植物转化载体的构建课件

植物转化载体的构建植物转化载体的构建1内容一植物基因工程载体的种类和特征二根癌农杆TI质粒三T-DNA的结构特点和功能四T-DNA转移的机制五植物基因转化载体系统六发根家杆菌的RI质粒七无选择标记基因植物转内容一植物基因工程载体的种类和特征2笫一节植物基因工程载体的种类和特征生物载体介导的遗传转化非载体介导的遗传转化种质转化系统直接转化系统生物载体介导的遗传化根据截体的不同可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗传转化.笫一节植物基因工程载体的种类和特征生物载体介导的遗传转化3植物转化基因的功能:一它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去,并且整合到宿主细胞的基因组DNA上.二它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列,即启动子和复制子起始点位点,以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达.植物转化基因的功能:一二4一病毒载体1.单链的RNA植物病毒2.单链的DNA植物病毒3.双链的DNA植物病毒以其优点如下;植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞,并且系统地分布到整个植株,无需经过从原生质体再生植株的过程,简化了植物基因工程中外源基因的传递过程.一病毒载体1.单链的RNA植物病毒5

病毒具有较高的自我复制能力,在转化植物中可以得到高拷贝的外源基因,有利于外源基因的表达和功能的实现,可以产生大量的外源蛋白质.

植物病毒载体感染植物后,病毒载体的DNA一般不整合到植物细胞核DNA上,不影响植物基因组的其他功能基因的表达.病毒具有较高的自我复制能力,在转化植物中可以得到高拷贝的6植物基因工程病毒载体存在的缺陷:病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上,不能按孟德尔规律传递给后代;病毒载体仍然存在致病的可能性,可能会诱发植物产生病害;病毒载体本身的不稳定性,病毒载体中的外源基因很容易丢失;病毒基因组发生突变的频率也很高.植物基因工程病毒载体存在的缺陷:病毒载体不能把携带的外源基因7二质粒载体格兰阴性菌土壤杆菌属(特征是能够诱发植物产生肿瘤)根瘤菌属在根瘤土壤杆菌中,决定冠瘿病的质粒TI质粒,在毛根土壤杆菌中,决定毛根症的质粒为RI质粒.它们能引起植物细胞产生病症外,还是理想的基因克隆载体.通过它们可以将外源的DNA转移到植物细胞,并再生出能够表达外源基因的转基因植物.二质粒载体格兰阴性菌8

笫二节根癌农杆菌TI质粒TI质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA分子,约有150200KB.章鱼碱型胭脂碱型农杆碱型农杆菌素碱型(琥珀碱型)笫二节根癌农杆菌TI质粒TI质粒是根癌农杆菌染色9在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中,都含有控制肿瘤诱发的两种基因区段:T区段~在肿癌形成期间,从根瘤土壤杆菌的TI质粒上导入植物细胞的DNQ片段,约为23KB.和毒性区段~在细菌中表达的数个致瘤基因,与T区段从细菌转移到植物细胞的遗传有关.在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中,都含有控制肿瘤诱发的10一TI质粒的有关结构T—DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,从TI质粒上导入植物细胞的一段DNA.VIR区:VIR上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞遗传过程有关,能够使农杆菌表现毒性.CON区:冠瘿碱能激活TRA基因,诱导TI质粒转移.ORI区;调控TI质粒的自我复制,故称复制起始区一TI质粒的有关结构T—DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,11从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核DNA,叶绿体DNA,线粒体DNA进行分子杂交证实T-DNA仅存在于细胞核中.大小在23KB左右,都含有一段8KB左右的核心区.胭脂碱T-DNA是一条约23KB的连续DNA片段,两端各有一段25BP的重复序列,编码13个基因.章鱼碱T-DNA由两条分离T-DNA片段组成,各自带有相应的左边序列和右边界序列.长约14DB,携带8个基因,包括章鱼碱合成酶基因和致瘤基因.从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核DNA,叶绿体DNA,线粒体DN12T-DNA两个重要特性保留T-DNA两端的末端序列,然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去,从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力.毒性区对T-DNA的作用既可以以顺式作用进行,又可以以反式进行,T-DNA两个重要特性保留T-DNA两端的末端序列,然后用一13VIR区VIR区段总长度大约35KB,由7个互补群组成,分别为VIRA,VIRB,VIRC,VIRD,VIRE,VIRG,VIRH.毒性区有两种情况:一种是组成性表达,即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平.一种是植物诱导性表达,即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时,植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达.VIR区VIR区段总长度大约35KB,由7个互补群组成,14下面对各VIR基因的性质,功能及作用机制进行阐述VIRA:由单一基因所组成,大小为2.8KB,编码1条92KDA的多肽.VIR基因所编码的蛋白质与一些细菌中起转录调节作用的基因产物有很高的同源性.功能:是帮助植物细胞接受植物信号分子,然后启动毒性区表达.VIRG:小于VIRA,只有1.2KB,为单拷贝基因,只能编码一条多肽,即DNA结合化蛋白,下面对各VIR基因的性质,功能及作用机制进行阐述VIRA:15VIRG的调节方式有两种形式:它的全诱导表达需要正常功能的完整VIRA和VIRG基因存在.依赖于自身编码的VIRG蛋白.在乙酰丁香酮存在时,野生型菌株的VIRG可以由低PH和磷酸饥饿诱导而低水平表达.VIRG的转录方向是从左到右的,最初的翻译起始位点只能是48-50位的VIRG.VIRG作为一种DNA结合蛋白,可以结合到VIRB,C,D,E,G和H操纵的5’端非转录区.VIRG的调节方式有两种形式:它的全诱导表达需要正常功能的完16VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为16.2,47.4,21.3,和75.8KDA的四种不同的蛋白分子.VIRD1编码一个DNA松弛酶,这种酶与DNA拓扑异构酶I作用类似,它先在DNA链上切割一个缺刻,使DNA解旋后再封闭,降低了DNA超螺旋数目.VIRB:有两种信号肽序列:一种与细菌输出信号肽序列相似.另一种信号序列属于脂蛋白信号序列.VIRC:是毒性区各位点惟一以反针方向转录的位点,含有两个开放阅读框架VIRC1和VIRC2,分别编码1个约25KDA的蛋白质和个约22KDA的蛋白质.VIRH:对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用.VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为16.217TI质粒的生物学功能控制冠瘿碱的新陈代谢以TI质粒为媒介进行接合转移TI质粒的生物学功能控制冠瘿碱的新陈代谢18笫三节T–DNA的结构特点和功能一T-DNA的结构特点二T-DNA的编码基因及功能笫三节T–DNA的结构特点和功能一T-DNA的结构特19T-DNA的结构特点TI-质粒的T-DNA分子J单拷贝或者是多拷贝的形式随机地整合在植物核基因组DNA的位子.整合的胭脂碱T-DNA分子结构简单.单一片段形式存在.整合的章鱼碱T-DNA分子人结构比较复杂.有两片段形式.左侧区段具有控制冠瘿瘤形成的基因,右侧区段参与冠瘿瘤碱生物合成的蛋白酶的编码的基因.章鱼碱和胭脂碱TI质粒之间,边缘区序列相当保守.T-DNA的结构特点TI-质粒的T-DNA分子J单拷贝或者是20T-DNA的结构特点植物冠瘿瘤的诱发并非是由整个TI质粒的侵染所致.它的形成是由T-DNA的3个基因:IAAM,IAAH,IPT.在T-DNA的5’端和3’都有真核表达信号,如TATA-BOX,AATAA-BOX等.分为左边界(BL和TL),右边界(BR和TR)T-DNA的结构特点植物冠瘿瘤的诱发并非是由整个TI质粒的侵21T-DNA上的编码基因及功能科学发现T-DNA的编码基因很有可能是进化中补TI质粒铺获的真核基因．为此，ＯＣＳ和ＮＯＳ基因的启动因子，在各种不同的植物中都有功能活性．在Ｔ－ＤＮＡ区中引入转座子，使特定的基因发生突变，突变后的肿瘤细胞中Ｔ－ＤＮＡ的１个或多个转录产物随之消失．基因突变后不能转录出它所编码的ＭＲＮＡ，这时可观察到带有突变基因的Ｔ－ＤＮＡ的植物细胞的表型，从而确定基因转录产物的功能．用编码冠瘿碱合成酶及分解借调基因和诱发肿瘤的基因证明了编码两类转录产物的基因序列．T-DNA上的编码基因及功能科学发现T-DNA的编码基因很有22Ｔ－ＮＡ上的编码基因及功能１．ＡＵＸ基因突变将阻断肿瘤形成，细胞生长素的大量合成，使细胞分裂素与生长素的比值升高．２ＴＭＳ和ＡＵＸ基因的表达，使转化植物细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性性，引起癌变．Ｔ－ＮＡ上的编码基因及功能１．ＡＵＸ基因突变将阻断肿瘤形成，23笫四节Ｔ－ＤＮＡ转移的机制T-DNA在植物染色体中的插入是随机的,插入位点常有以下特点:1.T-DNA优先整全到转录活跃的植物基因位点;2.T-DNA与植物DNA连接处富含A,T碱基对;3.植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程序的同源性.笫四节Ｔ－ＤＮＡ转移的机制T-DNA在植物染色体中的插入是24T-DNA转移的模型和过程DSBR模型基本过程:首先是植物靶DNA产生双链断裂,解旋的靶DNA与双链T-DNA退火;单链部分被3’-5’外切酶或修复系统中单链特异的核酸内切酶去除;然后进行修复连接,并由此导致了DNA的整合和缺失,靶DNA和T-DNA缺失程度由靶DNA与T-DNA互补顺序位置所决定.SSGR模型:1.在靶DNA上形成一个缺刻,然后由于部分解旋或5’-3’外切酶消化形成缺口.2.单链T-DNA靠近缺口,由于两链存在短的DNA互补顺序,于是退火形成异质双链.3.T链未配对的5’-3’单链断部分被除去,T-DNA末端与靶DNA连接.4.在靶DNA链的互补链产生缺刻,以游离的T-DNA末端为引物修复合成笫二条T-DNA.T-DNA转移的模型和过程DSBR模型基本过程:SSGR模型25T-DNA整合的机制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和VIRE基因在转录水平上的表达受植物信号分子.VIRA和VIRG是属于组成型表达的基因.目前普遍认为T-DNA是以T链形式向植物细胞转移的,而不是T-DNA分子.它们的形成取决于VIRD1入VIRD2两种蛋白.T-DNA整合的机制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和26DNA非正常重组1.两个基本步骤:DNA末端的生成.DNA末端再连接.2.特点:T-DNA瞄准整合的位点没有序列特异性.整合部位的植物DNA有小段与T-DNA端点附近域同源的序列.在重组后的结合可能找到一些额外的核苷酸序列;称为填充DNA.重组结合部的靶有少量缺失或存在更大部位的重组.DNA非正常重组1.两个基本步骤:DNA末端的生成.DNA末27DNA非正常重组3.基本过程;在植物靶DNA上出现一个缺刻,随着解链宿主细胞的5’-3’外切酶活性使缺刻扩大成裂口.T-DAN侵入裂口,末端与靶DNA单链上的少数核苷酸配对形成异源二倍体.T-DNA悬挂在外侧的末端被切割除去,T-DAN与靶末端相连.靶DNA上链出现缺口,然后以整合后的T-DNA链为模板合成T-DNA的笫二条链,从而完成整个整合过程.DNA非正常重组3.基本过程;28植物转化载体的构建课件29整合时靶DNA所处的环境不同可能使T-DNA的整合过程不同;1.当T-DNA内部与靶DNA同源时,截短的T-DNA的可能远离T-DNA末端.2.填充DNA的产生可能有四种情况:来自植物染色体组的另一段DNA序列直接与断头相连,片段大小可以从一段很小的寡核苷酸到约300BP长的冈崎片段.滑动错位修复过程.复杂填充DNA生成.填充DAN是TI质粒左端序列的一段序列.整合时靶DNA所处的环境不同可能使T-DNA的整合过程不同;30笫五节植物基因转化载体统一以Ti质粒为基础的遗传转化系统二构建Ti质粒载体的策略

笫五节植物基因转化载体统一以Ti质粒为基础的遗传转化系31１.野生型的Ti质粒

它是植物病原细菌（根癌土壤杆菌）所携带的长度为１８０～２００kb的大质粒．Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体．但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子质量过大，一般为１６０～２４０kb，在基因工程中难以操作．②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点．③T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡．④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制．⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的冗余基因．１.野生型的Ti质粒它是植物病原细菌（根癌土壤杆菌）所32２.Onc卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的Ti质粒载体．在这种Onc载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322区段所取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。２.Onc卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的Ti质粒载体33ONC卸甲载体常用的受体Ti卸甲载体有三种：⑴pGV3850载体：是一个由胭脂碱型Ti质粒pTiC58衍生出来的Onc卸甲载体。⑵pG2250载体:也是属于含pBR交换序列的卸甲载体，但它使pBR322DNA成为一种多用途受体质粒．pG2250载体是章鱼碱型Ti质粒pTiB6S3的衍生质粒．它也是被切除了Onc基因的载体．⑶pTiB6S3－SE载体：是由章鱼碱型Ti质粒衍生的卸甲载体．TR-DNA完全缺失，TL-DNA仅剩BamHI-8的部分片段．其中含有“左侧内部同源区”．ONC卸甲载体常用的受体Ti卸甲载体有三种：343共整合载体系统共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经过突变后的TI质粒和中间载体的两部分.共整合系统的特点是具有两个独立的质粒:农杆菌TI质粒和大肠杆菌中间载体.这两个质粒具有一同源区,在农杆菌和大肠杆菌接合后经过同源重组形成一个大的共整合质粒.隔端载体系统是一种较有效的共整合载体系统,它的左右边界分别位于两个独立的质粒上.3共整合载体系统共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成353共整合载体系统常见的共整合载体质粒有以下几种:PGV3850系统PGV2260系统PMON200系统3共整合载体系统常见的共整合载体质粒有以下几种:364双元载体系统双元系统的特点:两个质粒即穿梭质粒和TI质粒,在接合后可以自主性共存于同一农杆菌细胞中.双元系统中的农杆菌质料是一个经过改造的TI质粒,具有VIR基因和农杆菌复制起始子,但没有T-DNA边界序列.接合合,两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中.当农杆菌感染受伤的植物时,TI质粒上的VIR基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用,从而将T-DNA转移进入植物基因组,这就是双元载体系统的特点.4双元载体系统双元系统的特点:374双元载体系统双元载体系统避免了共整合步骤.这种系统需要两个基本点彼此分离的质粒，一个多功能克隆载体质粒，在大肠杆菌和土壤农杆菌中都能够复制．它该具备以下三个特点；在它Ｔ－ＤＮＡ末端序列内含有单一克隆位点和植物选择标记基因．Ｔ－ＤＮＡ区以外含有细菌选择标记基因，以便选择转化菌株．可以由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中．4双元载体系统双元载体系统避免了共整合步骤.这种系统需要两384双元载体系统无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，称三亲交配法．4双元载体系统无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间39二构建ＴＩ质粒载体的策略１．中间载体策略基本原理是把Ｔ区片段克隆到普通载体ＰＢＲ３２２上，把外源基因插入到该Ｔ区后再导回Ａ，ＴＵＭＥＦＡＣＩＥＮＳ受体细胞中，使外源ＤＮＡ转移到ＴＩ质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该外源基因导入植物体内．如ＰＧＶ３８５０这种质粒载体十分有用，它即能把Ｔ－ＤＮＡ转入植物细胞基因组，又不会使植物产生冠瘿瘤，而且由于在其Ｔ－ＤＮＡ中存在着ＰＢＲ３２２的ＤＮＡ序列,使它成为一种通用受体质粒.二构建ＴＩ质粒载体的策略１．中间载体策略402.双元载体策略在中间载体策略应用以后,发现TI质粒上另一簇基因(VIR基因)起着重要作用.T-DNA向植物基因组插入也不是依靠它的全部结构,只是T-DNA两端25bp的反向重复序列作用的结果2.双元载体策略在中间载体策略应用以后,发现TI质粒上另一簇412.双元载体策略双元TI质粒系统的基本特点:它由两个彼此相容的TI质粒组成,其中之一是含有T-DNA转移所必须的VIR区段的广寄主范围的DNA转移载体质粒,后者含有T-DNA的质粒,由于分子质量小,又能够在大肠杆菌细胞中复制,因而易于进行操作,但不具备诱发肿瘤的功能.2.双元载体策略双元TI质粒系统的基本特点:422.双元载体策略双元载体法是由Hoekema等于1983年首次提出,优点在于它不需要构建质粒共合体.TI质粒的寄住范围主要是双子叶植物,在单子植物基因转化中的应用受到了限制.2.双元载体策略双元载体法是由Hoekema等于1983年首43嵌合基因的构建原核生物的基因在植物中表达必须首先具备能在植物细胞中正确,稳定表达的基因调控序列(5’和3’端的调控序列),然后再将调控序列生物基因的结构基因部分按原来方向插入到调控序列之间.这种调控序列和结构基因来自两种或两种以上的生物的基因称为嵌合基因.有以下几类;nos_DHFR,nos_CAT,CAMV35S启动引子和CaMV35S启动子-GUS等.嵌合基因的构建原核生物的基因在植物中表达必须首先具备能在植物44笫六节发根农杆菌的RI质粒发根农杆菌和根癌农杆菌同属菌科,均为革兰阴性菌.根癌农杆菌感染植物细胞后诱导冠瘿瘤及合成冠瘿碱,故称为瘤诱导TI质粒.发根农杆菌侵染后植物产生许多不定根,这种不定根生长迅速,不断分支成毛状,故称毛状根,也称发状根.RI质粒为根诱导质粒.与TI质粒相比,RI质粒可以不经”解除武装”进行转化,并且转化产生的发根能够再生植株;每条发状根是一个单细胞克隆,可以避免嵌合体;RI质粒可直接作为中间载体;RI质粒和TI质粒可以配合使用建立双元载体系统,拓展了两类质粒在植物基因工程中的应用范围;发根适于进行离休培养,而且很多植物的发根在离体培养条件下都表现出原植物株次生代谢产物的合成能力.可以应用于次生代谢物生产.笫六节发根农杆菌的RI质粒发根农杆菌和根癌农杆菌同属菌科45一发根农杆菌的生物学特性发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌,能够侵染几乎所有的双子叶植物和少数单子叶植物.RI质粒具有多种形式,可以归属两种生物型菌株:生物型1;黄瓜碱型菌株生物型2;农杆碱型和甘露碱型菌株它们像TI质粒一样能够在细菌之间进行质粒转移.一发根农杆菌的生物学特性发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤46二.发根农杆菌的冠瘿碱合成在带有完整T-DNA质粒或RI质粒的转化植物细胞中,都能检测到一类特殊的非蛋白态的氨基酸,这一类氨基酸总称为冠瘿碱.1.RI质粒的基因结构RI质粒与TI质粒一样是属于巨大质粒,RI质粒的大小在200-800kb之间,并且在一种菌体之中可能存在着多种质粒.T区与TI质粒的T-DNA十分相似,有以下几个部分:1.T区的左右边界序列2.TL-DNA区3.TR-DNA区二.发根农杆菌的冠瘿碱合成在带有完整T-DNA质粒或RI质粒47笫七节无选择标记基因植物转化系统两种遗传基因:标记基因选择基因报告基因目的基因笫七节无选择标记基因植物转化系统两种遗传基因:标记基因48一位点特异性重组系统它是利用重组酶催化两个短的,特定DNA序列的重组,来除掉选择标记基因,以获得无标记基因的转基因植物的转化系统.包括酵母FLP\FRTS位点特异性重组系统,Zygosaccharomycesrouxii的R\SR位点特异性重组系统,噬菌体PI的CRE\LOX位点特异性重组系统以及噬菌体MU的GIN重组酶系统.一位点特异性重组系统它是利用重组酶催化两个短的,特定DNA491.酵母FLP\FRTS位点特异性重组系统FLP系统可用于转基因果蝇,喃乳动物细胞,玉米和稻的原生质体.2.R\RS系统它是从环形质粒pSR1中分离而来的.可用于木本或无性繁殖植物,使之产生MFTP,也使对某种植物进行多次转化.3.Cre\lox这个系统是目前植物研究中较先进的方法.可以不需要有性杂交而获得了完全选择标记基因的转基因植物.1.酵母FLP\FRTS位点特异性重组系统50二.通过转座子使转入的基因在基因组内重新定位三.共转化四.选择标记基因的组织特异性表达五.靶基因替换二.通过转座子使转入的基因在基因组内重新定位51植物转化载体的构建植物转化载体的构建52内容一植物基因工程载体的种类和特征二根癌农杆TI质粒三T-DNA的结构特点和功能四T-DNA转移的机制五植物基因转化载体系统六发根家杆菌的RI质粒七无选择标记基因植物转内容一植物基因工程载体的种类和特征53笫一节植物基因工程载体的种类和特征生物载体介导的遗传转化非载体介导的遗传转化种质转化系统直接转化系统生物载体介导的遗传化根据截体的不同可以分为病毒载体和质粒载体介导的遗传转化.笫一节植物基因工程载体的种类和特征生物载体介导的遗传转化54植物转化基因的功能:一它能作为媒介将外源基因导入植物细胞中去,并且整合到宿主细胞的基因组DNA上.二它能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列,即启动子和复制子起始点位点,以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达.植物转化基因的功能:一二55一病毒载体1.单链的RNA植物病毒2.单链的DNA植物病毒3.双链的DNA植物病毒以其优点如下;植物病毒载体能把外源基因直接导入植物细胞,并且系统地分布到整个植株,无需经过从原生质体再生植株的过程,简化了植物基因工程中外源基因的传递过程.一病毒载体1.单链的RNA植物病毒56

病毒具有较高的自我复制能力,在转化植物中可以得到高拷贝的外源基因,有利于外源基因的表达和功能的实现,可以产生大量的外源蛋白质.

植物病毒载体感染植物后,病毒载体的DNA一般不整合到植物细胞核DNA上,不影响植物基因组的其他功能基因的表达.病毒具有较高的自我复制能力,在转化植物中可以得到高拷贝的57植物基因工程病毒载体存在的缺陷:病毒载体不能把携带的外源基因整合到寄主染色体上,不能按孟德尔规律传递给后代;病毒载体仍然存在致病的可能性,可能会诱发植物产生病害;病毒载体本身的不稳定性,病毒载体中的外源基因很容易丢失;病毒基因组发生突变的频率也很高.植物基因工程病毒载体存在的缺陷:病毒载体不能把携带的外源基因58二质粒载体格兰阴性菌土壤杆菌属(特征是能够诱发植物产生肿瘤)根瘤菌属在根瘤土壤杆菌中,决定冠瘿病的质粒TI质粒,在毛根土壤杆菌中,决定毛根症的质粒为RI质粒.它们能引起植物细胞产生病症外,还是理想的基因克隆载体.通过它们可以将外源的DNA转移到植物细胞,并再生出能够表达外源基因的转基因植物.二质粒载体格兰阴性菌59

笫二节根癌农杆菌TI质粒TI质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质,为双股共价闭合的环状DNA分子,约有150200KB.章鱼碱型胭脂碱型农杆碱型农杆菌素碱型(琥珀碱型)笫二节根癌农杆菌TI质粒TI质粒是根癌农杆菌染色60在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中,都含有控制肿瘤诱发的两种基因区段:T区段~在肿癌形成期间,从根瘤土壤杆菌的TI质粒上导入植物细胞的DNQ片段,约为23KB.和毒性区段~在细菌中表达的数个致瘤基因,与T区段从细菌转移到植物细胞的遗传有关.在章鱼碱和胭脂碱型TI质粒DNA分子中,都含有控制肿瘤诱发的61一TI质粒的有关结构T—DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,从TI质粒上导入植物细胞的一段DNA.VIR区:VIR上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞遗传过程有关,能够使农杆菌表现毒性.CON区:冠瘿碱能激活TRA基因,诱导TI质粒转移.ORI区;调控TI质粒的自我复制,故称复制起始区一TI质粒的有关结构T—DNA:是农杆菌侵染植物细胞时,62从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核DNA,叶绿体DNA,线粒体DNA进行分子杂交证实T-DNA仅存在于细胞核中.大小在23KB左右,都含有一段8KB左右的核心区.胭脂碱T-DNA是一条约23KB的连续DNA片段,两端各有一段25BP的重复序列,编码13个基因.章鱼碱T-DNA由两条分离T-DNA片段组成,各自带有相应的左边序列和右边界序列.长约14DB,携带8个基因,包括章鱼碱合成酶基因和致瘤基因.从植物冠瘿瘤细胞中分别分离核DNA,叶绿体DNA,线粒体DN63T-DNA两个重要特性保留T-DNA两端的末端序列,然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去,从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力.毒性区对T-DNA的作用既可以以顺式作用进行,又可以以反式进行,T-DNA两个重要特性保留T-DNA两端的末端序列,然后用一64VIR区VIR区段总长度大约35KB,由7个互补群组成,分别为VIRA,VIRB,VIRC,VIRD,VIRE,VIRG,VIRH.毒性区有两种情况:一种是组成性表达,即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平.一种是植物诱导性表达,即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时,植物细胞分泌的信号分子作用下才能启动表达.VIR区VIR区段总长度大约35KB,由7个互补群组成,65下面对各VIR基因的性质,功能及作用机制进行阐述VIRA:由单一基因所组成,大小为2.8KB,编码1条92KDA的多肽.VIR基因所编码的蛋白质与一些细菌中起转录调节作用的基因产物有很高的同源性.功能:是帮助植物细胞接受植物信号分子,然后启动毒性区表达.VIRG:小于VIRA,只有1.2KB,为单拷贝基因,只能编码一条多肽,即DNA结合化蛋白,下面对各VIR基因的性质,功能及作用机制进行阐述VIRA:66VIRG的调节方式有两种形式:它的全诱导表达需要正常功能的完整VIRA和VIRG基因存在.依赖于自身编码的VIRG蛋白.在乙酰丁香酮存在时,野生型菌株的VIRG可以由低PH和磷酸饥饿诱导而低水平表达.VIRG的转录方向是从左到右的,最初的翻译起始位点只能是48-50位的VIRG.VIRG作为一种DNA结合蛋白,可以结合到VIRB,C,D,E,G和H操纵的5’端非转录区.VIRG的调节方式有两种形式:它的全诱导表达需要正常功能的完67VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为16.2,47.4,21.3,和75.8KDA的四种不同的蛋白分子.VIRD1编码一个DNA松弛酶,这种酶与DNA拓扑异构酶I作用类似,它先在DNA链上切割一个缺刻,使DNA解旋后再封闭,降低了DNA超螺旋数目.VIRB:有两种信号肽序列:一种与细菌输出信号肽序列相似.另一种信号序列属于脂蛋白信号序列.VIRC:是毒性区各位点惟一以反针方向转录的位点,含有两个开放阅读框架VIRC1和VIRC2,分别编码1个约25KDA的蛋白质和个约22KDA的蛋白质.VIRH:对植物产生的某些杀菌或者抑菌化合物起解毒作用.VIRD:包括4个开放阅读框架,分别编码分子质量约为16.268TI质粒的生物学功能控制冠瘿碱的新陈代谢以TI质粒为媒介进行接合转移TI质粒的生物学功能控制冠瘿碱的新陈代谢69笫三节T–DNA的结构特点和功能一T-DNA的结构特点二T-DNA的编码基因及功能笫三节T–DNA的结构特点和功能一T-DNA的结构特70T-DNA的结构特点TI-质粒的T-DNA分子J单拷贝或者是多拷贝的形式随机地整合在植物核基因组DNA的位子.整合的胭脂碱T-DNA分子结构简单.单一片段形式存在.整合的章鱼碱T-DNA分子人结构比较复杂.有两片段形式.左侧区段具有控制冠瘿瘤形成的基因,右侧区段参与冠瘿瘤碱生物合成的蛋白酶的编码的基因.章鱼碱和胭脂碱TI质粒之间,边缘区序列相当保守.T-DNA的结构特点TI-质粒的T-DNA分子J单拷贝或者是71T-DNA的结构特点植物冠瘿瘤的诱发并非是由整个TI质粒的侵染所致.它的形成是由T-DNA的3个基因:IAAM,IAAH,IPT.在T-DNA的5’端和3’都有真核表达信号,如TATA-BOX,AATAA-BOX等.分为左边界(BL和TL),右边界(BR和TR)T-DNA的结构特点植物冠瘿瘤的诱发并非是由整个TI质粒的侵72T-DNA上的编码基因及功能科学发现T-DNA的编码基因很有可能是进化中补TI质粒铺获的真核基因．为此，ＯＣＳ和ＮＯＳ基因的启动因子，在各种不同的植物中都有功能活性．在Ｔ－ＤＮＡ区中引入转座子，使特定的基因发生突变，突变后的肿瘤细胞中Ｔ－ＤＮＡ的１个或多个转录产物随之消失．基因突变后不能转录出它所编码的ＭＲＮＡ，这时可观察到带有突变基因的Ｔ－ＤＮＡ的植物细胞的表型，从而确定基因转录产物的功能．用编码冠瘿碱合成酶及分解借调基因和诱发肿瘤的基因证明了编码两类转录产物的基因序列．T-DNA上的编码基因及功能科学发现T-DNA的编码基因很有73Ｔ－ＮＡ上的编码基因及功能１．ＡＵＸ基因突变将阻断肿瘤形成，细胞生长素的大量合成，使细胞分裂素与生长素的比值升高．２ＴＭＳ和ＡＵＸ基因的表达，使转化植物细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主性性，引起癌变．Ｔ－ＮＡ上的编码基因及功能１．ＡＵＸ基因突变将阻断肿瘤形成，74笫四节Ｔ－ＤＮＡ转移的机制T-DNA在植物染色体中的插入是随机的,插入位点常有以下特点:1.T-DNA优先整全到转录活跃的植物基因位点;2.T-DNA与植物DNA连接处富含A,T碱基对;3.植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程序的同源性.笫四节Ｔ－ＤＮＡ转移的机制T-DNA在植物染色体中的插入是75T-DNA转移的模型和过程DSBR模型基本过程:首先是植物靶DNA产生双链断裂,解旋的靶DNA与双链T-DNA退火;单链部分被3’-5’外切酶或修复系统中单链特异的核酸内切酶去除;然后进行修复连接,并由此导致了DNA的整合和缺失,靶DNA和T-DNA缺失程度由靶DNA与T-DNA互补顺序位置所决定.SSGR模型:1.在靶DNA上形成一个缺刻,然后由于部分解旋或5’-3’外切酶消化形成缺口.2.单链T-DNA靠近缺口,由于两链存在短的DNA互补顺序,于是退火形成异质双链.3.T链未配对的5’-3’单链断部分被除去,T-DNA末端与靶DNA连接.4.在靶DNA链的互补链产生缺刻,以游离的T-DNA末端为引物修复合成笫二条T-DNA.T-DNA转移的模型和过程DSBR模型基本过程:SSGR模型76T-DNA整合的机制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和VIRE基因在转录水平上的表达受植物信号分子.VIRA和VIRG是属于组成型表达的基因.目前普遍认为T-DNA是以T链形式向植物细胞转移的,而不是T-DNA分子.它们的形成取决于VIRD1入VIRD2两种蛋白.T-DNA整合的机制研究表明:VIRB,VIRC,VIRD和77DNA非正常重组1.两个基本步骤:DNA末端的生成.DNA末端再连接.2.特点:T-DNA瞄准整合的位点没有序列特异性.整合部位的植物DNA有小段与T-DNA端点附近域同源的序列.在重组后的结合可能找到一些额外的核苷酸序列;称为填充DNA.重组结合部的靶有少量缺失或存在更大部位的重组.DNA非正常重组1.两个基本步骤:DNA末端的生成.DNA末78DNA非正常重组3.基本过程;在植物靶DNA上出现一个缺刻,随着解链宿主细胞的5’-3’外切酶活性使缺刻扩大成裂口.T-DAN侵入裂口,末端与靶DNA单链上的少数核苷酸配对形成异源二倍体.T-DNA悬挂在外侧的末端被切割除去,T-DAN与靶末端相连.靶DNA上链出现缺口,然后以整合后的T-DNA链为模板合成T-DNA的笫二条链,从而完成整个整合过程.DNA非正常重组3.基本过程;79植物转化载体的构建课件80整合时靶DNA所处的环境不同可能使T-DNA的整合过程不同;1.当T-DNA内部与靶DNA同源时,截短的T-DNA的可能远离T-DNA末端.2.填充DNA的产生可能有四种情况:来自植物染色体组的另一段DNA序列直接与断头相连,片段大小可以从一段很小的寡核苷酸到约300BP长的冈崎片段.滑动错位修复过程.复杂填充DNA生成.填充DAN是TI质粒左端序列的一段序列.整合时靶DNA所处的环境不同可能使T-DNA的整合过程不同;81笫五节植物基因转化载体统一以Ti质粒为基础的遗传转化系统二构建Ti质粒载体的策略

笫五节植物基因转化载体统一以Ti质粒为基础的遗传转化系82１.野生型的Ti质粒

它是植物病原细菌（根癌土壤杆菌）所携带的长度为１８０～２００kb的大质粒．Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体．但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子质量过大，一般为１６０～２４０kb，在基因工程中难以操作．②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点．③T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡．④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制．⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的冗余基因．１.野生型的Ti质粒它是植物病原细菌（根癌土壤杆菌）所83２.Onc卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的Ti质粒载体．在这种Onc载体中，已经缺失的T-DNA部位被大肠杆菌的一种常用的质粒pBR322区段所取代。这样任何适合于克隆在pBR322质粒中的外源DNA片段，都可以通过与pBR322质粒DNA的同源重组，而被共整合到Onc-Ti质粒载体上。２.Onc卸甲载体所谓卸甲载体就是无毒的Ti质粒载体84ONC卸甲载体常用的受体Ti卸甲载体有三种：⑴pGV3850载体：是一个由胭脂碱型Ti质粒pTiC58衍生出来的Onc卸甲载体。⑵pG2250载体:也是属于含pBR交换序列的卸甲载体，但它使pBR322DNA成为一种多用途受体质粒．pG2250载体是章鱼碱型Ti质粒pTiB6S3的衍生质粒．它也是被切除了Onc基因的载体．⑶pTiB6S3－SE载体：是由章鱼碱型Ti质粒衍生的卸甲载体．TR-DNA完全缺失，TL-DNA仅剩BamHI-8的部分片段．其中含有“左侧内部同源区”．ONC卸甲载体常用的受体Ti卸甲载体有三种：853共整合载体系统共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成区经过突变后的TI质粒和中间载体的两部分.共整合系统的特点是具有两个独立的质粒:农杆菌TI质粒和大肠杆菌中间载体.这两个质粒具有一同源区,在农杆菌和大肠杆菌接合后经过同源重组形成一个大的共整合质粒.隔端载体系统是一种较有效的共整合载体系统,它的左右边界分别位于两个独立的质粒上.3共整合载体系统共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成863共整合载体系统常见的共整合载体质粒有以下几种:PGV3850系统PGV2260系统PMON200系统3共整合载体系统常见的共整合载体质粒有以下几种:874双元载体系统双元系统的特点:两个质粒即穿梭质粒和TI质粒,在接合后可以自主性共存于同一农杆菌细胞中.双元系统中的农杆菌质料是一个经过改造的TI质粒,具有VIR基因和农杆菌复制起始子,但没有T-DNA边界序列.接合合,两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中.当农杆菌感染受伤的植物时,TI质粒上的VIR基因与穿梭质粒上的右边界序列发生反式相互作用,从而将T-DNA转移进入植物基因组,这就是双元载体系统的特点.4双元载体系统双元系统的特点:884双元载体系统双元载体系统避免了共整合步骤.这种系统需要两个基本点彼此分离的质粒，一个多功能克隆载体质粒，在大肠杆菌和土壤农杆菌中都能够复制．它该具备以下三个特点；在它Ｔ－ＤＮＡ末端序列内含有单一克隆位点和植物选择标记基因．Ｔ－ＤＮＡ区以外含有细菌选择标记基因，以便选择转化菌株．可以由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中．4双元载体系统双元载体系统避免了共整合步骤.这种系统需要两894双元载体系统无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间载体质粒由大肠杆菌转移到土壤农杆菌中都需要三种细菌参与，称三亲交配法．4双元载体系统无论是共整合载体系统还是双元载体系统，把中间90二构建ＴＩ质粒载体的策略１．中间载体策略基本原理是把Ｔ区片段克隆到普通载体ＰＢＲ３２２上，把外源基因插入到该Ｔ区后再导回Ａ，ＴＵＭＥＦＡＣＩＥＮＳ受体细胞中，使外源ＤＮＡ转移到ＴＩ质粒上，再经根癌土壤杆菌转化植物把该外源基因导入植物体内．如ＰＧＶ３８５０这种质粒载体十分有用，它即能把Ｔ－ＤＮＡ转入植物细胞基因组，又不会使植物产生冠瘿瘤，而且由于在其Ｔ－ＤＮＡ中存在着ＰＢＲ３２２的ＤＮＡ序列,使它成为一种通用受体质粒.二构建ＴＩ质粒载体的策略１．中间载体策略912.双元载体策略在中间载体策略应用以后,发现TI质粒上另一簇基因(VIR基因)起着重要作用.T-DNA向植物基因组插入也不是依靠它的全部结构,只是T-DNA两端25bp的反向重复序列作用的结果2.双元载体策略在中间载体策略应用以后,发现TI质粒上另一簇922.双元载体策略双元TI质粒系统的基本特点:它由两个彼此相容的TI质粒组成,其中之一是含有T-DNA转移所必须的VIR区段的广