蛋白酶液化淀粉酶活力的测定课件

第八节蛋白酶活力的测定一、蛋白酶酶活概述二、影响酶促反应速度的因素—酶促反应动力学三、蛋白酶活力的测定1、酶的定义酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质，只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可发挥催化化学反应的作用。酶及辅酶有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质，一般把结合蛋白质的蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白质部分称为辅酶。（一）酶第八节蛋白酶活力的测定一、蛋白酶酶活概述（二）酶活力的测定意义

酶不易制成纯品，会含很多杂质，真正的含酶量并不多。所以酶制剂中酶的含量都用酶活力来表示。定性鉴定提取物中某一酶是否存在，一般是根据此酶引起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘-碘化钾与反应液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。酶活力的测定：实际上是酶的定量测定，酶制剂因含杂质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。（四）酶的活力单位根据不同情况有几种酶活力单位：①国际单位IU：1961年，在最适条件下每分钟转化1μmol底物所需要的酶量为一个酶活力单位。即1IU=1μmol/min②国际单位Kat：1972年，指在最适条件下1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。即1Kat=1mol/s

Kat和IU的换算关系：1Kat=6×107IU，1IU=16.67nKat③习惯单位:在实际使用中,不同酶有各自的规定,如:

糖化酶活力单位:在规定条件下,每小时转化可溶性淀粉产生1mg还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量为1个酶单位。蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。（五）酶的比活力比活力（比活性）是指每单位质量样品中（酶蛋白）的酶活力单位数，即每mg蛋白质中所含的U数或每kg蛋白质中含的kat数；有时用单位体积中的酶活力单位表示比活力。酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是表示酶制剂纯度的一个指标。如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，其比活力也在逐步增加。（六）酶活力测定的基本原理

一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度,而是测定其催化化学反应的能力。这是基于

①在最优化条件下(最适温度、最适pH、最适缓冲液等)，②当底物足够（过量，[S]>>[E]

）

，③在酶促反应的初始阶段，

酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=K［E］）。故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念：纯化倍数与回收率纯化倍数=某纯化操作后的比活力/第一步操作后的比活力回收率=某纯化操作后的总活力/第一步操作后的总活力

总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml)（1）酶法

酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如葡萄糖氧化酶催化的下列反应：

葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧化物酶和木酚，使发生下列反应:再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）：葡萄糖＋ATP→葡萄糖-6-P其偶联-指示剂为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-P+NADP+→6-P-葡萄糖酸+NADPH+H+这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄糖激酶）的活性.酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。（2）化学法

化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理方法测出NH3和CO2，然后用比色法、滴定法、气体体积量度法等方法测出酶活性.化学分析法的优点是:不需要特殊仪器,一般有恒温水浴、滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体的测定方法，应用范围较广。缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在对化学分析法必须作出新的评价。（3）放射性化学法是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量，从而计算出酶的活性.优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。2连续反应法(ContinuousMethod)

连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能用该法测定。（1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪的普遍使用使该法更容易被人们所接受。下表即是几种连续法的例子：醛缩酶以l—P—甘油脱氢酶为指示酶的偶联测定酶活性法3、酶活力测定中应注意的几个问题酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的—些特点。

初速度的确定是在底物浓度([S])足够的条件下，通过[E]的变化来确定如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，测得反应量对时间的变化。求得几个适当时间的反应速度(反应量／反应时间)。再用反应速度对酶量作图。由图可见．其中，5min时测得的数据可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。二、影响酶促反应速度的因素－－酶促反应动力学酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其影响因素的科学。1.酶浓度[E]2.底物浓度[S]3.反应温度4.pH值5.激活剂6.抑制剂v[E]o在有足够底物和其他条件不变、无任何不利因素的情况下：（一）酶浓度对酶作用的影响v=k[E]

vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]与v关系：当[S]很低时，[S]与v成比例--一级反应当[S]较高时，[S]与v不成比例-混合级反应当[S]很高时，[S]，v不变--零级反应（二）底物浓度对酶作用的影响一些酶的最适pH值

酶最适pH胃蛋白酶1.8过氧化氢酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8酶的最适pH只在一定条件下才有意义－－

酶的最适pH不是固定的常数,其数值受酶的纯度、底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等影响pH影响酶活力的原因：

1.环境过酸、过碱可使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶变性失活；

2.pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团的解离，从而影响与底物的结合或催化；

3.pH影响底物有关基团的解离。（四）温度对酶作用的影响两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，热变性速度加快。Tv最适温度

酶的最适温度:在一定条件下，酶表现最大活力时的温度。酶的最适温度不是一个固定的常数，其数值受底物种类、作用时间等因素影响而改变。（五）激活剂对酶作用的影响——凡能提高酶活力的物质都称之为该酶的激活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。激活剂无机离子大多为金属离子:如K+,Na+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Fe2+等少数为阴离子:如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43-等小分子有机物：如Vc,Cys,GSH,胆汁酸盐等生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等（六）抑制剂对酶作用的影响——使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质，称为抑制剂（inhibitor,I）。

由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为抑制作用（inhibition）。凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用（inactivation）。不可逆抑制作用

(

irreversibleinhibition

）

抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。S+EESE+P

+I↓EI2.可逆抑制作用(reversibleinhibition)

抑制剂与酶以非共价键结合引起酶活性的降低或丧失,结合是可逆的,能够通过透析、超滤等物理方法使酶恢复活性。

抑制程度由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。反竞争性抑制（uncompetitiveinhibition）

概念抑制剂仅与酶和底物的中间复合物结合而抑制酶活性。

反竞争性抑制作用过程：

EEE+PEIISSS抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。其制剂广泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药生产中。蛋白酶按其作用pH值不同分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶等。其活力测定方法基本相同，区别仅在于作用的pH值不同。三、蛋白酶活力的测定1、原理：蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林------酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。2、试剂及仪器（1）福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。使用时用2倍体积的水稀释。（2）0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。（3）0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。（4）2%酪蛋白溶液：称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。（5）pH7.2磷酸缓冲液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液(0.02mol/L)：取28mL0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。pH6.0磷酸缓冲溶液(0.02mol/L)：0.2mol/LNa2HPO412.3mL、0.2mol/LNaH2PO487.7mL。取87.7mL0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和12.3mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。（6）标准酪氨酸溶液(100g/mL)：准确称取0.1gDL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100g。（7）仪器：分光光度计、离心机、离心管、具塞试管3、实验步骤（1）标准曲线绘制取9支试管，按下表将标准酪氨酸溶液稀释。编号012345678标准酪氨酸溶液(mL)[100g/mL]012345678水(mL)1098765432稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL)01020304050607080在上述各管中各取1mL，分别加入5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g数，即为K值。（2）酶液的制备准确称取酶粉2g，用pH7.2磷酸缓冲溶液定容至200mL，置入400C水浴浸取0.5h，用纱布过滤。根据酶活力的高低，再用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释一定倍数(使其测定的吸光度在0.2~0.4范围内为宜)。（3）测定取四只10mL离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中一支为空白管，三只为平行试管。置入400C水域中预热3~5min，在三只平行试管中分别加入1mL2%酪蛋白溶液，准确计时保温10min。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。分别吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林—酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色20min。空白管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加1mL2%酪蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。吸取1mL清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入1mL福林—酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色20min。以空白为对照，在680nm波长下测吸光度，取其平均值。4、计算蛋白酶活力单位的定义：1g酶粉，在40℃，pH7.2下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克(g)数。式中：E——一空白为对照的三支平行试管的平均吸光度4——离心管中反应液的总体积，mL10——反应时间10minN——稀释倍数W——酶粉称取量，g液化型淀粉酶(又称-1,4糊精酶，俗称-淀粉酶)能水解淀粉中-1,4葡萄糖苷键，水解淀粉为分子量不一的糊精，淀粉迅速被液化。使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消，以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。第九节液化型淀粉酶活力测定一、原理二、试剂1、稀碘液称取碘11g，KI22g，先用少量蒸馏水试点完全溶液后定容至500mL，储存于棕色瓶内备用。吸取上述溶液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水溶解定容至500mL即为稀碘液，储存于棕色瓶内。2、2%可溶性淀粉溶液准确称取可溶性淀粉2.000g(预先在100~105C烘干)，加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明。冷却后用水定容至100mL。3、0.02mol/LpH6.0的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液称取Na2HPO4•12H2O45.23g和柠檬酸(C6H8O7•H2O)8.07g,用蒸馏水溶解定容至1000mL。4、标准终点比色液A、精确称取氯化钴(CoCl2•6H2O)40.243g和重铬酸钾(K2Cr2O7)0.4878g，以蒸馏水溶解定容至500mL；B、0.04%铬黑T——精确称取铬黑T(C20H12N3NaO7S)40mg，以蒸馏水溶解定容至100mL。使用时取A液40mL与B液5.0mL混合。此混合液宜在冰箱保存，使用15天后需从新配制。5、液化型淀粉酶粉