疟疾镜检-课件

疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术1一、显微镜镜检用于疟疾诊断

显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断技术(金标准）主要优点-特异高-能区分虫种-能分期-能计数-1小时内能完成诊断程序一、显微镜镜检用于疟疾诊断

显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾21.所需设备（1）载玻片（2）采血针

（3）玻片盒

（4）75％乙醇棉球（5）铅笔（6）登记表二、血片制作及染色1.所需设备二、血片制作及染色3

2．血片制作（1）取血部位采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血（2）涂制血膜厚血膜的涂制：

用推片的左下角刮取血液4-5μl（约火柴头大小），将血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8-1厘米的厚薄均匀的圆形厚血膜。2．血片制作用推片的左下角刮取血液4-5μl（约火柴头4用棉球抹净角上的血渍，再刮取血液1.5μl{约1/4火柴头大小)，将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25-35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，长约2.5CM。（一）薄血膜的涂制：（一）薄血膜的涂制：5（3）厚薄血膜的位置：每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。标准血膜的位置如下图所示。（4）血膜的编号制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个人编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果报告单上的编号相一致，以防差错。（3）厚薄血膜的位置：6

标准血膜示意图

标准血膜示意图7（二）血片的染色1．薄血膜的固定血片完全干燥后才可染色固定的方法：将涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以固定薄血膜。（注意：厚血膜不能固定）（二）血片的染色82．染色用水和冲洗用水配制常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。用pH7.0～pH7.2的缓冲液效果最佳。在没有蒸馏水的情况下，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好。（1）两种贮备液的配制：贮备液I1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液Na2HPO49.5g蒸馏水1000ml贮备液Ⅱ1/15M磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液KH2PO49.07g蒸馏水1000ml2．染色用水和冲洗用水配制9（2）缓冲液的配制PHM/15Na2HPO4M/15KH2PO4DW(ml)(ml)(ml)6.849519007.063379007.168329007.273279007.48119900加缓冲液的PH可用试纸或0.02%酚红液测定。亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂（2）缓冲液的配制10（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：吉姆萨粉10g

甲醇500ml

甘油500ml

将吉姆萨粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇洗涤掉剩余部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒入瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，在室温下放置3-5天，每天摇动，即可使用。放置时间越长染色效果愈佳。（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：11（2）

染色方法：

A.常规染色用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与缓冲液1：20稀释。分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上的染液冲去，（冲洗时勿用水直接对准厚血膜，以免血膜脱落）凉干后镜检。（2）

染色方法：12

B.

快速吉氏染色

在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上，染色5分钟，用流水轻轻冲洗干净，凉干后镜检。

13瑞氏（Wright）染液:（1）染液配制：

瑞氏染剂粉0.1—0.5g甘油3ml纯甲醇97ml将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分摇匀，一般放置一二星期后，再过滤应用（保存时间愈久，染色力愈佳）。急用时，放置24小时后过滤也可使用。

瑞氏（Wright）染液:14（2）染色方法：

先用腊笔在厚薄血膜间画一界线，滴2-3滴蒸馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（小心勿使蒸馏水超出腊笔线而触及薄血膜）。在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等量的蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。

（2）染色方法：153.染色质量染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出现蓝—绿色或红色）；镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫的胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色；疟原虫的核呈红色，疟色素清晰可见，在显微镜下仅有小量染液沉淀。3.染色质量染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出164.影响血膜染色的因素血膜染色好坏，除与玻片的清洁、血膜制作技术等有关外，尚与下列因素有关：(1)试剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使所配的染液偏酸或偏碱，从而影响血膜的染色。

(2)染液的新旧：新配制的染液，因色素尚未充分溶解，一般染色力弱，且常带碱性。染液放置较久，染色力逐渐增加，尤以吉氏染液为甚。通常在染液配制1-2周后才使用。

4.影响血膜染色的因素17(3)染液的稀释浓度：染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使用染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。

(4)染色时间与温度：染色时间长，化学反应充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。疟疾镜检-课件18用水过酸可致受染RBC上的点彩染不出来，用水过碱，则使薄血膜上的RBC染成灰蓝色，致使R的胞浆难以辨论。因此，当染色结果发生偏蓝（碱）或偏红（酸）时，可用酸碱度与之相反的缓冲液冲洗血膜，予以调整。(5)稀释和冲洗用水：用水过酸可致受染RBC上的点彩染不出来，(5)稀释和冲洗用水19疟疾镜检-课件20

血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏21（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。（3）染液稀释后使用时间染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色22

（

4）染液的稀释浓度与染色时间染液的浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。（5）稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色较好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0~pH7.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。疟疾镜检-课件23薄血膜中常见的血液成分中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红血球薄血膜中常见的血液成分中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红24（三）厚薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为2μl，涂制成2cm宽×4cm长面积的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，便于疟原虫虫种的鉴定。惟由于用血量少，为保证检测的敏感性，常耗时较多，似不适用于大规模调查。即使在医院的化验室，由于要求在短时间内作出诊断，因而极有可能出现漏诊。（三）厚薄血膜的优缺点及其适用范围25

厚血膜用血量约为10μl～20μl。涂制成直径1cm的厚血膜由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。受影响较大的有大滋养体、裂殖体的形态。在镜检厚血膜时，一般门诊须检查200~1000个油镜视野（相当于0.5~2.5μl血量），才能确保镜检的敏感性和可重复性。通常的敏感性可达约10~20个原虫/μl血。由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节省时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄血膜的15～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断应以检查厚血膜为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原虫则判为阴性。厚血膜26混合感染的鉴别1、容易鉴别的混合感染1）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。2）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体，并混有少量间日疟原虫。2、不易鉴别的混合感染1）间日疟各期原虫和粗环的恶性疟环状体。2）仅有间日疟和恶性疟的环状体。

3分子生物学方法应用于疟原虫分型1）提高检出：对镜检漏诊病人敏感性达5个原虫/100uL血2）确定四种疟原虫，做复核鉴定混合感染的鉴别1、容易鉴别的混合感染27三、厚血膜的疟原虫计数

根据预先测定的白细胞数目计算出每微升血液中疟原虫的数目。在制作厚血膜的同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血液中的白细胞数。然后镜检厚血膜，计数同一视野中的疟原虫数和白细胞数，直到所计数的白细胞数达到确定的数值为止(如果疟原虫密度较高，计数100～200个白细胞即可，但在疟原虫密度很低时，计数白细胞数需达1000个)。用下式算出疟原虫密度：疟原虫数/白细胞数×白细胞数/μl血=疟原虫数/μl血。

如果无法进行白细胞计数，则可按常规估计白细胞数。国外最常采用的数值是8000白细胞/μl血,国内常用6000白细胞/μl血。三、厚血膜的疟原虫计数28谢谢大家谢谢大家29疟原虫镜检技术疟原虫镜检技术30一、显微镜镜检用于疟疾诊断

显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断技术(金标准）主要优点-特异高-能区分虫种-能分期-能计数-1小时内能完成诊断程序一、显微镜镜检用于疟疾诊断

显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾311.所需设备（1）载玻片（2）采血针

（3）玻片盒

（4）75％乙醇棉球（5）铅笔（6）登记表二、血片制作及染色1.所需设备二、血片制作及染色32

2．血片制作（1）取血部位采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血（2）涂制血膜厚血膜的涂制：

用推片的左下角刮取血液4-5μl（约火柴头大小），将血滴涂于载片的中央偏右，由里向外划圈涂成直径为0.8-1厘米的厚薄均匀的圆形厚血膜。2．血片制作用推片的左下角刮取血液4-5μl（约火柴头33用棉球抹净角上的血渍，再刮取血液1.5μl{约1/4火柴头大小)，将推片的一端置于血滴之前，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25-35°角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜，长约2.5CM。（一）薄血膜的涂制：（一）薄血膜的涂制：34（3）厚薄血膜的位置：每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。标准血膜的位置如下图所示。（4）血膜的编号制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个人编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果报告单上的编号相一致，以防差错。（3）厚薄血膜的位置：35

标准血膜示意图

标准血膜示意图36（二）血片的染色1．薄血膜的固定血片完全干燥后才可染色固定的方法：将涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放置，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以固定薄血膜。（注意：厚血膜不能固定）（二）血片的染色372．染色用水和冲洗用水配制常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。用pH7.0～pH7.2的缓冲液效果最佳。在没有蒸馏水的情况下，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好。（1）两种贮备液的配制：贮备液I1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液Na2HPO49.5g蒸馏水1000ml贮备液Ⅱ1/15M磷酸二氢钾（KH2PO4）溶液KH2PO49.07g蒸馏水1000ml2．染色用水和冲洗用水配制38（2）缓冲液的配制PHM/15Na2HPO4M/15KH2PO4DW(ml)(ml)(ml)6.849519007.063379007.168329007.273279007.48119900加缓冲液的PH可用试纸或0.02%酚红液测定。亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂（2）缓冲液的配制39（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：吉姆萨粉10g

甲醇500ml

甘油500ml

将吉姆萨粉置于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇洗涤掉剩余部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒入瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充分摇匀，在室温下放置3-5天，每天摇动，即可使用。放置时间越长染色效果愈佳。（1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：40（2）

染色方法：

A.常规染色用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与缓冲液1：20稀释。分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜，染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上的染液冲去，（冲洗时勿用水直接对准厚血膜，以免血膜脱落）凉干后镜检。（2）

染色方法：41

B.

快速吉氏染色

在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（10-15%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上，染色5分钟，用流水轻轻冲洗干净，凉干后镜检。

42瑞氏（Wright）染液:（1）染液配制：

瑞氏染剂粉0.1—0.5g甘油3ml纯甲醇97ml将瑞氏染剂粉置于研钵内，加入甘油充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。充分摇匀，一般放置一二星期后，再过滤应用（保存时间愈久，染色力愈佳）。急用时，放置24小时后过滤也可使用。

瑞氏（Wright）染液:43（2）染色方法：

先用腊笔在厚薄血膜间画一界线，滴2-3滴蒸馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（小心勿使蒸馏水超出腊笔线而触及薄血膜）。在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等量的蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。

（2）染色方法：443.染色质量染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出现蓝—绿色或红色）；镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色，淋巴细胞及疟原虫的胞浆呈蓝色或淡蓝色，白细胞的核呈紫蓝色；疟原虫的核呈红色，疟色素清晰可见，在显微镜下仅有小量染液沉淀。3.染色质量染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不应该出454.影响血膜染色的因素血膜染色好坏，除与玻片的清洁、血膜制作技术等有关外，尚与下列因素有关：(1)试剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使所配的染液偏酸或偏碱，从而影响血膜的染色。

(2)染液的新旧：新配制的染液，因色素尚未充分溶解，一般染色力弱，且常带碱性。染液放置较久，染色力逐渐增加，尤以吉氏染液为甚。通常在染液配制1-2周后才使用。

4.影响血膜染色的因素46(3)染液的稀释浓度：染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使用染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。

(4)染色时间与温度：染色时间长，化学反应充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。疟疾镜检-课件47用水过酸可致受染RBC上的点彩染不出来，用水过碱，则使薄血膜上的RBC染成灰蓝色，致使R的胞浆难以辨论。因此，当染色结果发生偏蓝（碱）或偏红（酸）时，可用酸碱度与之相反的缓冲液冲洗血膜，予以调整。(5)稀释和冲洗用水：用水过酸可致受染RBC上的点彩染不出来，(5)稀释和冲洗用水48疟疾镜检-课件49

血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏等有关外，还受到以下几个因素的影响：（1）染料溶剂的质量染料、甲醇和甘油如果不纯，常使配制的染液偏酸或偏碱而影响染色效果。因此必须用分析纯的甲醇和中性甘油，而且在配制时所用的器具必须干净而无水份。血片染色好坏除了与玻片是否清洁，血片制作质量好坏50（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影响染液质量。（3）染液稀释后使用时间染液的主要成份是美蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用，一般在半小时内染色力最强。（2）染液的新旧新配制的染液因色素尚未充分溶解，染色51

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4）染液的稀释浓度与染色时间染液的浓度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些，颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。（5）稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色较好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故应用pH7.0~pH7.2的水稀释。当染色太蓝，可用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以校正。疟疾镜检-课件52薄血膜中常见的血液成分中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红血球薄血膜中常见的血液成分中性白细胞酸性球血小板大单核球淋巴球红53（三）厚薄血膜的优缺点及其适用范围薄血膜用血量约为2μl，涂制成2cm宽×4cm长面