基因诊断与基因治疗

第二十一章基因诊断与基因治疗GeneticDiagnosisandGeneTherapy基因变异致病类型内源基因的变异由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。第一节

基因诊断

GeneDiagnosis

一、基因诊断的概念、内容和特点定义:

利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。前提条件：已明确疾病表型与基因型的关系。基因诊断的基本内容检测个体基因序列特征基因突变分析测定基因拷贝数基因表达产物分析测定是否存在外源基因

特点:1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。4.适用性强，诊断范围广。5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。基因变异致病类型内源基因的变异由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。外源基因的入侵如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。二、基因诊断常用技术方法限制性内切酶谱分析法DNA限制性长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RLFP)分析等位基因特异寡核苷酸探针(allelespecificoligonucleotide,ASO)（一）核酸分子杂交技术×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析在人人类类基基因因组组中中，，平平均均约约200对碱碱基基可可发发生生一一对对变变异异，，中中性性变变异异导导致致个个体体间间核核苷苷酸酸序序列列的的差差异异，，称称为为DNA多多态态性性。不少少DNA多多态态性性发发生生在在限限制制性性内内切切酶酶识识别别位位点点上上，，酶酶解解该该DNA片片段段就就会会产产生生长长度度不不的的片片段段，，称称为为限制制性性片片段段长长度度多多态态性性。在在某某一一特特定定家家族族中中，，如如果果某某一一致致病病基基因因与与特特异异的的多多态态性性片片段段紧紧密密连连锁锁，，就就可可利利用用这这一一多多态态性性片片段段作作为为一一种种““遗遗传传标标志志””，，来来判判断断家家庭庭成成员员或或胎胎儿儿是是否否为为致致病病基基因因的的携携带带者者。。DNA限限制性片片段长度度多态性性（RFLP））RLFP分析法（二）聚聚合酶链链反应(PCR)PCR/单链构构象多态态性分析析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR产产物变性性后，经经聚丙烯烯酰胺凝凝胶电泳泳，正常常基因和和变异基基因的迁迁移位置置不同，，借此可可分析确确定致病病基因的的存在。。正常人纯合突变变杂合突变变Leber病病患者PCR/SSCP分分析+﹣PCR/等位基基因特异异寡核苷苷酸探针针(allelespecificoligonucleotide，，ASO)（三）基基因测序序即测定DNA序序列的技技术。分分离患者者的有关关基因，，测定出出碱基排排列顺序序，找出出其变异异所在，，是最确确切的基基因检测测方法。。目前用于于测序的的技术主主要有Sanger等等发明的的双脱氧氧链末端端终止法法和Maxam和Gilbert发明明的化学学降解法法。（四））基因因芯片片基因芯芯片(genechip)（又又称DNA芯片片、生生物芯芯片））通过过与一一组已已知序序列的的核酸酸探针针杂交交进行行核酸酸序列列测定定的方方法，，在一一块基基片表表面固固定了了序列列已知知的八八核苷苷酸的的探针针。当当溶液液中带带有荧荧光标标记的的核酸酸序列列与基基因芯芯片上上对应应位置置的核核酸探探针产产生互互补匹匹配时时，通通过确确定荧荧光强强度最最强的的探针针位置置，获获得一一组序序列完完全互互补的的探针针序列列。据据此可可重组组出靶靶核酸酸的序序列。。应用领领域:基因表表达谱谱分析析、基基因突突变及及多态态性分分析、、基因因组文文库作作图、、疾病病诊断断和预预测、、药物物筛选选、基基因测测序等等。三、基因诊诊断的应用用遗传性疾病病肿瘤感染性疾病病，传染性性流行病判断个体疾疾病易感性性器官移植组组织配型法医学中个个体识别、、亲子鉴定定第二节基基因因治疗GeneTherapy定义早期是指将外源正常常基因导入入靶细胞，，整合入细胞胞基因组，，纠正或补偿偿因基因缺缺陷和异常常引起的疾疾病以达到到治疗的目目的一种治疗疗方法。目前广义上来讲讲是指将某某种遗传物物质转移到到患者细胞胞内，使其其在体内发发挥作用，，以达到治治疗疾病目目的的方法法。通过基因水水平的操作作而治疗疾疾病的方法。一、基因治治疗的概念念1、基因修修正（genecorrection））2、基因替替代（置换换）（genereplacement）3、基因增增强（补偿偿）（geneaugmentation）4、基因抑抑制（geneconstraint））和/或基因失活（geneinactivation）5、免疫基基因治疗6、活化前前体药物基基因（自杀杀基因）治治疗7、耐药基基因治疗二、基因治治疗的策略略三、基因治治疗的种类类1、生殖细细胞（germcell））基因治疗疗理论上将正正常细胞基基因转移到到患者的生生殖细胞（精细胞，，卵细胞早早期胚胎））使其发育育成正常个个体。这是是理想的治治疗方法，，从根本上上治疗遗传传病，使其其有害基因因不能在人人群中播散散。2、体细胞胞（somaticcell）基因因治疗是指将正常常基因转移移到体细胞胞，使之表表达基因产产物，以达达到治疗的的目的。但但有害基因因能遗传给给后代。四、基因治治疗方式一、体内疗疗法（invivo、、一步法））将携带有治治疗基因的的载体直接接导入体内内有关的组组织器官，，使其进入入相应的组组织并进行行表达。二、体外疗疗法（exvivo、、二步法））先把待接收收基因的靶靶细胞从体体内取出，，将携带有有治疗作用用的载体导导入培养细细胞内，筛筛选、增殖殖，再回输输体内有关关组织中。。目的基因+载体↓重组DNA↓受体细胞↓外源基因表表达的筛选选↓回输体内五、基因治治疗的基本本程序1、为致病病基因2、遗传分分子机制清清楚3、该基因因已被克隆隆，一级结结构和表达达调控机制制清清楚4、可在体体外操作，，而且安全全有效5、转移基基因能完整整地、稳定定地整合，，并能适时时适量表达达（一）目的的基因的选选择原则1、基因组组DNA文文库2、cDNA（complementaryDNA）3、人工合合成基因片片段4、PCR扩增目的基因的的来源（二）受体体细胞的选选择原则1、最好选选择组织特特异性细胞胞2、容易取取出3、具有较较长的寿命命4、离体细细胞能高效效导入目的的基因5、经体外外操作后能能存活并安安全回输常用的的受受体细胞：：淋巴细胞、、造血干细细胞、皮肤肤成纤维细细胞、肝细细胞、骨骼骼肌细胞、、血管内皮皮细胞、呼呼吸道上皮皮细胞、肿肿瘤细胞。。（三）载体体的选择和和外源基因因的导入病毒载体RNA病毒毒载体（逆转录病病毒）DNA病毒毒：常用的有腺腺病毒、疱疱疹病毒、、SV40病病毒、巨细细胞病毒、、腺相关病毒毒、单纯疱疱疹病毒等等非病毒载体体质粒、脂质质体、受体体介导的蛋蛋白目前应用最最多的最成成功的是逆逆转录病毒毒，病毒感感染细胞后后，其基因因组RNA经逆转转录产生双双链DNA拷贝，插插入宿主染染色体形成成前病毒（（provirus），前病病毒转录产产生的正链链既是病毒毒RNA，，再与前病病毒编码的的外壳蛋白白包装成新新的病毒颗颗粒。完整的病毒毒颗粒具有有插入宿主主染色体必必需的全套套酶系统，，适用于介介导基因转转移。逆转录病毒毒（retrovirus））1、主要来来自莫洛尼尼氏小鼠白白血病病毒毒（Moloneymurineleukemiavirus，MoMLV））其中三个结结构基因（（gag、pol、env）被删除2、标记基基因（markergene）插入空缺缺，供阳性性选择用。。如：新霉霉素抗性基基因（neomycinresistantgene），该基因因编码新霉霉素磷酸转转移酶Ⅱ（（NPTⅡ），能对抗抗新霉素（（G418）。3、有目的的基因的插插入位点逆转录病毒毒载体的构构建逆转录病毒毒载体的优优点1.可插入入足够长的的外源DNA（7KB）2.基因转转移效率高高，几达100%3.重组体体可整合入入宿主染色色体，并稳稳定表达和和传代4.宿主范范围广、比比较安全缺点1.只能整整合入分裂裂活跃的细细胞2.靶细胞胞表面需要要有特殊的的受体3.必须使使用带有““辅助病毒毒”的包装装细胞系4.病毒滴滴度低包装细胞：：一种细胞，，重组逆转转录病毒载载体只能在在其中包装装成没有感感染能力的的病毒颗粒粒，但能从从中释放出出去，这种种细胞即包包装细胞。。1.多数由由各种辅助助病毒转染染小鼠成纤纤维细胞系系NTH3T3构成。2.辅助病病毒由MoMLV切切除了病毒毒5’端LTR至Gag起始始密码之间间包装信号号ψ等序列列，虽能产产生病毒蛋蛋白但不能能进行包装装。3.导入的的逆转录病病毒载体转转录出的RNA可以以利用辅助助病毒产生生的病毒蛋蛋白包装成成假病毒颗颗粒。包装细胞系系（四四））外外源源基基因因表表达达的的筛筛选选在较较多多的的表表达达载载体体中中都都有有neor标记记基基因因存存在在，，若若向向培培养养基基中中加加入入药药物物G418，，未未被被转转化化的的细细胞胞不不存存在在neor标记记基基因因，，细细胞胞不不能能存存活活，，最最后后只只有有转转化化细细胞胞存存活活下下来来。。（五五））回回输输体体内内1.选选择择合合适适的的疾疾病病：：单单基基因因遗遗传传病病2.具具备备该该病病分分子子缺缺陷陷的的知知识识3.有有目目的的基基因因的的克克隆隆4.克克隆隆基基因因的的有有效效表表达达5.克克隆隆基基因因的的有有效效调调节节6.可可利利用用的的动动物物模模型型遗传传病病基基因因治治疗疗的的必必要要条条件件四、、基基因因治治疗疗的的应应用用（一一））遗遗传传病病的的基基因因治治疗疗基因因治治疗疗的的部部分分对对象象1.严严重重联联合合免免疫疫缺缺陷陷症症（（腺腺苷苷脱脱氨氨酶酶ADA缺乏乏））2.囊囊性性纤纤维维变变性性3.Gaucher病病ⅠⅠ型型（（葡葡糖糖脑脑苷苷脂脂酶酶缺缺陷陷））4.苯苯丙丙酮酮酸酸尿尿症症（（苯苯丙丙氨氨酸酸羟羟化化酶酶缺缺陷陷））5.血血友友病病B（（凝凝血血ⅨⅨ因因子子缺缺陷陷））6.家家族族性性高高胆胆固固醇醇血血症症7.地地中中海海贫贫血血1.宿宿主主的的修修饰饰：：保护护分分裂裂旺旺盛盛的的正正常常组组织织，，如如造造血血干干细细胞胞：：导导入入二氢叶酸还原原酶基因，获得对氨甲蝶呤的抗性2.增强肿瘤瘤浸润淋巴细细胞（TIL）活性：如将肿瘤坏死死因子（TNF）基因导导入TIL。。这是目前肿肿瘤基因治疗疗最常用的方方法。3.肿瘤细胞胞的修饰（二）肿瘤的的基因治疗如：自杀基因+病毒毒载体转染重组载体药物前体(无毒)Gene→酶酶→↓↓药物复合物(有毒)细胞死亡例如：单纯疱疹病毒毒哺哺乳动物细胞胞HSVGene-TK（在肿瘤细胞胞中表达，正正常细胞中不不表达）Gene—TKGCV（胸苷苷类似物）TdRPpGCV---p抑制DNA合合成脱脱氧胸苷酸酸肿瘤细胞死亡亡邻近细胞死亡亡/凋亡（旁旁观者效应））（三）艾滋病病的基因治疗疗（四）心血管管疾病、神经经系统疾病等等其它领域中的的应用1、基因治疗疗要获得成功功，必须具备备切实有效的的目的基因。2、外源基因因在人体内的的表达调控存在一定的问问题，尽管目目前已有多种种基因载体可可供选择，但但如何扬长避避短，构建安安全、高效、、靶向、可控控的载体是亟亟待解决的问问题。3、目前基因因治疗的方案案多数是采用用exvivo方法，但受体体细胞经体外外长期培养和和增殖后，细细胞生物学特特性是否改变变也是值得研研究的问题。。4、要充分估估计导入外源源基因对机体体的不利影响。祝大家复习好好取得优异成绩绩9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。12月月-2212月月-22Friday,December23,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。06:10:2506:10:2506:1012/23/20226:10:25AM11、以我独独沈久，，愧君相相见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