基因重组及遗传

第五章细菌基因重组及遗传分析基因重组（generecombination）是指不同来源的遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多产生有性孢子的真核微生物的基因重组都是通过有性世代来完成。在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体（donor），而获得基因的另一方称为受体（recipient）。第一节转化（Transformation）转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。

在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培养、PEG介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过程大体可分为三个阶段：感受态的出现DNA的吸附和进入DNA的整合感受态的出现

感受态（competence）：是指受体菌细胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理状态。一、转化过程和机制

细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（5-10kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。

4.进入细胞的单链与寄主DNA同源区重组并整合到染色体上革兰氏阳性菌1.双链DNA片段在DNA结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由核酸酶（紫色椭圆）切成缺口2.由核酸酶降解其中一条单链3.未被降解的单链与感受态特异蛋白相互作用并进入细胞DNA的吸附和进入

在流感嗜血菌中，其感受态细胞形成一种结合双链DNA的膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体吸附DNA后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞内侧，再将双链变成单链DNA。

转化小体双链DNA被转化小体摄取转化的双链DNA（30-50kb）结合到膜受体上很快进行同源重组使外源DNA整合到染色体上革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA实验证明：肺炎链球菌的转化因子在100℃下逐渐失去转化活性(DNA发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链DNA复性成双链)。说明完整的DNA双链结构对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需要双链DNA才能结合到细胞表面的结合位点上。当DNA吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链DNA才能进入细胞内并与受体染色体DNA进行整合。

流感嗜血菌特异性摄取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？近年来的研究表明，G-菌和G＋菌对单链DNA也能进行有效转化，但一般是在较低的pH值下进行的。外源DNA片段在受体细胞中的命运：外源DNA（红色）转化到受体细胞后，通过同源重组整合到染色体上，否则被降解成核苷酸。

DNA的整合

转化为相相同或相相近物种种之间的的同源重重组提供供了可能能性，是是自然界界中基因因交换的的一条重重要途径径，在生生物变异异和进化化中起着着重要作作用。转化的效效率决定定于下列列三个内内在因素素：受体细胞胞的感受受态，决决定转化化DNA能否进入入细胞受体细胞胞的限制制系统，，决定转转化DNA在整合前前是否被被分解供体和受受体DNA的同源性性，决定定转化DNA的整合。。由于转转化DNA总是与顺顺序相同同或相似似的受体体DNA配合，所所以亲缘缘关系越越近的其其同源性性也越强强，转化化效率也也越高。。二、人工工转化通过二价价阳离子子处理，，大肠杆杆菌等部部分G-细菌能产产生感受受态通过制备备原生质质，大多多数细菌菌特别是是某些G+细菌已知许多多细菌包包括大肠肠杆菌均均无自然然转化的的能力，，但经人人工诱导导可使它它们形成成感受态态。如：：1970年Mandel和Higa首先发现现DNA在含有高高浓度Ca2+的条件下下能够被被受体细细胞摄入入和转化化，随后后的实验验证明由由Ca2+诱导的人人工转化化的大肠肠杆菌中中，其转转化DNA必须是一一种独立立DNA复制子。。大肠杆菌菌的转化化随着研究究技术的的改进和和经验的的积累，，人们已已经建立立了用Ca2+、Mg2+等诱导转转化的标标准程序序，能对对大肠杆杆菌菌株株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有有效的转转化。先将大肠肠杆菌培培养至OD600=0.5～1接着用50-100mmol／LCaCl2处理制备备成感受受态细胞胞然后将DNA与感受态态细胞混混合在冰浴中中反应20-40min进行42℃热击可增增加DNA的吸收（（107个转化子/ug质粒DNA）最经典的转化化方法是：由于异源的质质粒DNA分子能够进入入大肠杆菌细细胞，所以大大肠杆菌摄取取DNA是非选择性的的。PEG介导的转化不能自然形成成感受态的G+细菌如枯草芽芽孢杆菌和放放线菌，可通通过聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用实现转转化。这类细菌必须须首先用细胞胞壁降解酶完完全除去它们们的肽聚糖层层，然后使其其维持在等渗渗的培养基中中，在PEG存在下，质粒粒或噬菌体DNA可被高效地导导入原生质体体。电脉冲法（电穿孔法）在许多细菌和和真核系统中中，它们既无无自然的感受受态呈现也不不能用上述的的方法建立感感受态。因此此人们发展了了一种新的将将核酸分子导导入细胞的方方法，最突出出的是电穿孔(electroporation)法和基因枪(biolistic)转化法。电穿孔法：是用高压脉冲冲电流击破细细胞膜或将细细胞膜击成小小孔，使各种种大分子(包括DNA)能通过这些小小孔进入细胞胞，所以又称称电转化。电场强度、电电脉冲的长度度和DNA浓度基因枪(biolistic)转化基因枪转化法法首先由Sanford报道，该方法法是将包裹有有DNA的钨颗粒像子子弹一样用高高压射进细胞胞并使DNA留在细胞内，，特别是留在在细胞器中。。用这种方法首首次成功地将将DNA导入酵母线粒粒体并引起线线粒体遗传变变化。基因枪枪转化现在被被广泛地应用用于植物的转转化中三、建立转化化方法的策略略被转化对象（（转化受体））转化DNA的构建（目的的）转化方法选择择四、转化应用用在转化中，如如果转化因子子的两个基因因是连锁的，，那么它们可可以同时被转转化，也称为为共转化，连连锁的两个基基因距离越近近，其共转化化频率越高，，反之则低。。利用共转化化率和连锁的的二基因间的的距离的反比比关系可进行行基因定位的的工作。1.连锁检测2.遗传图谱的绘绘制trp2+his2+tyr1+（供体）×trp2-his2-tyr1-（受体）的转转化类型trp2-his2重组率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418trp2-tyr1重组率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重组率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr1

3413403.基因中断4.插入基因第二节接合合作用（conjugation）接合作用：是指在供体细细胞和受体细细胞直接接触触后，质粒从从供体细胞向向受体细胞转转移的过程，，也称细菌杂杂交。一、接合现象象的发现与证证实Lederberg和Tatum（1946年）建立了用用大肠杆菌K12的两个营养缺缺陷型菌株在在基本培养基基上是否生长长，来检验细细菌杂交或重重组存在的方方法。在此以以前，没有人人证实细菌杂杂交现象。细细菌杂交有别别于典型的有有性杂交，故故称为细菌接接合作用。A菌株B菌株混合培培养后后在基基本培培养基基中出出现的的原养养型菌菌落是是否是是杂交交的结结果？？必须要排除下下列几种解释释：一是细菌细胞胞并没有接合合，而是交换换了DNA(转化作用)二是细胞并未未接合，而是是通过培养基基交换了养料料(互养)三是细菌细胞胞并未接合而而是亲本发生生了回复突变当时Lederberg和Tatum已经证明，当当把A菌株的培养液液经过灭菌，，再加入到B菌株的培养液液中，没有原原养型菌落，，这说明上述述实验并非转转化的结果。。1950年，Davis通过他的U形管试验进一一步支持了Lederberg和Tatum的结论论。1.转化作作用的的排除除营养缺缺陷型型细胞胞通过过培养养基交交换养养料而而生长长的现现象亦亦称为为互养。2.互养的的排除除在A-B+T1s和A+B-T1r的杂杂交交中中，，将将基基因因型型A-B+T1s和A+B-T1r两种种细细菌菌在在基基本本培培养养基基上上混混合合培培养养，，接接触触较较短短的的一一段段时时间间以以后后，，喷喷上上噬噬菌菌体体T1，把把A-B+T1s细菌菌杀杀死死。。经培培养养以以后后仍仍有有原原养养型型菌菌落落出出现现，，这这说说明明原原养养型型菌菌落落的的出出现现并并非非由由于于互互养养。。因为为大大肠肠杆杆菌菌的的突突变变率率一一般般都都<10-8，若若两两个个基基因因同同时时回回复复突突变变，，则则其其可可能能性性只只有有<10-16（10-8×10-8），，这这种种几几率率在在平平板板上上是是很很难难检检测测到到的的，，所所以以混混合合培培养养能能出出现现10-5~10-6频率的的菌落落一定定是重重组的的结果果。3.回复突突变的的排除除4.遗传物物质的的单向向转移移正交实实验（A）Strs×（B）Strr用链霉霉素将将A菌株杀杀死重组体体的数数目变变化不不大(A)Strr×(B)Strs将B菌株杀杀死一个重重组体体也没没有出出现反交实实验（A）met-bio-（Strr或Strs）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反杂杂交实验证证明，细菌菌重组的发发生只是染染色体单方方向的转移移，而且染染色体的转转移往往不不完全。把A菌株认为是是供体，而B菌株是受体A菌株作为遗遗传物质的的供体，当当链霉素对对它进行灭灭活以后，，并未影响响它传递遗遗传物质的的能力。B菌株作为遗遗传物质的的受体，一一旦被链霉霉素杀死以以后，必然然不能出现现重组体。。供体菌株又又称为雄性细胞，受体菌株株又称为雌性细胞StrrA突变型（不不育变种））⊙置冰箱1年后供体的的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培养，一一起繁殖不能得到杂杂交子StrrA菌株×B菌株Strs恢复了StrrA突变型的可可育性F质粒的发现现(Hayes)①大肠杆菌的的供体或雄雄性细胞(如A菌株)记为F+，带有一个个性因子或或致育因子F(fertilityfactor)，而另一个个不带性因因子F的受体或雌雌性细胞(如B菌株)叫做F-；②杂交F+×F-是可育的，，杂交F-×F-是不育的；；③F因子可以传传递，从F+到F-细菌，但必必须通过细细胞接触④F因子能够自自发丧失，，一旦丧失失就不能再再恢复，除除非从另一一个F+细胞再把它它传递过来来。分析结果：：F因子是染色色体外的一一种遗传结结构，也就就是质粒(plasmid)。F+是一种遗传传性状F因子的存在在使细菌成成为F+F因子的丧失失使细菌成成为F-F+细菌分裂仍仍得到F+细胞二、F质粒的结构构及其在细细胞中的存存在状态F质粒的遗传传结构F质粒的基因因组由三个个主要区段段组成：转转移区、复复制区、插插入区。长度为33kb，由23个基因组成成，构成一一个tra操纵子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW与性菌毛的的形成有关关traYZMIGD等与F因子的转移移有关traG、traN影响杂交对对的配对形形成与否traI、traM决定DNA转移起始traI编码解旋酶酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA转移；traY、traZ编码的核酸酸内切酶能能在转移起起始区oriT上切开一个个缺口。（1）转移区(transferregion)复制区负责责F质粒的自我我复制F质粒自主复复制区为oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含含有复复制起起点。。F质粒的的复制制是按按θ型方式式进行行复制制，它它是一一种严严紧型型质粒粒。F质粒的的拷贝贝数能能被精精确地地控制制，一一个寄寄主细细胞约约有1~2个F质粒。。rep（Freplicativeprotein）编码一一组与与F质粒复复制相相关的的蛋白白质。。inc（incompatibility）基因产产物使使细胞胞具有有不相相容性性。（2）复制制区（（replicationregion）F质粒插插入区区包含含4个插入入顺序序：2个IS31个IS21个Tn1000（γδ）它们与与F质粒的的整合合、切切除、、易位位有关关（3）插入入区（（insertionregion）2.F质粒在在细胞胞内的的存在在形式式根据大大肠杆杆菌细细胞内内有无无F质粒及及F质粒在在细胞胞内的的存在在状态态可将将细胞胞分为为4种类型型：F-、F+、Hfr、F’。F-：是细胞胞内不不含F质粒；；F+：是细胞胞内含含有F质粒且且独立立染色色体外外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高频重重组菌菌株：：是F质粒整整合到到宿主主的染染色体体上，，随着着宿主主染色色体的的复制制而复复制；；F’是指携携带了了宿主主的一一部分分染色色体的的F质粒。三、F质粒与接合作作用1.F+×F-杂交有F质粒的细胞在在形态学上可可以与F-明显区别。除除了共有的大大量表面菌毛毛以外，F+还有少量（通通常在细胞对对数生长期中中只有1~3根）性菌毛。。纤细的蛋白白质性菌毛有有的长数毫米米，直径约为为8nm。性菌毛在细细菌的接合过过程中起着十十分重要的作作用。2.Hfr×F-杂交Hfr菌株是怎样形形成的呢?F质粒有两种方方式整合到染染色体上：同同源重组、质质粒和染色体体共有插入序序列和转座子子。大肠杆菌菌染色体基因因组有7个IS1、13个IS2及6个IS3；F质粒有1个IS2和2个IS3。3.F’’×F-杂交F质粒在脱离Hfr细胞的染色体体时也会发生生差错，从而而形成带有细细菌染色体基基因的F′质粒。而F′因子又可通过过交换融合到到细菌染色体体的原来位置置上，回复到到原来的Hfr状态。由于在F’×F-接合使用中能能专一性地向向F-转移F′质粒携带的供供体基因，因因而通过F′因子的转移而而使受体菌改改变其遗传性性状，这种现现象也被称为为F因子转导。四、中断杂交交试验和基因因定位中断杂交：就是将两个菌菌株（例如Hfra+strs×F-astrr）在培养液中中进行通风培培养，每隔一一定时间取样样，把菌液放放入组织捣碎碎器里搅拌以以中断杂交，，经过稀释接接种到鉴别培培养基上，待待形成菌落后后鉴定它们的的基因型。1957年Wollman和Jacob首次进行中断断杂交实验：：供体菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受体菌：F-strrthr‑leu-azirtonrlac-gal-0azitonlacgalF0thrlactrphisthyargstrF282745616973Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecell–surfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.第三节转转导(transduction)转导：是利用噬噬菌体为媒媒介，将供供体菌的部部分DNA转移到受体体菌内的现现象。因为为绝大多数数细菌都有有噬菌体，，所以转导导作用较普普遍。另外外，转导DNA位于噬菌体体蛋白外壳壳内，不易易被外界的的DNA水解酶所破破坏，所以以比较稳定定。局限性转导导：被转导的DNA片段仅仅是是那些靠近近染色体上溶源化化位点的基基因转导普遍性转导导：任何供体的的染色体都都可以转移移至受体细细胞1952年Lederberg和他的学生生Zinder把鼠伤寒沙沙门菌的一一个突变菌菌株LT22(trp-)和另一个突突变菌株LT2(his-)在基本培养养基上进行行混合培养养，结果在在107细胞中得到到大约100个原养型菌菌落。一、转导现现象的发现现LT2菌株LT22菌株中间用滤板隔开U形管实验①可过滤因子子并不由于于DNA酶的处理而而失活；②可过滤滤因子和从从溶源性的的LT22菌株得来的的噬菌体(称为P22)具有相同的的大小和质质量；③可过滤滤因子加热热后失活，，用抗P22血清清处处理理后后也也失失活活；；④把把P22与LT2和LT22菌株株分分别别混混合合培培养养，，在在基基本本培培养养基基上上不不出出现现原原养养型型菌菌落落。。结果果证证实实了了可可过过滤滤因因子子是是温温和和噬噬菌菌体体P22。这这就就是是最最早早发发现现的的转导导现现象象。通过过一一系系列列的的实实验验，，证证实实可可过过滤滤因因子子具具有有下下列列一一些些特特性性：：转导导过过程程中中有有三三个个组组成成部部分分，，即即供体体、、噬噬菌菌体体和和受受体体。这这种种导导致致基基因因重重组组的的方方式式不不同同于于转转化化，，转转化化需需要要供供体体DNA和受体细细胞接触触，而转转导则是是以噬菌菌体为媒媒介将供供体遗传传物质传传给受体体，无需需DNA和受体细细胞接触触。转导可分分为普遍性转转导和局局限性转转导，普遍性性转导又又可分为为完全转导导和流产产转导。二、普遍遍性转导导1.完全转导导P1供体收收集子代代噬菌体体菌苔计数数噬菌体体（完全培培养基））受体（缺陷型型大肠杆杆菌）选出重组组子（转导子子）（基本培培养基））侵染裂裂解侵侵染野生型转导频率率=转导子数数×100%=转导子数数×100%侵染受体体的P1颗粒数噬噬菌斑斑数+转导子数数2.流产转转导3.普遍性性转导导在遗遗传学学和分分子生生物学学研究究中的的应用用(1)共转导导：普遍性性转导导的重重要应应用之之一是是通过过测定定共转转导的的频率率进行行基因因定位位，所所谓共转导导(cotransduction)是指两两个处处在一一个转转导片片段上上的基基因一一起整整合进进受体体染色色体中中。被共转转导的的两个个基因因之间间的距距离不不能超超过转转导噬噬菌体体所能能包装装的DNA长度，，而且且越是是紧密密连锁锁的基基因其其共转转导频频率也也越高高。F为共转转导频频率，，d为基因因间距距离，，L为转导导片段段长度度（这这里指指噬菌菌体基基因组组长度度，用用分钟钟表示示）F=(1－d/L)3d=L(1－3√F)以thr+leu+为供体，以以thr-leu-为受体的P1噬菌体转导导实验中，，得到1%的thr+leu+转导子，计计算thr和leu之间的遗传传图距。（（P1噬菌体基因因组约为大大肠杆菌染染色体长度度的2.4%）d=2.4×(1－3√0.01)=2.4×(1-0.215)=1.883(2)三点杂交法法：P1噬菌体所进进行的共转转导被广泛泛应用于大大肠杆菌的的基因定位位中。1955年Lennox用P1噬菌体转导导寄主大肠肠杆菌染色色体，研究究基因连锁锁关系时发发现，thr和leu有时能、有有时不能与与第三个基基因ara共转导。他用P1噬菌体感染染供体(thr+leu+ara+)，用所得到到的噬菌体裂解液去去感染受体体菌(thr-leu-ara-)，得到的结结果。实验1可知：ara基因与leu基因靠得较较近，而与与thr基因相距较较远，排列列顺序应是是thr-ara-leu或thr-leu-ara。如果是前一一种情况，，则thr+leu+转导子应该该大多数含含有ara+基因；如果是后后一种形式式，则thr+leu+转导子应该该很少含有有是ara+，或者根本本没有。而由实验2可知，thr+leu+转导子同时时又是ara+的占85％，所以上上述3个基因的排排列顺序是是第1种。三、局限性性转导(specializedtransduction)局限性转导导：是指以噬菌菌体为媒介介，只能将将供体菌特特定的一个个或几个基因转移到受体体菌中的转转导现象。。导致局限性性转导的一一般都是温温和噬菌体体，它们在在供体菌染染色体上具具有特定的的整合位点点。在某些些条件下，，当这种整整合状的原原噬菌体脱离寄寄主染色色体时，，偶尔会会将整合合位点两两端相邻邻的基因错误地切切离下来来，并组组装到噬噬菌体颗颗粒中。。当这种种噬菌体体感染另另一细菌菌时，就就将原寄寄主的基因转移到另另一细菌菌中。1高频转导导的原理理不正常环环出形成成特殊性转转导颗粒粒这种缺陷陷噬菌体亦是转导导噬菌体，它具有感感染能力力，能整整合到寄寄主染色色体相同同的位点点上形成成稳定的的转导子子。所得转导导子的频频率约为为10-6，称为低低频转导导。当携带有gal基因的λ缺陷噬菌菌体和正正常的λ噬菌体在在同一细细胞时，，正常λ噬菌体整整合到寄主的染色体体上后，，产生两个杂合合(细菌/噬菌体)att位点，λdgal缺陷噬菌菌体就可可以整合合到该位位点上。。高频转导导子的形形成杂基因子子重组性转转导再次整合合导致溶溶源性转转导正常λ噬菌体帮助λdgal缺陷噬菌菌体整合合和繁殖殖，因此此被称为为助手噬菌菌体（helperphage）。这种转转导子不不稳定，，因为原原噬菌体体很容易易被诱导导切离下下来。在这种切切离的裂裂解物中中，有一一半是正正常λ噬菌体，，另一半半为λdgal缺陷噬菌菌体。如如果用这这种裂解解物去转转导另一一个Gal-菌株，其其转化频频率理论论上可达达50%，所以也也称之为为高频转导导。CRISPR结结构及作作用机理理CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)为规规律律成成簇簇间间隔隔短短回回文文重重复复，，是是一一类类广广泛泛分分布布于于细细菌菌和和古古菌菌基基因因组组中中的的重重复复结结构构。CRISPR通过过与与一一系系列列相相关关蛋蛋白白、、前前导导序序列列一一起起，，为为原原核核生生物物提提供供对对抗抗噬噬菌菌体体等等外外源源基基因因的的获获得得性性免免疫疫能能力力。这种结构最早早于1987年在大肠杆杆菌(Escherichiacoli)K12的iap基因侧翼序列列中被发现，，后来，科学学家利用这个个小片段找到到了一种操作作简单、可对对多种生物的的基因组进行行遗传改造的的工具——CRISPR—Cas系统。后续的遗传学学试验和生物物化学试验也也证实，这些些CRISPR序列与很多病病毒或者质粒粒的DNA序列是互补的的，很有可能能是生物体抵抵御病毒等外外来人侵者的的一套特异性性防御机制，，就像是另外外一套适应性性免疫反应系系统。CRISPR系统基本结结构CRISPR系统由前导序序列（leadersequence，LS）、CRISPR基因座座以及一系列列Cas（CRISPR--associated）蛋白组成。Leader序列：Leader序列前导序列列由300～500bp碱基组成，位位于CRISPR的5’端，与第一个个重复序列直直接相连，是是一段在物种种内相对保守守的AT富集的区域。。有研究表明明前导序列是是新插入序列列的识别位点点，也有研究究指出，它能能够作为启动动子，启动CRISPR基因座的转录录。CRISPR基因座：CRISPR基因座由简简短稳定的同同向重复序列列(directrepect，，DR)和长长度相近的非非重复的间隔隔序列(spacer)间隔排列而而成，称为R-S结构。。其中重复序序列的片段长长度在21～～48b，且且含有5～7bp的回回文序列，通通常能形成稳稳定的茎环结结构，间隔序序列的长度在在26～72bp，可可能来源于噬噬菌体、质粒粒等外源DNA序列。Cas基因：cas基因是存在于于CRISPR位点附近近的一系列基基因，cas基因簇通常由由4～10个个保守基因组组成，它表达达出的cas蛋白对CRISPR防御御机制的实现现不可或缺。。cas基因根据其保保守程度可分分为核心cas基因、亚型特特异性cas基因和重复序序列相关未知知蛋白(repeat．．associatedmysteriousproteins，RAMP)组件件基因。cas1～6基因广广泛存在于各各种CRISPR亚型中中，故被称为为核心cas基因，其编码码蛋白的功能能现已初步得得到证实，例例如，Casl和Cas2蛋白在所有有CRISPR类型中均均存在，主要要在获取新的的重复序列过过程中发挥作作用，Cas3则具有核酸酸酶和解旋酶酶的功能，主主要作用是剪剪切目标基因因。CRISPR的工作原理理当细菌抵御噬噬菌体等外源源DNA入侵侵时，在前导导区的调控下下CRISPR被转录为长的的RNA前体体(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，，然后加工成成一系列短的的