产淀粉酶菌株筛选综述

微生物与转基因技术摘要微生物目前已是生物技术领域主要的模式生物之一，微生物可以为转基因技术提供工具酶、基因载体；微生物本身也常作为目的基因的受体细胞。通过转基因的方式，可以将人类所需要的基因转移到特定物种上，从而表达出人类想要的性状。本文综述了转基因微生物在食品、农业、医药以及环境保护、传统工业改造等领域研究与应用的国内外现状。在食品生产领域，转基目微生物主要用于食品用群制剂的生产，如凝乳酶．淀粉酶，蛋白酶等，转基因酵母也应用于啤酒的生产．在农业生产领域，转基因微生物主要用于微生物农药、微生物肥料和饲料酶制剂的生产．在医药生产领域，转基因微生物主要用于兽用和人用疫苗的生产，以及利用转基因镟生物生产某些药物。此外，转基因微生物在环境保护，传统工业的改造、印染业，以及新能薄开发等方面也有应用，本文也同样大致介绍了一些目前国内外关于微生物转基因方面的前沿研究。关键词微生物转基因，DNA重组技术，目的基因，基因载体引言转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段[1]的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的基因片段。基因片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。1980年代以来，现代生物技术迅速发展，在医药、农业、食品、化工、环境和能源等领域发挥了巨大的经济效益和社会效益。自1982年美国FDA批准了世界上第一例基因工程药物重组人胰岛素的正式生产以来，以基因工程药物为主的各种基因工程产品陆续实现商品化生产。其中，转基因微生物是基因工程产品的重要组成部分，在农业生产、食品加工、医药生产以及环境保护等领域得到了广泛的应用。微生物与转基因技术1.微生物与转基因工具酶转基因技术中，需要一些基本的工具酶，如对供体生物的DNA进行切割以获得目的基因的限制性核酸内切酶、DNA聚合酶类、DNA连接酶、核酸外切酶、反转录酶等。DNA聚合酶类包括DNA聚合酶Ⅰ、KlenowDNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶等。耐热DNA聚合酶是一类在高温下具有聚合活性的DNA聚合的，来自于嗜高温的细菌，方要应用于PCR反应中，具体种类有产自嗜热水生菌的TaqDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶，其中TaqDNA聚合酶，使DNA的体外复制变得异常简便和常规化，大大加快了生物工程、基因组等分子生物学研究的进程，年销售利润达到上亿美元。依赖于DNA的RNA聚合酶包括SP6噬菌体RNA聚合酶、T4噬菌体RNA聚合酶或T7噬菌体RNA聚合酶，这类酶无需引物，但识别DNA上特异性位点（启动列），合成RNA。核酸酶S1，来源于米曲霉，具有3’->5’外切核酸酶活性，能特异性降解单链DNA或RNA的核酸酶，基因工程中用于黏性末端的平切。核酸酶BAL31，来源于交替单胞菌BAL31，对单链DNA和RNA具有类似核酸酶S1的催化活性，能同时从3’-端和5’-端降解双链DNA并使其缩短大约25%长度，催化反应需要Ca2+。基因工程中用于缩短DNA和构建嵌套缺失体也应用于限制酶图谱制作等。2.微生物与转基因载体转基因载体应具有以下基本特性：①必须是一个可独立复制DNA或复制单位；②分子量尽可能小，便于分离纯化和进行离体操作；③分子内具有不影响载体复制、生长的区域，区域中包含多种限制性内切酶的单一切点，确保能在切点内与外源DNA发生重组；④具有区分转化、重组与非重组的多种可供选择的遗传标记（如营养缺陷型、抗药性、噬菌斑形成能力等）。原核生物的常用克隆载体包括质料载体、λ噬菌体载体、柯斯质粒载体、原核生物的人工染色体载体等。酵母菌中的外源基因克隆，可就用载体、电转化和醋酸导入等方法。依据酵母菌的质料载体构成与复制方式不同，可划分为：整合性载体、附加体载体、复制型载体、着丝粒载体和酵母人工染色体共5类。微生物与转基因技术的应用一．转基因微生物在食品生产领域的应用1．转基因微生物生产食品用酶制剂直接用作食品的转基因微生物如发酵食品菌等目前在市场上尚未出现。在国外，将转101基因细菌和真菌生产的酶用于食品生产和加工已经比较普遍，如奶酪生产中使用的凝乳酶、啤酒和饮料生产中的淀粉酶，以及面包等食品生产中的蛋白酶等。在食品工业中，微生物可用于生产酶制剂、氨基酸、有机酸、维生素、色素、香料等添加剂。氨基酸、有机酸、维生素、色素和香料等生产菌种的改良涉及到的基因较多，调控复杂，不易利用基因工程技术进行改良，大多仍处于研究阶段，只有少数氨基酸和维生素以转基因微生物生产。而酶制剂应用广泛，涉及的基因单一，适合利用基因工程技术进行改良(王家勤1999)。目前工业上着重于对乳酸菌和酵母菌的基因工程改良。利用基因工程技术改良菌种生产的第一种食品酶制剂是凝乳酶，始于1998年。这一技术已得到了广泛的应用，到2001年，已有17个国家使用转基因微生物的凝乳酶生产干酪。据估计，美国有2，3到3／4的奶酪在生产过程中使用了遗传工程凝乳酶(刘谦等2001)。目前被批准使用的转基因微生物凝乳酶产品有3种，其基因表现的宿主分别为A．niger，KL-∞fis以及E．coilK12。(朱文深2001)。在全球范围内，很多企业已成功地应用转基因微生物生产食品酶制剂，如丹麦的Novo-Nordisk公司和荷兰的Gist．Brocades公司。生产食品酶制剂的转基因微生物包括浅青紫链霉菌、锈赤链霉菌、枯草芽孢菌、地衣芽孢杆菌、特氏克雷伯氏菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等(陈红兵等2001)。2．转基因酵母在啤酒葡萄酒生产上的应用转基因酵母菌在食品生产上的应用也较为多见，目前已获准商业化使用的转基因酵母菌有面包酵母和啤酒酵母。利用转基因啤酒酵母所生产的啤酒已被消费者试用，但尚未在市场上得以推广。转基因方法还用于葡萄酒酵母工程菌的育种，已对苹果酸．乳酸发酵基因及其节基因进行了定位和序列分析，试图把乳酸菌中的苹果酸一乳酸发酵酶基因通过遗传转化导入葡萄酒酵母中，使葡萄酒酵母在酒精发酵的同时，赋予其苹果酸．乳酸发酵降酸的功能(张春晖等2000)。转基因微生物在农业方面的应用传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素等直接从生物体的组织、细胞或血液中提取，受原料来源限制，价格十分昂贵。利用基因工程方法制造转基因的工程菌，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品，如细胞因子（即淋巴因子如白细胞介素-2、干扰素）、抗体、疫苗、激素等。转基因产品约有2/3用于人类疾病治疗和预防性用药，它给制药工业带来了革命性的变化。据估计，人用蛋白药物的全球市场，每年可达200亿美元，而且还在持续增长。在这种巨大利益驱使下，世界各大制药公司相继投入巨资用于这些重组蛋白药物的研究开发。1.重组人胰岛素生产胰岛素是由胰岛B细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性胰岛素主要用来糖尿病治疗，糖尿病患者早期使用胰岛素和超强抗氧化剂如（注射用硫辛酸、口服虾青素等）有望出现较长时间的蜜月期。传统上，胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，低产，费用高。1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。1982年，美国ElyLili公司使用重组大肠杆菌生产第二代胰岛素——人胰岛素，这是第一个上市的基因工程药物。对比动物胰岛素，人胰岛素较少发生过敏反应或者胰岛素抵抗，所以皮下脂肪萎缩的现象也随之减少；由于人胰岛素抗体少，所以注射量比动物胰岛素平均减少30%；人胰岛素的稳定性高于动物胰岛素，常温25℃左右常温可保存人胰岛素4周。在起效时间、峰值时间、作用持续时间上不能模拟生理性人胰岛素分泌模式。需在餐前30分钟注射、有较高的夜间低血糖风险。2.人生长激素人生长激素（hGH），又叫做促生长素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病诸如垂体性侏儒症、特纳氏综合症、组织坏死等，都具有良好的治疗效果。hGH的来源是从死人的脑垂体中提取，这种制备方法不仅材料来源困难，无法大量生产，而且存在安全性问题。1985年，这种由E.coli生产的rhGH已成为得到美国政府许可生产和使用的第二种基因工程药物。3.基因工程疫苗自从200多年前人们发现，预先接种过牛痘的人能够抵御天花感染的现象，并据此提出免疫的概念后，疫苗就已被广泛地用来预防多种传染病的传播。基因工程疫苗是使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗。基因工程疫苗包括基因缺失活疫苗、基因工程亚单位疫苗、核酸疫苗、蛋白工程疫苗。三．转基因微生物在农业方面的应用1997--1999年，经农业部农业生物基因工程安全委员会批准的转基因微生物的中间试验有29项，其中22项为植物用转基因微生物，7项为兽用转基因微生物：同期经批准的转基因微生物的环境释放有7项，其中6项为植物用转基因微生物，1项为兽用转基因微生物。转基因微生物农药1980年代中期以来，国内外在防病杀虫转基因微生物的研究方面取得了一系列突破性进展，转基因微生物制品领先于转基因植物进入商业化应用，其中重要的有防治虫害的Bt高效工程菌剂、转基因病毒制剂、防治植物霜冻的无冰核活性工程菌、防治果树根癌病的放射土壤杆菌工程菌K1026等。中国的转基因微生物农药主要以苏云金芽孢杆菌(Bt)基因工程制剂和转基因病毒制102剂为主，一批拥有自主知识产权的重组微生物农药产品已初具产业规模，转Bt基因重组杆状病毒、高毒广谱杀虫工程菌、棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂等多种基因工程微生物杀虫剂经农业部安全性审批获准进入田间释放或中间试验。(1)转基因Bt菌剂。苏云金杆菌(简称Bt)杀虫剂是公认的一类无公害的生物农药，是目前国内外生产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。自1981年Schnepf分离了第一个cry基因以来，全世界从Bt中发现并正式命名的ICP基因已有42大类，总数超过250种。国外已有CoMer、MVP等10余种Bt工程菌制剂投入商业化应用。美国Ecogen、Novartis、Mycogen和ResearchSeed等公司生产的转Bt遗传工程菌己通过美国环保局和农业部的批准进入商业化生产。美国Mycogen公司将苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白基因导入荧光假单孢菌，并在其发酵生成晶体蛋白后将菌体细胞灭活，用这种“生物微囊”技术加工的菌剂对紫外线的抵抗力可提高36倍，自1991年起已有MVP、M．Trak及M．Peril等多个产品获准登记，用于防治小菜蛾等蔬菜害虫、马铃薯甲虫和玉米螟等。(2)转基因病毒杀虫剂。国外近年尝试通过基因工程方法将不同的外源杀虫基因导入野生型苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcMNPV)，研究取得了良好的进展。中国科学家将蝎神经毒素基因(AalT)和缺失蜕皮激素UTP葡萄糖苷转移酶(egt-)基因导入棉铃虫核多角体病毒(HasNIⅣ)，得到了杀虫速度明显加快的重组HaSNPV(黄大防2003)。武汉病毒所在国际上首次成功构建了3株缺失egt基因的霞组中国棉铃虫病毒，被农业部“农业微生物遗传工程体安全管理委员会”审批为安全性等级I级，分别于1998年、1031999年、2000年批准进入田间中间试验和环境释放，其中重组棉铃虫病毒1号是中国第一例通过国家安全性评估进入田间中间试验和环境释放的重组病毒杀虫剂，目前正进行中试生产，可望成为中国第二代病毒杀虫剂(中国科学院武汉病毒研究所)。(3)防治植物霜冻的转基因工程菌。冰核活性细菌是诱发和加重植物霜冻的主要因素，降低冰核活性浓度可有效减少植物霜冻的发生。因此，利用无冰核活性细菌的生态位点和营养竞争作用可以减少冰核细菌的数量，有效减轻植物霜冻现象的发生。防治植物霜冻的无冰核活性工程菌于1982年研制成功，1987年进入田间试验，防治草莓霜冻效果达70％以上。。(4)防治果树根癌病的放射土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)K1026。这一工程菌的防病效果和稳定性高于自然株K84。通过酶切去除pAgK84质粒中负责细菌接合转移的编码基因及其相邻的EcoRI片段并经同源交换构建工程菌K1026，增强了生物防治效果的稳定性。1991年和1992年，这种新构建的工程菌以NoGall为商品名在澳大利亚和美国获准登记，成为世界上第一例商品化生产的植物病害生物防治基因工程细菌制剂，目前已在澳大利亚、美国、加拿大、日本和西欧的一些国家推广应用。(5)对昆虫真菌的遗传改良。白僵菌(Beauveria)和绿僵菌(Metarhizium)是所有记载的800多种昆虫病原真菌中应用效果最好的菌种，这类微生物杀虫剂可以多次感染害虫而引起流行，但侵染过程易受环境医I素影响，毒力发挥较慢。昆虫真菌分子生物学和生物技术研究在国内外起步稍晚，但近年来某些关键技术己取得突破。中国在国际上首次建立了球孢白僵菌(且bassiana)的农杆菌转化体系，并从该菌中克隆了类枯草杆菌蛋白酶基因(Bbprl)、几丁质酶基因(Bbehitl)和真菌孢子形成相关基因。新构建的含有前两种基因的工程菌较单一Bbprl基因工程菌杀虫毒力提高近l倍，侵染致病时间缩短近一半。2．转基因微生物肥料1980年代以来，采用分子技术对外源固氮基因及其调控基因进行转移而构建出的新型重组固氨微生物已进入大规模田间试验和商品化生产。例如，日本率先将nifA固氮基因导入联合固氮菌而构建出耐铵工程菌；美国Bosworth等构建成含rtifA和dctABD等多种固氮相关基因的重组根瘤菌，在田问试验中表现良好(朱守一1999)：美国ResearchSeeds公司的转基因中华苜蓿根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)RMBPC-2已于1997年获准进行有限商品化生产，这是美国环保局批准进入商品化生产的第—例属间重组固氮微生物(刘谦等2001)。中国的固氮研究在固氮基因的克隆、调控、耐铵、泌铰及高效固氮菌株构建等方面取104得重大进展。已分离鉴定出lO余株高固氮活性的固氨菌株，构建了一系列耐铵、泌铰高效固氮工程菌株，比野生菌有更好的节肥增产效果3．应用转基因微生物生产饲料酶制剂一些饲料酶的生产已开始利用基因工程技术。以基因工程菌生产的饲料酶也称重组酶。黑曲霉(AspergiUusniger)、米曲霉(Aoryzae)和无花果曲霉(Aficuum)等丝状真菌可用于生产包括酶在内的重组蛋白(林藩平2000)。中国农科院饲料所和生物技术研究中心从1996年开始从黑曲霉中克隆植酸酶基因，研制出能高效表达植酸酶的重组毕氏酵母用于生产植酸酶，1999年底完成中试和试生产，2000年初通过农业部基因工程安全委员会审查，获准商业化生产。重组酵母表达的中性植酸酶量比原始的天然菌株提高4000倍以上，比专利中报道的且国外正在用于生产的畜禽用酸性植酸酶的基因工程曲霉高近l倍。四、转基因微生物在材料方面的应用由微生物合成的有机醇、酸、酯是十分有用的工业原料，在过去数十年得到广泛应用。目前，有关的研究工作正在围绕菌种改良尤其是利用转基因技术大幅度提高微生物的生产能力并改进其性能而开展起来。1．生物可降解材料生物可降解材料是指通过自然微生物（细菌、真菌等）的作用可发生降解的高分子。由微生物合成的生物可降解材料主要是PHA构成的生物塑料，包括PHB、PHBV和PHBH，目前都已实现商品化，不过，生物塑料的成本远远高于合成塑料，这是它难以大规模生产和利用的主要原因。PHA最早是在巨大芽孢杆菌中发现的，现在已知有90多个细菌属可以合成PHA，最常见和丰度最高的PHA是PHB。在仅添加葡萄糖而限制氮或磷时，真氧产碱菌中的PHB积累量可达细胞干重的80%，PHB可被环境细菌分泌的PHB脱聚合酶完人降解，生成CO2和H2O。真氧产碱菌中合成PHB的3个酶（3-酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA合酶）的编码基因——PhaA、PhaB、PhaC已被克隆，并组成操纵子后导入大肠杆菌中表达。当大肠杆菌在氮源受限而碳源过剩的条件下生长时，可以大量积累原来所不能合成的PHB，其产量已达到真氧产碱菌的50%，。PHB的聚合度通常在103-104之间，PHB颗粒的直径为0.2-0.5μm。在含有葡萄糖的培养基中加入丙酸或戊酸，可诱导真氧产碱菌合成1种由羟基丁酸和羟基戊酸单体构成的多单体随掺入的共聚物——PHBV。产PhaA、PhaB、PhaC基因转移到大肠杆菌中，同时解除其对组成型表达的丙酸代谢途径基因的转录调控作用，已使该重组大肠杆菌菌株能有效地利用丙酸合成PHBV。在正常情况下，真氧产碱菌不能利用乙醇作为碳源，但通过导入醇脱氢酶基因可构建出能利用乙醇和丙醇的重组真氧产碱菌株条的，它可将乙醇和丙醇转化成乙酰辅酶A（PHBV前体）。2．生物化工原料工业发酵生产丙酮和丁醇的历史悠久，并鉴定出以淀粉为原料生产丙酮和丁醇的梭状菌属的丙酮丁醇梭菌。可是，由于产物的最终产量偏低、副产物较多，生产原料价格高等原因，使丙酮和丁醇发酵业长期停滞不前。目前梭状菌属的分子遗传学研究不断深入，若干与丙酮和丁醇合成有关的基因已相继被克隆，并且建立了新的宿主表达系统，为有机酸醇的代谢途径提供了契机。五．转基因微生物在其他方面的应用转基因微生物在环境保护，传统工业改造以及新能源开发利用方面有着巨大的潜力。1.环境保护方面转基因微生物可用于海洋石油污染的治理，以及生活污水以及工业废水等的处理。许多微生物“以污染物为食”，如碳水化合物类污染物、蛋白质类污染物和脂肪类污染物，都能被各种微生物分解，成为它们生长的能量。利用微生物解决环境污染有巨大发展潜力，越来越多人开始专注开发环保用微生物菌剂。这种菌剂是由一种或多种微生物组合或混合培养制成的产品，通过它们的生长代谢将污染物降解，达到净化效果。由于大多数污染物都需要几种微生物一起发挥作用，所以复合微生物菌剂的应用较多。其中有一种基因工程菌，是将多种微生物的降解性基因从细胞中分离出来，组装到一个细胞中，使其集多种微生物的降解功能于一身，可以同时降解多种污染物，“相当于转基因”。目前采用转基因光合细菌生产糖和乳酸等化合物有多种益处，能够减少二氧化碳排放。还有科学人员在紫羊茅中分离出一种金属硫蛋白基因MTlike,通过构建衣藻外源基因系统，使该基因在系统总高效表达，筛