农药对桑树叶斑病的防治毕业论文

PAGE32PAGE科类农学编号（学号）20080463本科生毕业论文云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定TheIdentificationofMulberryFungusandTheSensitivityofProchlorazinYunnan陈文智指导教师：杜飞职称讲师云南农业大学昆明黑龙潭650201学院：园林园艺学院专业：蚕学年级：2008级论文（设计）提交日期：2012年5月答辩日期：2012年6月答辩委员会主任：李文祥云南农业大学2010年5月云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定陈文智（云南农业大学园林园艺学院,昆明650201）摘要云南桑树病害的发生逐年严重，严重阻碍了蚕桑产业的可持续发展。本文以8株从云南主要桑树产区分离到的菌株为材料，采用菌落直径法对咪酰胺EC50进行测定。结果表明，咪酰胺对所分离的8个菌株中的三个菌株抑制率高：细极链格孢（3号）、甘蓝长尾交链孢霉（4号）和禾赤霉菌（5号）的EC50<0.1，桑牙枯菌（6号）的0.1＜EC50＜0.5，蔓枯病菌（7号）0.5＜EC50＜0.1，细极链格孢（8号）的1＜EC50＜2，桑干枯病（2号）和天竺葵链格孢(9号)的EC50＞17。说明咪酰胺对桑树病菌的抑制作用显著，可有效防治桑树真菌病害。关键词：咪酰胺；桑树病害；EC50；敏感性；抑制率。TheIdentificationofMulberryFungusandTheSensitivityofProchlorazinYunnanChenwenzhi(Yunnanagricultureuniversitylandscapegardeningcollege)ABSTRACTMulberry(MorusalbaL.)wasalwaysinfectedbymanyfungus,whichhadembarrassedthesustainabledevelopmentofsericiculturalindustryseverely.Inthispaper,therewere8isolatesfromthemainmulberrygrowingareasinYunnanforprochlorazwastestedusingcolonydiametermeasurement.TheEC50werealsodetermined.Therewere3isolateswithhigherinhibitionrare.EC50forAlternariatenuissima(NO.3),Alternariabrassicae(NO.4)andGibberellazeae(NO.5)lowerthan0.1,whileFusariumcerealis(NO.6)from0.1to0.5,Didymellabryoniae(NO.7)from0.5to1,Alternariatenuissima(NO.8)from1to2，Phomopsissp(No.2)andAlternariaporri(No.9)higherthan17.Theresultsshowedthatprochlorazcouldinhibitmulberrydiseases.Keyword:microphonesamide;mulberrydisease;EC50;sensitivity;inhibitionrate云南桑树病菌初步鉴定及其对咪酰胺的敏感性测定1前言1.1桑树基本情况我国是世界上种桑养蚕最早的国家，也是中华民族对人类文明的伟大贡献之一。桑树的栽培已有七千多年的历史。在商代，甲骨文中已出现桑、蚕、丝、帛等字形。到了周代，采桑养蚕已是常见农活。春秋战国时期，桑树已成片栽植。我国收集保存的桑树种质分属15个桑种3个变种，是世界上桑种最多的国家。其中栽培种有鲁桑、白桑、广东桑、瑞穗桑；野生桑种有长穗桑、长果桑、黑桑、华桑、细齿桑、蒙桑、山桑、川桑、唐鬼桑、滇桑、鸡桑；变种有鬼桑(蒙桑的变种)、大叶桑(白桑的变种)、垂枝桑(白桑的变种)[1]。原产我国中部，有约四千年的栽培史，栽培范围广泛，东北自哈尔滨以南；西北从内蒙古南部至新疆、青海、甘肃、陕西；南至广东、广西，东至台湾；西至四川、云南；以长江中下游各地栽培最多。垂直分布大都在海拔1200m以下。1.2云南省桑树主要病害桑树的病害很多，按危害桑树的部位可分为全株性病害、桑叶病害、枝干病害和根部病害。云南省危害较多有以下几种。1.2.1桑萎缩病病原：由病毒引起。症状：萎缩病有花叶型、黄化型和萎缩型三种。桑树发病，叶片缩小，叶色转黄，病叶变成圆形或半圆形。枝叶丛生矮化、细小，侧枝簇生成团，病枝无花椹。黄化型叶缘向叶背卷曲；花叶型叶缘略向叶面卷缩；萎缩型皱缩，但叶不卷曲。叶肉部分斑块状褪绿，形成黄绿相间的花叶，叶脉有小瘤状突起[2]。1.2.2桑白粉病病原：为球针壳属的真菌。它利用附着器附着在叶子表皮上，部分组织能从气孔进入叶肉组织的细胞间隙，产生吸收器，摄取营养。症状：本病多发生于枝条中下部的叶片。病叶背面产生白粉状圆形霉斑，后期病斑颜色由黄变黑，连成一片，最后出现小黑点。桑白粉病多发生在秋季湿润的环境中，病菌发芽适应的温度为23℃，桑叶硬化早的品种更易发生。严重时布满叶背面[3]。1.2.3桑褐斑病病原：病原菌属黑盘孢科粘隔孢属，初生于叶表皮下，形成分生孢子盘，分生孢子盘成熟后突破叶表皮。一般在未腐烂的病叶上越冬。症状：初期为褐色病斑，水渍状，呈芝麻大小的斑点，后逐渐扩大成近圆形或三角形。病斑周围绿色减退变黄，同一病斑在正背面叶面均有，遇到阴湿连绵的天气，吸收膨胀，有烂叶情况[4]。严重时，病斑相互连接，叶片枯黄易脱落。1.2.4桑赤锈病病原：为锈孢属的真菌。往往在病组织皮下形成菌丝体团块，以后发育成球形的锈子器，隆起泡泡纱状。由淡黄转深，逐渐成熟，最后突破寄生表皮，露出皮面。症状：本病在温度13-18℃，湿度80%以上易发生，高干桑较多，发病后桑叶局部变得臃肿，弯曲表现为畸形，叶面出现橙黄色的病斑，病斑上密布桔红色的孢子，孢子随风雨传播，引起再次侵染[1]。1.2.5桑干枯病病原：野村间座壳菌，球壳目，间座壳科，间座壳属，其无性世代是拟茎点属(Phomopsissp)。症状：3～5月桑树发芽前后，距地面40～50cm以下枝于上出现椭圆形至不规则形浅黄色病斑，后成赤褐色，病斑扩展环绕枝干一周后，病部以上枝条枯死。5～6月份病健组织交界处稍凹陷，橙黄色，上生鲨鱼皮状小疹，6、7月后小疹外皮破裂，露出黑点[2]。1.2.6桑紫纹羽病病原：为卷担子纲的真菌，菌丝体寄生在细胞间或紧贴在根部细胞外面，靠渗透压的不同，吸取养分，真菌适应条件范围广，很易生长。症状：发病后根部失去光泽，根外包一层紫色的细丝状菌丝，在靠近地面的根上有紫红色的菌丝膜，严重时变成黑褐色而腐烂，仅剩下木质部，病株很容易拔起。栓部不腐烂象管套一样留在土中，地上部分生长缓慢，枝叶细小，叶色变黄，下部叶片脱落，枝梢停止生长，芽叶枯萎，最后整株枯死。苗圃发病严重时，短期内成片死亡[5]。1.3咪酰胺防治作物病害的基本原理咪酰胺是一种广谱性杀菌剂，其系抑制麦角甾醇生物合成，具有保护和铲除作用，对多种作物子囊菌和半知菌病害有显著防效。可用于防治禾谷类作物茎、叶、穗上的许多病害，如白粉病、叶斑病，叶面喷洒为0.3～1.0kg/hm。咪酰胺可用于果树、蔬菜、蘑菇、草皮和观赏植物的许多病原菌，可与多种杀菌剂、杀虫剂、除草剂混配[6]。1.4咪酰胺对其他作物病害的防治情况20％咪酰胺·三环唑可湿性粉剂对水稻穗瘟病具有较好的防效，且对水稻生长安全，具有一定的增产作用[7]。以20％戊唑醇·井冈霉素·咪酰胺750g/hm2处理增产效果最显著，达到9．1％，其增产作用主要通过增加稻谷结实率来实现[8]。防治器苗病的关键措施是搞好水稻种子药剂处理，咪酰胺对早稻恶苗病具有很好的防治效果。温度在10～l8℃，咪酰胺用量为60ml／hm，浸种72h，不淘洗直接播种，防效达98．8％[9]。咪酰胺不同用药量处理对水稻出芽进度和芽率都有一定的影响，咪酰胺浸种后淘洗与否，对种子出芽进度影响较大而对总体芽率影响小[10]。咪酰胺不同用药量对水稻最终成穗率、每穗实粒数、千粒重和水稻产量都有一定的影响。随着用药量的增加和浸种时间的加长，成穗数呈减少趋势。综合考虑咪酰胺不同用药量的防病和增产效果，经济有效地使用咪酰胺以60ml／hm浸种72h，不淘洗处理增产效果最好，咪酰胺的用药量过高反而导致水稻减产，降低经济效益[11]。目前云南省的桑树病害的控制多用药剂，但是没有用到咪酰胺，而咪酰胺对其他作物的病害防治效果显著，因此我做这方面的实验，根据实验数据证明咪酰胺是否对桑树病害有防治效果。1.5目的意义咪酰胺是目前新兴的一种农药[6]，把其应用在桑树病害上，观察其是否对桑树病害有防治效果，以期为云南省桑树病害的防治提供理论依据。1.6试验流程5%NaClo处理植物保护学院何永红老师提供编号为SHB的病原菌5%NaClo处理植物保护学院何永红老师提供编号为SHB的病原菌病原菌分离病原菌活化曲靖、保山采集新鲜带病桑叶病原菌纯化单孢分离鉴定形态鉴定分子鉴定农药测定常温培养3～5天常温培养3～5天显微镜下 2材料与方法2.1实验仪器培养皿、500ml锥形瓶、200ml锥形瓶、酒精灯、接种针、打孔器、电子天平、培养箱、显微镜、PCR仪、摇菌箱、烘菌箱、超净工作台。药品：灭菌水、咪酰胺。2.2供试培养基PDA培养基：马铃薯220g；琼脂粉22g；葡萄糖22g；蒸馏水定容至1L。2.3病样保山、曲靖桑树上采摘下病叶2.4病菌分离与培养2.4.1病菌分离病叶置于超净工作台分离。取病部和没病部交界处组织，5%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水冲洗3次后置于PDA平板上，常温暗培养三到五天。2.4.2病菌纯化挑取单菌落置于PDA平板上，常温暗培养五天。2.4.3单孢分离病菌纯化后培养5-7天使其长出分生孢子；把显微镜置于超净工作台上，打开紫外灯灭菌30分钟左右；把枪头放在PDA平板的菌丝上挂一下，使其附着菌株的孢子；把带有孢子的枪头放到装有蒸馏水的小试管中稀释；取稀释好的孢子溶液滴1滴到载玻片的水琼脂上，把小液滴碾开放到显微镜载物台上；调好焦距左右移动载玻片找到菌株的孢子；若在水琼脂的小片区域内只有一个孢子，小心切下水琼脂放到PDA平板上培养。2.4.4病菌活化桑树病原菌的活化，按照以下步骤进行：培养皿准备：将培养皿灭菌备用；培养皿平板制备：往熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼脂培养基（PDA）中加入一定量的青霉素，充分摇动混匀后，倒入灭菌后的培养皿中，静止冷却；用无菌操作法将保存的桑树病菌移至PDA平板上，放入25℃恒温箱内培养5日，备用。2.5病菌鉴定2.5.1形态鉴定将待测菌株分别接种于PDA培养基上，25℃黑暗条件培养7天后观察菌落性状。菌落颜色参照Raynor的方法进行划分。菌株产孢后用无菌水将孢子洗脱并配制成孢子悬浮液，于显微镜下随机挑选20个孢子测量孢子的长、宽、孢子和中间色孢的颜色、顶部附属丝和基部附属丝的多少及长度等指标。然后参照《真菌志》进行鉴定。2.6分子鉴定2.6.1摇菌摇菌按一下步骤进行：做液体培养基，在200ml的锥形瓶中装入1/3的液体培养基，放到高压灭菌锅中灭菌备用；把单胞分离培养后的菌株在超净工作台中接种到锥形瓶中；把锥形瓶放到摇菌箱中固定好，在常温条件下，设置好摇菌箱进行摇菌。5到7天后取出锥形瓶。2.6.2烘菌把摇好的菌株从锥形瓶中倒入培养皿取出接种时的固体培养基，把菌落中的水吸干，放到培养皿中在烘菌箱中把菌丝烘干，用滤纸包好备用。2.6.3制备DNA在液氮中把烘干的菌丝磨碎，把磨碎的菌丝放入小试管溶液中，放到离心机中离心。离心完以后提取含有DNA的上清液。把含有DNA的上清液放入小试管中并放到-4℃的冰箱中保存备用。2.6.4PCR测定把配置好的DNA上清液放到明胶上在电泳槽中跑胶，把跑好的胶放到PCR仪中观察菌株的DNA含量。2.7农药测定2.7.1供试杀菌剂咪酰胺，浓度设置：10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml2.7.2杀菌剂的配制配制5×103ug/ml母液：用电子天平各称取0.05g的咪酰胺杀菌剂，然后各加入10ml的丙酮溶解，即配成的药剂母液；配制103ug/ml母液：取上述母液1ml，加入4ml丙酮溶解，即配成103ug/ml的药剂母液；配制咪酰胺不同浓度浓度的稀释液：（终体积5ml,因需500mlPDA，溶剂中PDA含量≤1%）150ug/ml:取103ug/ml的溶液750ul,加入4250ml丙酮；100ug/ml:取103ug/ml的溶液500ul,加入4500ul丙酮；50ug/ml:取103ug/ml的溶液250ul,加入4750ul丙酮；30ug/ml取103ug/ml的溶液150ul,加入4850ul丙酮10ug/ml取103ug/ml的溶液50ul,加入4950ul丙酮。将（3）中各浓度溶液5ml加入到500mlPDA中，制得浓度分别为1.5ug/ml,1.0ug/ml,0.5ug/ml,0.3ug/ml,0.1ug/ml的PDA平板（3次重复的量）。对照PDA平板制备：取5ml丙酮加入到500mlPDA中(3次重复的量)。桑树病菌接种：将培养5天后的桑树病菌在无菌条件下用灭菌后的5mm打孔器在菌落边缘切下菌饼，用接种针将菌饼接种于上述各含药剂的和对照的培养皿中央，菌丝朝下。每皿接4个菌，每个菌重复三次。培养菌株：将所有培养皿放入25℃恒温培养箱中培养3-4天后，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值。依据下式计算不同浓度药剂对桑树病菌的菌丝生长抑制率：抑制率（％）=对照菌落增长直径（mm）－处理菌落增长直径（mm）×100对照菌落增长直径（mm）（菌落增长直径=菌落直径-菌饼直径）根据“反应率-几率值”转换表将抑制生长率转换成抑制率几率值。然后以杀菌剂浓度的对数值为横轴，以抑制率几率值为纵轴，做出LP-D线性方程式y=ax+b。由线性公式计算各种药剂对桑树病菌各菌株的EC50(抑制中浓度)及相关系数r。3结果与分析3.1桑树病菌的鉴定3.1.1菌株分离2010年6月至10月间自云南曲靖、保山等桑树种植区的叶子和枝条上采集病样。所有菌株均采用PDA培养基进行分离，于25℃黑暗条件下培养，待产孢后挑取单孢进行纯化。菌种在PDA斜面上于4℃冰箱中保存。1号菌株从保山地区桑叶上采集得到，病斑为黑褐色大斑点状。2、3、4、5、6、7、8、9号菌株采样地为曲靖，2、3、4、5号菌株从桑树叶片上分离得到，2、4、5号菌株病斑形状为斑点状，3号菌株病斑形状为条状，病斑颜色都为黑褐色，6、7号菌株从桑树枝条上分离得到，病斑都为黑褐色斑点状，8、9号菌株从桑树叶柄上分离得到，8号菌株病斑为条状，9号菌株病斑为斑点状，颜色都为黑褐色。表1桑树病菌采集地点、分离部位和病症Table1mulberrygermscollectingsite,separatepartsanddisease菌株编号名称采集地点分离部位病斑形状病斑颜色1保2-2保山叶片斑点状黑褐色2曲4-1-1曲靖枝条斑点状黑褐色3曲6-2-1曲靖叶片条状黑褐色4曲5-1-1曲靖叶片斑点状黑褐色5曲5-1-2曲靖叶片斑点状黑褐色6曲2-2-2曲靖叶片斑点状黑褐色7曲2-1-2曲靖枝条斑点状黑褐色8曲5-2-1曲靖叶片条状黑褐色9曲3-1-1曲靖叶片斑点状黑褐色3.1.2形态鉴定结果菌落形态观察结果表明（表2，图1），在PDA平板上培养1号菌株菌落正面为粉红色，菌丝丝状，背面粉红色，孢子堆黑色较少，生长过程中产生红色色素。2号菌株菌落正面白色，丝状菌丝，背面白色，孢子堆黑色较多。3号菌株菌落正面米黄色，有同心轮纹，絮状菌丝，背面枯黄色有同心轮纹，孢子堆黑色较多，生长过程中产生黄色色素。4号菌株菌落正面米白色，有同心轮纹，菌丝丝状，背面白色，孢子堆黑色较多。5号菌株菌落正面白色，菌丝丝状，背面枯黄色，有同心轮纹，孢子堆黑色较少。6号菌株菌落正面白色，有同心轮纹，菌丝丝状，背面黑黄相间没有同心轮纹，孢子堆黑色较多。7号菌株菌落正面黑白相间，有同心轮纹，菌丝絮状，背面黑黄相间，有同心轮纹，孢子堆黑色较多。8号菌株菌落黑白相间，有同心轮纹，丝状，背面黑黄相间，孢子堆黑色较多。9号菌株菌落黑白相间，有同心轮纹，菌丝丝状，背面黑黄相间，有同心轮纹，孢子堆黑色较多。表29种菌株在PDA平板上的形态特征Table2nineinthePDAplatingstrainsthemorphologicalcharacteristics编号名称正面形态背面形态孢子堆1保2-2粉红色丝状粉红色黑色较少2曲4-1-1白色丝状白色黑色丰富3曲6-2-1米白色有轮纹絮状桔黄色有轮纹黑色丰富4曲5-1-1米白色有轮纹丝状白色黑色丰富5曲5-1-2白色丝状桔黄色有轮纹黑色较少6曲2-2-2白色有轮纹丝状黑黄相间有轮纹黑色丰富7曲2-1-2黑白相间有轮纹絮状黑黄相间有轮纹黑色丰富8曲5-2-1黑白相间有轮纹丝状黑黄相间黑色丰富9曲3-1-1黑白相间有轮纹丝状黑黄相间有轮纹黑色丰富图1菌株在PDA平板上的形态A、菌株在PDA平板上的正面形态B、菌株在PDA平板上的背面形态Figure1strainceonthePDAplatinginformA.StrainsonthePDAplatinginpositiveformB.StrainsonthebackofthePDAplatingform孢子形态观察结果表明（表3，图2），1号菌株孢子很小形状为椭圆形，光滑，近无色，成堆时绿色，长在1.64um-2.30um之间，宽在0.84um-1.38um之间，初步鉴定为亚木霉（Trichodermakoningii）。2号菌株子囊壳扁球形生于分生孢子器的周围，子囊孢子纺锤形或椭圆形，有1个隔膜，无性世代的分生孢子器扁球形，分生孢子纺锤形，长椭圆形或卵形，无色，9～14×2.5～4um，初步鉴定为桑幹枯病（Phomopsissp）。3、8、9号菌株桑树病菌孢子形状为棒状，有尾和须。本体被隔膜隔开成4个黑褐色的细胞，本体长在11.83um-15.11um之间，须长在5.43um-9.84um之间，尾长在2.02um-4.93um之间，孢子宽在2.30um-3.63um之间，初步鉴定为拟盘多毛孢（Pestalotiopsis）。4号菌株分生孢子梗榄褐色，不常分枝，有隔膜0～7个，上部屈曲，有显著孢子痕，14～48×6～13um；分生孢子单生或形成4个孢子的短链，长卵形或倒棍棒形，33～147×9～33um，有横隔膜和纵隔膜，初步鉴定为甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassicae）。5号菌株子囊壳散生，壁深蓝色或深紫色，子囊棍棒形，无侧丝，子囊孢子梭形，无色，有3个隔膜，无性阶段为禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum)，大型分生孢子聚集时呈淡红色，镰刀形或梭形，有性态为玉蜀黍赤霉(Gibberellazeae(Schw.)Petch.),属于子囊菌亚门球壳菌目赤霉属，多有3个隔膜，孢子长在9.55um-15.19um之间，宽在1.89um-2.69um之间，初步鉴定为禾赤霉菌（Gibberellazeae）。6号菌株子囊壳深蓝色或深紫色，表面光滑，子囊棍棒形至圆筒形，子囊孢子长卵形、椭圆形或纺锤形，有隔膜3个，16～25×4.5～6um，无性世代为桑牙枯镰孢霉（Fusariumlateritium），初步鉴定为桑牙枯病（Fusariumcerealis）[12]。7号菌株属子囊菌亚门真菌。无性态瓜叶单隔孢菌（AscocbcucumisFautr．etRoum），属半知菌亚门真菌。分生孢子器埋生在寄主表皮下，球形至扁球形，褐色，大小95～137.5微米；内壁密生简单的分生孢子梗，单孢无色，大小7.5～15.5×2.5～4微米，器孢子具两型：一类是小型孢子，特丰富，椭圆形或卵形，单胞无色，大小5.3～10.5×2.8～5微米。另一类是大型孢子，椭圆形至长卵形，具1隔膜，个别2～3个隔膜，隔膜缢缩，大小7.5～17×2.5～5.5微米。该菌在PDA平板上菌落初白色，扩展后呈圆形，除边缘白色外，内丝暗黑色，气生菌丝稠密发达，白色至灰白色，初步鉴定为蔓枯病菌（Didymellabryoniae）[13]。表3桑树病菌孢子形态Table3mulberrygermssporeform序号采样地点孢子形状孢子颜色孢子长（um）孢子宽（um）1保山孢子很小椭圆形近无色，成堆时绿色1.64～2.300.84～1.382曲靖纺锤形、长椭圆形或卵形无色长：9～142.5～43曲靖棒状中间4色胞同色，有尾和须。黑褐色身体长：11.83～15.11须长：5.43～9.84尾长：2.02～4.932.30～3.634曲靖长卵形或倒棍棒形榄褐色孢子痕长：14～48孢子长：33～147孢子痕宽：6～13孢子宽：9～335曲靖镰刀形或梭性无色9.55～15.191.89～2.696曲靖长卵形、椭圆形或纺锤形深蓝色或深紫色16～254.5～6表3桑树病菌孢子形态Table3mulberrygermssporeform7曲靖小型孢子椭圆形或卵形大型孢子椭圆形至长卵形无色小型孢子5.3～10.5大型孢子7.5～17小型孢子2.8～5大型孢子2.5～5.58曲靖棒状中间4色胞同色，有尾和须。黑褐色身体长：11.83～15.11须长：5.43～9.84尾长：2.02～4.932.30～3.639曲靖棒状中间4色胞同色，有尾和须。黑褐色身体长：11.83～15.11须长：5.43～9.84尾长：2.02～4.932.30～3.63图2桑树病菌孢子形态A、3号菌株孢子形态B、1号菌株孢子形态C、5号菌株孢子形态Figure2mulberrygermssporeformA.No3wassporeformB.No1wassporeformC.No5wassporeform3.1.3分子鉴定结果对上述9个菌株做ITS测序，其结果与GeneBank比对，结果显示（表4），1号为亚木霉（Trichodermakoningii）在GeneBank上的编号为AF218790.1，相似度为99%。2号为桑幹枯菌（Phomopsissp）在GeneBank上的编号为AB302247.1，相似度为99%。3号为细极链格孢（Alternariatenuissima）在GeneBank上的编号为HM467832.1，相似度为99%。4号为甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassicae）在GeneBank上的编号为JF439449.1，相似度为99%。5号为禾赤霉菌（Gibberellazeae）在GeneBank上的编号为HQ671191.1，相似度为99%。6号为桑牙枯菌（Fusariumcerealis）在GeneBank上的编号为GU584950.1，相似度为99%。7号为蔓枯病菌（Didymellabryoniae）[14]在GeneBank上的编号为EU167573.1，相似度为99%。8号为细极链格孢（Alternariatenuissima）在GeneBank上的编号为JQ417902.1，相似度为100%。9号为天竺葵链格孢（Alternariaporri）在GeneBank上的编号为JF422727.1，相似度为99%。表4分离菌株在GeneBank比对结果Table4inseparatestrainsGeneBankthantheresults序号菌种AccessionMaxidentDescriptionGenebank比对结果1保2-2AF218790.199%Trichodermakoningii亚木霉2曲4-1-1AB302247.199%Phomopsissp桑干枯菌3曲6-2-1HM467832.199%Alternariatenuissima细极链格孢4曲5-1-1JF439449.199%Alternariabrassicae甘蓝长尾交链孢霉5曲5-1-2HQ671191.199%Gibberellazeae禾赤霉菌6曲2-2-2GU584950.199%Fusariumcerealis桑牙枯菌7曲2-1-2EU167573.199%Didymellabryoniae蔓枯病菌8曲5-2-1JQ417902.1100%Alternariatenuissima细极链格孢9曲3-1-1JF422727.199%Alternariaporri天竺葵链格孢3.2云南桑树病原菌对咪酰胺的敏感性3.2.1实验结果表明（表5）咪酰胺对桑树病菌的抑制率较强，咪酰胺浓度越高对桑树病菌的抑制率越高。咪酰胺浓度为10ug/ml时抑制率最高的是3号为0.5566，最低的7号为-0.365。咪酰胺浓度为30ug/ml时抑制率最高的是3号为0.7211，最低的是8号为0.0588。咪酰胺浓度为50ug/ml时抑制率最高的是4号为0.7756，抑制率最低的是2号为0.2271。咪酰胺浓度为100ug/ml时抑制率最高的是4号为0.8424，最低的是3号为0.2961。咪酰胺浓度为150ug/ml时抑制率最高的是6号为0.881，最低的是9号为0.4471。表5桑树病菌对咪酰胺的抑制率Table5mulberrygermstomicrophonesamideinhibitionrate序号菌株抑制率浓度10ug/ml浓度30ug/ml浓度50ug/ml浓度100ug/ml浓度150ug/ml1保2-20.50710.66140.70390.66930.6222曲4-1-10.30940.25880.22710.30350.50243曲6-2-10.55660.72110.70390.29610.80134曲5-1-10.52030.66440.77560.84240.85255曲5-1-20.4950.63830.71670.79670.80836曲2-2-20.50.55560.59520.73810.8817曲2-1-2-0.3650.19570.47830.44780.66098曲5-2-10.19650.05880.28590.44710.51419曲3-1-10.27650.25880.30240.30590.4471咪酰胺对桑树病菌的抑制效果图咪酰胺对桑树病菌的抑制效果图0.000000.200000.400000.600000.800001.00000147101316192225283134374043菌株抑制率图3咪酰胺对桑树病菌的抑制效果图Figure3microphonesamidetotheinhibitionofmulberrygermsdepicted图4桑树病菌对不同浓度的咪酰胺的抑制率效果图Figure4mulberrygermstodifferentconcentrationsmicrophonesamideinhibitioneffect图5桑树病菌对不同浓度的咪酰胺的抑制效果图Figure5mulberrygermstodifferentconcentrationsmicrophonesamideinhibitioneffect3.2.2咪酰胺对桑树病菌的抑制效果从表6可以看出，云南桑树病菌对咪酰胺的EC50存在一定的差异，而且不同菌株对同浓度咪酰胺的敏感性差异较大。咪酰胺对桑树病菌的EC50从0.012774ug/ml-17.815ug/ml。EC50＞17的菌株有两株是桑干枯病（2号）和天竺葵链格孢（9号）咪酰胺对这两个菌株不敏感。0.5＜EC50＜2有两株是蔓枯病菌（7号）和细极链格孢（8号），咪酰胺对这两株病菌不太敏感。0.1＜EC50＜0.5的菌株是桑牙枯病（6号）此菌株对桑树叶斑病病菌较敏感。EC50＜0.1的菌株有3个分别是细极链格孢（3号）、甘蓝长尾交链孢霉（4号）和禾赤霉菌（5号）这4个菌株对咪酰胺的敏感性最强。证明咪酰胺能有效防治亚木霉、细极链格孢、甘蓝长尾交链孢霉和禾赤霉菌所引起的桑树病害。表6咪酰胺对桑树病菌的EC50Table6microphonesamidetomulberrygermsEC50序号菌株EC50ug/ml1保2-20.0431672曲4-1-117.8153曲6-2-10.0127744曲5-1-10.0808465曲5-1-20.0990046曲2-2-20.1375857曲2-1-20.9441328曲5-2-11.6770019曲3-1-117.025048个菌株对咪酰胺的EC50分布有一个单峰，其中6号（桑牙枯病菌）、3号（细极链格孢）、4号霉（甘蓝长尾交链孢）和5号（禾赤霉菌）这四个菌株的EC50<0.5，1.5＜EC50＜2的菌株是8号（细极链格孢）。2号（桑干枯病）和9号（天竺葵链格孢）的EC50>2。即除了EC50＞2的这两菌株外，其余6个菌株菌落对咪酰胺敏感。EC50分布图EC50分布图012345670-0.50.5-1.01.0-1.51.5-2>2EC50区域频率图6咪酰胺对桑树病菌的EC50分布图Figure6microphonesamidetomulberrygermsEC50ofmap4讨论4.1桑树病害的病原本文鉴定表明，云南省引起桑树真菌病害的病原有：细极链格孢（Alternariatenuissima）、甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassicae）、禾赤霉菌（Gibberellazeae）、桑牙枯病（Fusariumcerealis）、蔓枯病菌（Didymellabryoniae）、天竺葵链格孢（Alternariaporri）。前人研究表明云南桑树病害主要是侵染性病害，而引起桑树侵染性病害的病原物主要是真菌，属于子囊菌纲（Ascomycetes）、担子菌纲（Basidiomycetes）和半知菌类（Fungiimperfecti）。菌丝体发达，有隔膜和分枝，菌丝体可构成菌核、子座、子囊果等组织体。此外，本文还分离到一株亚木霉（Trichodermakoningii），亚木霉（Trichodermakoningii）是否对桑树的其它病原有防治效果，需进一步研究。4.2咪酰胺可以有效防止桑树病害本文中，咪酰胺可以有效防治桑树真菌病害，在供试的8个菌株中有三个菌株：细极链格孢（Alternariatenuissima）、甘蓝长尾交链孢霉（Alternariabrassicae）和禾赤霉菌（Gibberellazeae）的EC50<0.1，表明咪酰胺对桑树上的这些病菌抑制和杀菌作用很显著。2007年仇铁烨用咪酰胺防治水稻恶苗病的效果显著，每hm2用咪酰胺60ml，对秧苗期和分蘖末期恶苗病防治效果达到90％左右，齐穗期防效达到98％以上[11]；2010年郭双义、郭漠镁、罗晓新等用20％咪酰胺防治水稻纹病在水稻破口前施用750kg/hm2效果最好，防效达76．1％，水稻产量为6552．08kg/hm2[8]；2010年杨昌法用60ml／hm2的咪酰胺防治早稻恶苗病防效达98．8％[10]；2011年张金花、韩润亭、刘明一等用20％咪酰胺防治水稻稻瘟病取得了良好的成效[7]。前人研究结果表明，咪鲜胺是一种咪唑类杀菌剂，对大田作物、水果、蔬菜、皮革及观赏植物上的多种病害具有治疗和铲除作用由于它具有选择性高、杀菌谱广、高效、安全等特点，而且咪鲜安属低毒杀菌剂，未发现致畸、致突变和致癌作用[6]。对鸟低毒，对鱼和水生物中等毒性，在不同类型土壤中的半衰期为3—5个月不等。在本文中咪鲜胺也可以有效防治桑树病害，因此，以后对桑树真菌病害的防治可以采用咪鲜胺。参考文献[1]黄君霆.栽桑养蚕技术大全[M].中国农业出版社,1995:3-10.[2]华德公,胡必利.蚕桑病虫害防治,北京金盾出版社出版[M].2006:156-168.[3]柴建萍,余凌翔,谢道燕,等.桑褐斑病,桑里白粉病在云南省不同地域桑园的发生危害及防控要点[J].云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所,2011,(3):15-18.[4]朱运华.春季桑树的病虫防治[J].蚕桑茶叶通讯,1999,(1).[5]郑声镛.桑树病虫害防治学[J].中国农业出版社出版,1990.[6]何红东.新型杀菌剂咪酰胺的合成与应用[J].杭州农药总厂,2000,(6).[7]张金花,韩润亭,刘明一,等.20％咪酰胺·三环唑可湿性粉剂防治水稻稻瘟病效果研究[J].吉林省农业科学院植物保护研究所,2011,(5).[8]郭双义,郭漠镁,罗晓新,等.20％戊唑醇·井冈霉素·咪酰胺防治水稻纹枯病试验研究[J].江两省永修县农业局,2010,(24).[9]王三胜.多茵灵防治桑树褐斑病的试验调查[J].武乡县蚕桑开发服务中心,2009,122.[10]杨昌法.咪酰胺防治早稻恶苗病试验研究[J].安徽省庐江县万山镇农技站,2010,(27).[11]仇铁烨.咪酰胺和浸种灵防治水稻恶苗病的效果及应用技术[J].通州市东社镇农业服务中心,2007,(13).[12]中国真菌志[M].科学出版社,1998.256-278[13]李英,张永兵,等.甜瓜蔓枯病菌子实体法分离及A型菌株产孢条件研究[J].果树学报,2007,(1).[14]郭富民,刘少华,等.西瓜蔓枯病分子诊断技术研究[J].上海市农业科学院植物保护研究所上海市设施园艺重点实验室,2006,(3).[15]钱大志,陈伟,廖安武.桑树褐斑病的发生规律及综合防治[J].四川西昌市茧丝调公司,2005,(1).[16]王忠阳.桑树褐斑病的发生及其防治技木[J].浙江省东阳市农技推广中心,2002,(9).[17]解国文.桑树褐斑病的防治[J].云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所,2008.致谢非常感谢杜飞老师，每个实验细节和每个数据，都离不开您的细心指导。在我写论文期间，老师对我的论文进行了详细的修改和指正，并给予我许多宝贵的建议。在此，我非常感谢她一直以来的精心指导。还要感谢实验室所有师兄师姐的照顾和帮助。本篇论文已经完成，还有许多的地方需要更全面的改进，但总的来说，在撰写的过程中，我真实地学到了许多东西，也积累了不少经验，更进一步丰富了自己的知识。但由于个人能力不足，加之时间和精力有限，在许多内容表述、论证上存在着不当之处，与老师的期望还有差距，许多问题还有待进行一步思考和探究，借此答辩机会，希望各位老师能够提出宝贵的意见，指出我的错误和不足之处，我将虚心接受，从而进一步深入学习，使该论文得到完善和提高。最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢！内容总结

（1）参考文献

[1]黄君霆.栽桑养蚕技术大全[M].中国农业出版社,1995:3-10.

[2]华德公,胡必利.蚕桑病虫害防治,北京金盾出版社出版[M].2006:156-168.

[3]以保证药品质量为前提，以服务业务经营需要为目标"的原则，针对重点养护品种建立药品重点养护品种建立药品养护档案。药品养护档案是在一定的经营周期内，对药品储存质量的稳定性进行连续观察与监控，总结养护经验，改进养护方法，积累技术资料的管理手段。其内容包括药品的基本质量信息、观察周期内对药品储存质量的追踪记录、有关问题的处理情况等。药品养护档案的品种应根据业务经营活动的变化，及时调整，一般应按年度调整确定。

2、养护质量信息

按照GSP规定，药品养护人员应定期汇总、分析和上报养护检查、近效期或长时间储存的药品的质量信息。以便质量管理部门和业务部门及时、全面地掌握储存药品质量信息，合理调节库存药品的数量，保证经营药品符合质量要求，其报告内容应汇总该经营周期内经营品种的结构、数量、批次等项目，统计并分析储存养护工程中发现的质量问题的相关指标，如质量问题产生的原因、比率，进而提出养护工作改进的措施及目标。

（四）、影响药品质量的因素

1、影响药品质量的内在因素

a、易水解的药品当药品的化学结构中含有酯、酰胺、酰肼、醚、苷键时，易发生水解反应。如青霉素的分子中含有β-内酰胺环，在酸性、中性或碱性溶液中易发生分解反应和分子重排反应，其分解产物与分子重排物均无抗菌作用。故青霉素只能制成粉末，严封于容器中贮藏。

b、易被氧化的药品当药品的化学结构中含有酚羟基、巯基、香胺、不饱和碳键、醇、醚、醛、吡唑酮、吩噻嗪等基团时，易发生氧化反应。如氯丙嗪属于吩噻嗪类化合物，在日光、空气、湿气的作用下易变质失效，故应遮光，密封保存。

2、药品的物理性质与质量的关系

a、挥发性系指液态药品能变为气态扩散到空气中的性质。具有挥发性的药品如果包装不严或贮存时的温度过高，可造成挥发减量，如乙醇、薄荷等在常温下即有强烈的挥发性，还可以引起燃烧和爆炸。

b、吸湿性系指药品自外界空气中不同程度地吸附水蒸气的性质。药品的吸湿性并不限于水溶性药品，某些高分子药品和水不溶性药品同样可以吸湿,但当含有少量的氯化镁等杂质时，则表现出显著的吸湿性。

c、吸附性药品能够吸收空气中的有害气体或特殊臭气的性质被称为药品的吸附性。例如淀粉、药用碳、滑石粉等因表面积大而具有显著的吸附作用从而使本身具有被吸附气体的气味，亦称"串味"。

d、冻结性以水或乙醇作溶剂的一些液体药品遇冷可凝结成固体，这种固体会导致药品的体积膨胀而引起容器破裂。

e、风化性有些含结晶水的药品在干燥空气中易失去全部或部分结晶水，变成白色不透明的晶体或粉末，称为"风化"。风化后的药品的药效虽然未变，但影响使用的准确性,尤其是一些毒性较大的药品可因此而超过剂量，造成医疗事故。

f、色、嗅、味药品色、嗅、味是药品重要的外观性状，也是药品的物理性质之一，当色、嗅、味发生变化时，经常意味着药品性质发生了变化，所以它们是保管人员实施感官检查的重要根据。如维生素C片由白变黄，是由于发生了氧化反应；阿司匹林片出现针状结晶或浓厚的醋酸味，是由于因吸湿而发生水解反应，产生了水杨酸和乙酸；某些药品的异臭、异味