

定义是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

简称限制性内切酶、限制酶、内切酶。3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.1限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease)——分子剪刀6定义3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.17种类目前，已从近300种不同的微生物分离出约500种限制性核酸内切酶。类型（三种类型）型酶、型酶和型酶。若无说明，通常的限制性核酸内切酶就是指型酶。7种类8

三种核酸限制性内切酶的主要特性比较特性I型酶II型酶III型酶酶分子的结构与功能三亚基多功能的酶单一功能的酶二亚基双功能酶辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸识别序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称特异性，非对称序列切割位点距特异性位点至少1000bp处随机切割在识别序列内部或附近特异切割距识别序列下游2426bp处切割在DNA克隆中的用途无用十分有用有用8三种核酸限制性内切酶的主要特性比较特性I型酶II9识别序列

定义限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割位点。长度

4、5、6或7个核苷酸。结构特点

具有双重旋转对称结构，即：回文结构（palindromicsequence）。

GAATTC’

CTTAAG5’3’5’3’EcoRI9识别序列定义GAATTC’5’3’5’3’EcoR10切割方式已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。切割后形成3种不同末端结构的DNA片段：在识别序列的对称轴上同时切割，形成平头末端（bluntend），如HaeIII；在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的5’末端切割，可产生5’端突出的末端，如EcoRI；在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的3’末端切割，可产生3’端突出的末端，如PstI。任何一种II型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互补，因此这种末端称为黏性末端（cohesiveend）。10切割方式已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部11平头末端5’

粘性末端3’

粘性末端11平头末端5’粘性末端3’粘性末端12限制性核酸内切酶在基因重组中的用途1.分割基因组DNA;12限制性核酸内切酶在基因重组中的用途1.分割基因组DN132.获得分子重组所必需的末端；限制性内切酶在基因工程中的用途AABA+BB132.获得分子重组所必需的末端；限制性内切酶在基因工程14

定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键的酶。活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口(gap)。3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.2DNA连接酶（DNAligase）——分子浆糊14定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3’-O15两种DNA连接酶比较DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体辅助因子NAD+ATP功能缺口（nick）修补缺口修补和平头末端连接15两种DNA连接酶比较DNA连接酶T4DNA连接酶来源大16T4DNA连接酶在基因重组中的用途补缺口平头末端连接粘性末端连接16T4DNA连接酶在基因重组中的用途补缺口17磷酸二酯法合成寡核苷酸磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸3基因重组技术

3目的基因的分离

1基因的化学合成局限性：目前，化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp以内。然而，绝大多数基因的大小都超过了这个范围。因此，需要一种特殊的程序，才能够把合成的寡核苷酸片段构建成完整的基因。17磷酸二酯法合成寡核苷酸3基因重组技术

3目的基因的分18寡核苷酸片段组装基因的方式基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装配成完整基因的过程。第一种方法是先将寡核苷酸激活，带上必要的5’-P基团，然后再与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组成一个完整的基因或者是基因的一个片段。18寡核苷酸片段组装基因的方式基因的组装：按设计要求用许多寡19寡核苷酸片段组装基因的方式第二种方法是尽可能的减少合成寡核苷酸片段的用量。将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链区域以3’-OH为引物，用DNA聚合酶处理，便会合成出相应的互补链。19寡核苷酸片段组装基因的方式第二种方法是尽可能的减少合成寡20概念：(Genebank；Genelibrary)将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组DNA分子的群体。3基因重组技术

3目的基因的分离

2构建基因文库法20概念：(Genebank；Genelibrary)321基因文库的构建过程21基因文库的构建过程22几个相关概念DNA双螺旋结构的生物功能主要在于复制和转录。加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA，这称为DNA变性（denature）。解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链，此过程称为DNA复性（renature），也叫退火（annealing）。变性和复性在一定条件下是完全可逆的。DNA双链解离一半时的温度叫做解链温度（meltingtemperature，Tm）。3基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因22几个相关概念3基因重组技术

3目的基因的分离

3P233基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种特定区段的DNA复制，必须有DNA模板（template）、DNA聚合酶（DNApolymerase）、DNA引物（primer）、四种dNTP和Mg2＋。要扩增模板DNA中的A～B区间的DNA片段，首先要设计两条寡核苷酸引物，而PCR扩增DNA的特异性和长度就由人工合成的这两条引物决定。引物1和引物2这段DNA的序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件。233基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因243基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因步骤：PCR是通过3个温度依赖性步骤完成的反复循环。其反应主要分3步进行：1.变性，即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。2.退火，即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。

延伸，即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5’→3’的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。经过高温变性、低温退火、中温延伸3个温度的循环，模板上介于两引物之间的片断不断扩展。243基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因2525262627

载体(vector)的定义：在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体，并能将重组体DNA导入受体细胞，使外源DNA得以复制或表达的DNA分子。载体应具备的基本特性：在宿主细胞中能独立复制；具一段不影响其复制的非必需区域；具1~2个选择标记；分子量小，易操作；多拷贝；安全可靠。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.1载体的定义和基本特性27载体(vector)的定义：3基因重组技术

4基因28

来源与性质的不同质粒载体噬菌体载体黏粒载体噬菌粒载体病毒载体人工染色体等功能和用途不同克隆载体用于DNA片段的扩增表达载体可在寄主细胞中表达性状穿梭质粒可转化两种以上寄主细胞3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.2载体的种类28来源与性质的不同3基因重组技术

4基因重组技术的载29根据受体细胞不同大肠杆菌载体酵母载体动物基因工程载体植物基因工程载体等3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.2载体的种类29根据受体细胞不同3基因重组技术

4基因重组技术的载体30质粒(plasmid)的定义：质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存在。注意：酵母的杀伤质粒（killerplasmid）为RNA质粒。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体质粒载体是基因重组中最常用的载体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的。它必须包含有三种共同的组成部分：复制必须区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。30质粒(plasmid)的定义：注意：酵母的杀伤质粒（k31克隆质粒载体专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。选择标记基因克隆位点复制必需区保证质粒拷贝数便于插入外源DNA筛选重组子3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体31克隆质粒载体选择标记基因克隆位点复制必需区保证质粒拷贝数32表达质粒载体专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及适当的翻译调控序列。启动子PLac来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、

PTrp(色氨酸操纵子)PTac（来源于Lac和Trp的杂合启动子）强转录终止序列核糖体结合位点（S-D序列）、起始密码子、终密码止子等3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体32表达质粒载体专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒33pGEX表达质粒载体33pGEX表达质粒载体34酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其优势在于：基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全；发酵工艺简单，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.4酵母载体34酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其35按载体在酵母细胞中的复制形式分类酵母整合载体（yeastintegratingvector）酵母人工染色体（yeastartificialchromosome）质粒载体酵母附加型质粒（yeastepisomalplasmid,YEp）酵母复制质粒（yeastreplicatingplasmid,YRp）酵母着丝粒质粒（yeastcentromereplasmid,YCp）3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.4酵母载体35按载体在酵母细胞中的复制形式分类酵母整合载体（yeast363637主要由动物病毒构建的一类载体。例如：SV40病毒载体、反转录病毒载体、杆状病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体、乳头状病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.5动物基因工程载体37主要由动物病毒构建的一类载体。3基因重组技术

4基因38痘苗病毒具有线性双链DNA，其转录和复制都在细胞质中。痘苗病毒基因组DNA分子量大（180kb），操作起来很不方便，不适于直接用作基因克隆的载体。痘苗病毒基因组中有一HindⅢ-J片段，当其被外源

DNA取代之后不会影响到病毒基因组的复制能力。痘苗病毒载体的特点：3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.5动物基因工程载体38痘苗病毒具有线性双链DNA，其转录和复制都在细胞痘苗病毒39痘苗病毒载体39痘苗病毒载体40痘苗病毒载体40痘苗病毒载体414142

载体与外源DNA用同一种限制酶处理后得到相同的粘性末端，碱基可以配对，由T4DNA连接酶催化，进行两种DNA分子间的共价连接，形成重组体分子。3基因重组技术

目的基因与载体的重组42载体与外源DNA用同一种限制酶处43外源DNA质粒酶切位点酶切酶切混合DNA连接酶利用粘性末端进行DNA片段和载体DNA的体外重组43外源DNA质酶切位点酶切酶切混合DNA连接酶利用粘性末端44

方法：重组体向细菌细胞的导入化学转化法电击转化法重组体向动物细胞的导入病毒转染法等3基因重组技术

5重组体导入受体细胞转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）44方法：3基因重组技术

5重组45

概念:

细菌细胞经过一定浓度的冰冻CaCl2处理(-4℃)，便处于容易摄取各种外源DNA或噬菌体的状态，称为感受态（compentnt）。受体：细菌转化效率（细菌）转化效率为106-107转化子/μgDNA。转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。3基因重组技术

5重组体导入受体细胞

5.1CaCl2感受态法——化学转化法45概念:3基因重组技术

5重组46

概念:

将宿主细胞（或DNA受体细胞）与DNA分子置于一个高强电场内，通过电场脉冲使宿主细胞发生电穿孔作用，使外源DNA分子随即进入的方法。受体：细菌、真核生物转化效率（细菌）小质粒：109转化子/微克DNA;

大质粒（>100kb）：106转化子/μg

DNA。3基因重组技术

5重组体导入受体细胞

5.2电击转化法46概念:3基因重组技术

5重组体导入受体细胞

5.47借助病毒转染细胞来实现外源基因的转移是病毒转染法的基本思路。该技术使用的病毒主要有痘苗病毒、腺病毒、逆转录病毒等。3基因重组技术

5重组体导入受体细胞

5.3病毒转染法重组痘苗病毒转染法的优点：宿主广泛，能感染几乎所有培养的动物细胞；表达的外源蛋白能在感染细胞内进行有效的加工修饰，并分泌到细胞外；具有较大的容纳外源细胞的能力和较高的表达效率。47借助病毒转染细胞来实现外源基因的转移是病3基因重组技术48

利用外源基因或DNA片段插入后，重组质粒及含重组质粒菌株的遗传性状的改变来检测重组体。3基因重组技术

6重组体的筛选与鉴定

6.1遗传学检测法48利用外源基因或DNA片段插入后，重组质粒49

对于带有抗药性基因的质粒，可通过检测受体菌是否由敏感状态变成抗药状态进行筛选。抗生素抗性基因：Ampr、Tetr、Kanr抗性筛选49对于带有抗药性基因的质粒，可通过检测受体菌是否由敏感50LacZ

基因-半乳糖苷酶底物产物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷）诱导物IPTG（异丙基--D-硫代半乳糖苷）插入失活型载体的重组体筛选原理外源DNA重组体（白色）未转化体（蓝色）50LacZ基因-半乳糖苷酶底物产物X-gal诱导物I51在含X-gal和IPTG的培养基上筛选重组菌株51在含X-gal和IPTG的培养基上筛选重组菌株基因重组技术基因重组技术52531概述

1.1定义

基因重组技术是一种在分子水平上按照人们设计的蓝图对基因进行人工操作的技术，具体地说，就是从一种细胞中把目的基因提取出来，在体外把它和一种载体分子连接，然后用人工的方法将这种杂种DNA分子引入到另一种细胞中去，让其大量复制繁殖或产生大量基因表达产物。21概述

1.1定义基因重组技术是一种在54别称：基因工程（Geneengineering）

DNA重组(DNArecombination)

遗传工程(Geneticengineering)

基因操作(Genemanipulation)

基因克隆(Genecloning)

分子克隆(Molecularcloning)……3别称：55目的基因的分离；重组载体的选择和制备；目的基因与载体的重组；重组体导入受体细胞；重组克隆的筛选与鉴定；目的基因在受体细胞中的表达及表达产物的分离纯化。3基因重组技术

1概述

1.2基因重组技术的主要内容和步骤基因重组技术的主要内容4目的基因的分离；3基因重组技术

1概述

1.2基因重56分离重组转化表达筛选

载体基因重组技术的主要步骤5分离重组转化表达筛选载体基因重组技术的主要步骤57

定义是一类以环状或线性双链DNA为底物，能识别DNA中特定核苷酸序列，并在合适反应条件下使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生具3’-OH和5’-P基团DNA片段的内脱氧核苷酸酶(endo-deoxyribonuclease)。

简称限制性内切酶、限制酶、内切酶。3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.1限制性核酸内切酶(Restrictionendonuclease)——分子剪刀6定义3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.158种类目前，已从近300种不同的微生物分离出约500种限制性核酸内切酶。类型（三种类型）型酶、型酶和型酶。若无说明，通常的限制性核酸内切酶就是指型酶。7种类59

三种核酸限制性内切酶的主要特性比较特性I型酶II型酶III型酶酶分子的结构与功能三亚基多功能的酶单一功能的酶二亚基双功能酶辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）Mg2+ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸识别序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称特异性，非对称序列切割位点距特异性位点至少1000bp处随机切割在识别序列内部或附近特异切割距识别序列下游2426bp处切割在DNA克隆中的用途无用十分有用有用8三种核酸限制性内切酶的主要特性比较特性I型酶II60识别序列

定义限制性核酸内切酶在双链DNA分子上能识别的特定核苷酸序列。又称为识别位点、靶位点或切割位点。长度

4、5、6或7个核苷酸。结构特点

具有双重旋转对称结构，即：回文结构（palindromicsequence）。

GAATTC’

CTTAAG5’3’5’3’EcoRI9识别序列定义GAATTC’5’3’5’3’EcoR61切割方式已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的3’位的酯键，产生3’端为羟基、5’端为磷酸基团的片段。切割后形成3种不同末端结构的DNA片段：在识别序列的对称轴上同时切割，形成平头末端（bluntend），如HaeIII；在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的5’末端切割，可产生5’端突出的末端，如EcoRI；在识别序列的双侧末端切割，若于对称轴的3’末端切割，可产生3’端突出的末端，如PstI。任何一种II型酶产生的两个突出末端，都能在适当温度下，退火互补，因此这种末端称为黏性末端（cohesiveend）。10切割方式已知大多数II型限制性核酸内切酶在其识别序列内部62平头末端5’

粘性末端3’

粘性末端11平头末端5’粘性末端3’粘性末端63限制性核酸内切酶在基因重组中的用途1.分割基因组DNA;12限制性核酸内切酶在基因重组中的用途1.分割基因组DN642.获得分子重组所必需的末端；限制性内切酶在基因工程中的用途AABA+BB132.获得分子重组所必需的末端；限制性内切酶在基因工程65

定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键的酶。活性：封闭缺口(nick)，不能封闭裂口(gap)。3基因重组技术

2基因重组技术的工具酶

2.2DNA连接酶（DNAligase）——分子浆糊14定义：能催化双链DNA分子中相邻的5’-P与3’-O66两种DNA连接酶比较DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体辅助因子NAD+ATP功能缺口（nick）修补缺口修补和平头末端连接15两种DNA连接酶比较DNA连接酶T4DNA连接酶来源大67T4DNA连接酶在基因重组中的用途补缺口平头末端连接粘性末端连接16T4DNA连接酶在基因重组中的用途补缺口68磷酸二酯法合成寡核苷酸磷酸三酯法合成寡核苷酸固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸3基因重组技术

3目的基因的分离

1基因的化学合成局限性：目前，化学合成寡核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp以内。然而，绝大多数基因的大小都超过了这个范围。因此，需要一种特殊的程序，才能够把合成的寡核苷酸片段构建成完整的基因。17磷酸二酯法合成寡核苷酸3基因重组技术

3目的基因的分69寡核苷酸片段组装基因的方式基因的组装：按设计要求用许多寡核苷酸片段装配成完整基因的过程。第一种方法是先将寡核苷酸激活，带上必要的5’-P基团，然后再与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段。把这些双链寡核苷酸片段混合在一个试管中，加上T4DNA连接酶，使它们彼此连接组成一个完整的基因或者是基因的一个片段。18寡核苷酸片段组装基因的方式基因的组装：按设计要求用许多寡70寡核苷酸片段组装基因的方式第二种方法是尽可能的减少合成寡核苷酸片段的用量。将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链区域以3’-OH为引物，用DNA聚合酶处理，便会合成出相应的互补链。19寡核苷酸片段组装基因的方式第二种方法是尽可能的减少合成寡71概念：(Genebank；Genelibrary)将一个基因组的DNA用限制酶切割成适当大小的片段，并进行克隆化，从而形成的含有重组DNA分子的群体。3基因重组技术

3目的基因的分离

2构建基因文库法20概念：(Genebank；Genelibrary)372基因文库的构建过程21基因文库的构建过程73几个相关概念DNA双螺旋结构的生物功能主要在于复制和转录。加热或变性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA，这称为DNA变性（denature）。解除变性条件之后，变性的单链可以重新结合起来，形成双链，此过程称为DNA复性（renature），也叫退火（annealing）。变性和复性在一定条件下是完全可逆的。DNA双链解离一半时的温度叫做解链温度（meltingtemperature，Tm）。3基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因22几个相关概念3基因重组技术

3目的基因的分离

3P743基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因原理：聚合酶链式反应（PCR）是一种特定区段的DNA复制，必须有DNA模板（template）、DNA聚合酶（DNApolymerase）、DNA引物（primer）、四种dNTP和Mg2＋。要扩增模板DNA中的A～B区间的DNA片段，首先要设计两条寡核苷酸引物，而PCR扩增DNA的特异性和长度就由人工合成的这两条引物决定。引物1和引物2这段DNA的序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件。233基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因753基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因步骤：PCR是通过3个温度依赖性步骤完成的反复循环。其反应主要分3步进行：1.变性，即双链DNA在94℃下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。2.退火，即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。

延伸，即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5’→3’的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。经过高温变性、低温退火、中温延伸3个温度的循环，模板上介于两引物之间的片断不断扩展。243基因重组技术

3目的基因的分离

3PCR制备基因7625772678

载体(vector)的定义：在基因重组中，可与外源DNA片段构成重组体，并能将重组体DNA导入受体细胞，使外源DNA得以复制或表达的DNA分子。载体应具备的基本特性：在宿主细胞中能独立复制；具一段不影响其复制的非必需区域；具1~2个选择标记；分子量小，易操作；多拷贝；安全可靠。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.1载体的定义和基本特性27载体(vector)的定义：3基因重组技术

4基因79

来源与性质的不同质粒载体噬菌体载体黏粒载体噬菌粒载体病毒载体人工染色体等功能和用途不同克隆载体用于DNA片段的扩增表达载体可在寄主细胞中表达性状穿梭质粒可转化两种以上寄主细胞3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.2载体的种类28来源与性质的不同3基因重组技术

4基因重组技术的载80根据受体细胞不同大肠杆菌载体酵母载体动物基因工程载体植物基因工程载体等3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.2载体的种类29根据受体细胞不同3基因重组技术

4基因重组技术的载体81质粒(plasmid)的定义：质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子。广泛存在于细菌细胞中，也存在于霉菌、蓝藻、酵母和少数动植物细胞中，甚至线粒体中都发现有质粒的存在。注意：酵母的杀伤质粒（killerplasmid）为RNA质粒。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体质粒载体是基因重组中最常用的载体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成的。它必须包含有三种共同的组成部分：复制必须区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。30质粒(plasmid)的定义：注意：酵母的杀伤质粒（k82克隆质粒载体专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。选择标记基因克隆位点复制必需区保证质粒拷贝数便于插入外源DNA筛选重组子3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体31克隆质粒载体选择标记基因克隆位点复制必需区保证质粒拷贝数83表达质粒载体专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。除了具有克隆质粒载体的三个基本构件外，还需要有能控制插入的外源基因进行有效转录的序列以及适当的翻译调控序列。启动子PLac来源于大肠杆菌（乳糖操纵子）、

PTrp(色氨酸操纵子)PTac（来源于Lac和Trp的杂合启动子）强转录终止序列核糖体结合位点（S-D序列）、起始密码子、终密码止子等3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.3质粒载体32表达质粒载体专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒84pGEX表达质粒载体33pGEX表达质粒载体85酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其优势在于：基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性病毒，不产毒素，较为安全；发酵工艺简单，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.4酵母载体34酵母是一类单细胞的真核生物，作为一种真核生物表达系统，其86按载体在酵母细胞中的复制形式分类酵母整合载体（yeastintegratingvector）酵母人工染色体（yeastartificialchromosome）质粒载体酵母附加型质粒（yeastepisomalplasmid,YEp）酵母复制质粒（yeastreplicatingplasmid,YRp）酵母着丝粒质粒（yeastcentromereplasmid,YCp）3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.4酵母载体35按载体在酵母细胞中的复制形式分类酵母整合载体（yeast873688主要由动物病毒构建的一类载体。例如：SV40病毒载体、反转录病毒载体、杆状病毒载体、痘苗病毒载体、腺病毒载体、乳头状病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.5动物基因工程载体37主要由动物病毒构建的一类载体。3基因重组技术

4基因89痘苗病毒具有线性双链DNA，其转录和复制都在细胞质中。痘苗病毒基因组DNA分子量大（180kb），操作起来很不方便，不适于直接用作基因克隆的载体。痘苗病毒基因组中有一HindⅢ-J片段，当其被外源

DNA取代之后不会影响到病毒基因组的复制能力。痘苗病毒载体的特点：3基因重组技术

4基因重组技术的载体

4.5动物基因工程载体38痘苗病毒具有线性双链DNA，其转录和复制都在细胞痘苗病毒90痘苗病毒载体39痘苗病毒载体91痘苗病毒载体40痘苗病毒载体924193

载体与外源DNA用同一种限制酶处理后得到相同的粘性末端，碱基可以配对，由T4DNA连接酶催化，进行两种