基因工程的基本操作程序张

基因工程的基本操作程序基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取

目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因

获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成1.从基因文库中获取目的基因1)基因文库的概念:

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2)基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库基因组文库与部分基因文库的关系3)基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA

许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?依据：目的基因的有关信息。如：

根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA

基因翻译产物蛋白质等特性4)从基因文库中得到目的基因的方法1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNA

B、线粒体DNAC、总mRNA

D、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC2、利用PCR技术扩增目的基因PCR——聚合酶链式反反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技技术。通过此技术，，可获取大量量的目的基因因。以方式扩增，即（n为扩增循环的的次数）指数2n方式使目的基因的的片段在短时时间内成百万万倍地扩增结果原理：DNA双链复制PCR技术前提：条件PCR扩增仪一段已知目的的基因的核苷苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）PCR技术的操作过过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度度降低，引物与DNA模板结合，形形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合合成与模板互互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复步骤：每重复复一次，目的的基因增加___倍一PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对对原则碱基互补配对对原则四种脱氧核苷苷酸、模板、、酶、ATP四种脱氧核苷苷酸、模板、、酶、引物DNA在高温下变性性解旋解旋酶催化解解旋半保留复制、、边解旋边复制制半保留复制、、全解旋再复制制体外复制主要在细胞核核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋旋酶等反转录法目的基因的信信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序序列信使RNA序列基因的核苷酸酸序列目的基因合成推测推测单链DNA合成3.人工合成—化学合成法基因较小，核核苷酸序列已已知，可以利利用DNA合成仪人工合合成变式迁移1．(多选)下图表示限制制酶切割某DNA的过程，从图图中可知，该该限制酶能识识别的碱基序序列及切点是是()A．CTTAAGB．GAATTCC．切点在G和A之间D．切点在C和T之间P42．你能否用DNA连接酶将下列列末端连接起起来？(1)…CTGCA(2)…AC(3)GC……G…TGCG…(4)…G(5)G…(6)…GC…CTTAAACGTC……CG(7)GT…(8)AATTC…CA…G…变式迁移答案：(2)和(7)能连接形成…ACGT……TGCA…(4)和(8)能连接形成…GAATTC……CTTAAG…(3)和(6)能连接形成成…GCGC……CGCG…(1)和(5)能连接形成成…CTGCAG……GACGTC…3、在遗传工工程中，若若有一个控控制有利性性状的DNA分子片段为为ATGTG／TACAC，要使其数数量增多，，可用PCR技术进行人人工复制，，复制时应应给予的条条件是①双链DNA分子为模板板②ATGTG或TACAC模板链③③四种脱氧氧核苷酸④④四种核核苷酸⑤⑤DNA聚合酶⑥⑥热稳定DNA聚合酶⑦引引物⑧温温度变化⑨⑨恒温A．①③④⑦⑦⑨B．①④⑥⑦⑦⑧C．②⑤⑥⑦⑦⑨D．①③⑥⑦⑦⑧D4、在基因工工程中，把把选出的目目的基因（（共1000个脱氧核苷苷酸对，其其中腺嘌呤呤脱氧核苷苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩扩增4代，那么，，在扩增仪仪中应放入入胞嘧啶脱脱氧核苷酸酸的个数是是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个B1000个脱氧核苷苷酸对，即即2000个核苷酸。。由于A=T=460个，所以，，C=G=540个。所以，一个个目的基因因有胞嘧啶啶脱氧核苷苷酸540个。扩增4代可产生16个DNA分子，根据据DNA半保留复制原则，其其中有一个个DNA分子“相当当”于亲代代的DNA。所以，在扩扩增仪中应应放入胞嘧嘧啶脱氧核核苷酸数为为（16-1）*540=8100个。5、在已知序序列信息的的情况下，，获取目的的基因的最最方便方法法是A、化学合成成法B、基因组文文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链链反应6、下列获取取目的基因因的方法中中需要模板板链的是①从基因文文库中获取取目的基因因②②利用PCR技术扩增目目的基因③③反转转录法④④通过DNA合成仪利用用化学方法法人工合成成A．①②③④④B．①②③C．②③④D．②③AD二、基因表表达载体的的构建——基因工程的的核心1、目的：所需物质：：使目的基因因在受体细细胞中稳定定存在，并并且可以遗遗传给下一一代，同时时使目的基基因能够表表达和发挥挥作用。它们各自的的作用是什什么?2、基因表达达载体的组组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的的作用是什什么?启动子：位于基因的的首端的一一段特殊的的DNA片断，它是是RNA聚合酶识别别和结合的的部位，有有了它才能能驱动动基基因因转转录录出出mRNA，最最终终获获得得蛋蛋白白质质终止止子子：：位于于基基因因的的尾尾端端的的一一段段特特殊殊的的DNA片断断，，能终终止止mRNA的转转录录标记记基基因因的作作用用是是为了了鉴别别受体体细细胞胞中中是是否否含含有有目目的的基基因因，，从从而而将将有有目目的的基基因因的的细细胞胞筛筛选选出出来来①载体体与表达达载载体体的区区别别：：二二者者都都有有标标记记基基因因和和复复制制原原点点两两部部分分DNA片段段。。表表达达载载体体在在载载体体基基础础上上增增加加了了目目的的基基因因、、启启动动子子、、终终止止子子三三部部分分结结构构②用到到的的工工具具酶酶：：既用用到到限限制制酶酶切切割割载载体体，，又又用用到到DNA连接接酶酶将将目目的的基基因因和和载载体体拼拼接接，，两两种种酶酶作作用用的的化化学学键键都都是是磷磷酸酸二二酯酯键键③启动动子子、、终终止止子子对于于目目的的基基因因表表达达必必不不可可少少④目的基因不能能单独进入受受体细胞，必需以表达载载体的方式携携带进去。注意启动(终止)转录启动(终止)翻译作用位于DNA上位于mRNA上位置DNA片段三个相邻碱基基本质启动(终止)子启始(终止)密码子三.将目的基因导导入受体细胞胞1.转化：2.方法：将目的基因导导入植物细胞将目的基因导导入动物细胞将目的基因导导入微生物细胞农杆菌转化法法基因枪法花粉管通道法法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入入_________内，并且在受受体细胞胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因因导入植物细细胞的方法：：（1）农杆菌转化化法①农杆菌特特点：易感染双子子叶植物和和裸子植物物，对大多多数单子叶叶植物没有有感染能力力②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到到受体细胞胞，并整合合到受体细细胞染色体体的DNA上。③过程：④优点经济和有效效（2）基因枪法法（3）花粉管通通道法2、将目的基基因导入动动物细胞①方法：显微微注射法②程序：目的基因表表达载体提提纯取取卵（受精精卵）显显微注射受受精卵新新性状动物物3、将目的基基因导入微微生物细胞胞①原核生物特特点：繁殖快、单单细胞、遗遗传物质少少②方法：用Ca2+处理细胞感感受态细细胞表表达达载体与感感受态细胞胞混合感感受态态细胞吸收收DNA分子四、目的基基因的检测测与鉴定导入过程完完成后，全全部受体细细胞都能摄摄入入重组DNA分子吗？真正能摄入入重组DNA分子的受体体细胞很少少。目的基因进进入受体细细胞后，是是否都能稳稳定维持和和表达？不一定，需需要检测1、鉴定——分子水平的的鉴定转基因生物的DNA探针15N15N（1）检测转转基因生物物染色体的的DNA上上是否插入入了目的基因基因探针：：指用荧光或或放射性同位位素标记的的DNA分分子方法——DNA分子子杂杂交交技技术术变性性变性性1、鉴鉴定定———分子子水水平平的的鉴鉴定定变性性方法法———分子子杂杂交交技技术术（2）检检测测目目的的基基因因是是否否转转录录出出了了mRNA探针针15N15N转基基因因生生物物的mRNA1、鉴鉴定定———分子子水水平平的的鉴鉴定定提取取（3）检检测测目目的的基基因因是是否否翻翻译译成成蛋蛋白白质质方法法———抗原原-抗体体杂杂交交苏云金杆菌Bt毒素素蛋蛋白白将Bt毒蛋蛋白白注注射射小小鼠鼠体体内内从小小鼠鼠血血管管抽抽出出血血液液分分离离出出抗抗Bt毒素的抗体体抗体蛋白质出现杂交带带脱分化组织培养思考？不能，受体体细胞必须须表现出特特定的性状状，才能说说明目的基基因完成了了表达。受体细胞摄摄入DNA分子后就说说明目的基基因完成了了表达吗？？2、鉴定——个体水平的的鉴定抗虫、抗病病接种实验验，活性比比较实验例：用棉铃铃饲喂棉铃铃虫，如虫虫吃后不出出现中毒症症状，说明明未摄入目目的基因或或摄入目的的基因未表表达。如虫虫吃后中毒毒死亡，则则说明摄入入了抗虫基基因并得到到表达。变式迁移4．下列技术术中不是依依据DNA分子杂交原原理的是()A．检测目的的基因是否否导入了受受体细胞B．检测目的的基因是否否转录了mRNAC．检测目的的基因是否否翻译合成成蛋白质D．快速灵敏敏地检测饮饮用水中病病毒的含量量点评：(1)涉及目的基基因的检测测与鉴定习习题时，应应注意审题题，辨清是是要求从“分子水平”还是从“个体水平”。(2)DNA探针及其应应用①DNA探针是指用用荧光或放放射性同位位素标记的的DNA分子，其应应用依据的的原理是DNA分子杂交。。②应用：DNA探针可用来来检测DNA或RNA分子，因此此其应用广广泛，如a．从基因文文库中准确确提取目的的基因。b．检测转基基因生物的的染色体DNA上是否插入入了目的基基因和检测测目的基因因是否转录录出了mRNA。c．鉴定物种种亲缘关系系。d．疾病的诊诊断和治疗疗。e．环境监测测。归纳:基因工程的的基本操作作程序获取目的基基因从基因文库库利用PCR化学方法人人工合成构建基因表表达载体目的基因、、启动子、、终止子、、标记基因因将目的基因因导入受体体细胞农杆菌转化化法、显微微注射法目的基因的的检测与鉴鉴定检测：是否否插入、转转录、翻译译鉴定：变式迁移3．采用基因因工程方法法培育抗虫虫棉，下列列导入目的的基因的做做法正确的的是()①将毒素蛋白白质注射到到棉花受精精卵中②②将编码码毒素蛋白白的DNA序列注射到到受精卵中中③将将编码毒素素蛋白质的的DNA序列，与质质粒重组，，导入细菌菌，用该细细菌感染棉棉的体细胞胞再进行组组织培养④④将编码码毒素蛋白白质DNA序列与细菌菌质粒重组组，注射到到棉的子房房并进入受受精卵A．①②B．②③C．③④D．①④P10点评：(1)农杆菌转化化法中有二二次拼接和和二次导入入。第一次次拼接是将将目的基因因拼接到Ti质粒上T-DNA的中间部位位，第二次次拼接(非人工操作作)指被插入目目的基因的的T-DNA被拼接到受受体细胞的的染色体DNA上；第一次次导入是将将含目的基基因的Ti质粒重新导导入农杆菌菌，第二次次导入(非人工操作作)是指含目的的基因的T-DNA进入受体细细胞。(2)因为动物体体细胞的全全能性受到到一定限制制，故一般般将目的基基因导入动动物的受精精卵或卵细细胞，而不不是体细胞胞；而植物物体细胞的的全能性相相对容易表表达，故一一般将目的的基因导入入植物的体体细胞，然然后再通过过植物组织织培养技术术获得转基基因植株。。练习1：(2008理综山东卷卷)为扩大可耕耕地面积，，增加粮食食产量，黄黄河三角洲洲等盐碱地地的开发利利用备受关关注。我国国科学家应应用耐盐基基因培育出出了耐盐水水稻新品系系。（1）获得耐盐盐基因后，，构建重组组DNA分子所用的的限制性内内切酶作用用于图中的的处，DNA连接酶作用用于处。（填“a”或“b”）练习1：(2008理综山东卷卷)为扩大可耕耕地面积，，增加粮食食产量，黄黄河三角洲洲等盐碱地地的开发利利用备受关关注。我国国科学家应应用耐盐基基因培育出出了耐盐水水稻新品系系。（2）将重组DNA分子导入水水稻受体细细胞的常用用方法有农农杆菌转化化法和法。（3）由导入目目的基因的的水稻细胞胞培养成植植株需要利利用技术，该该技术的的核心是是和。（4）为了确确定耐盐盐转基因因水稻是是否培育育成功，，既要用用放射性性同位素素标记的的作探针进进行分子子杂交检检测，又又要用方法从个个体水平平鉴定水水稻植株株的耐盐盐性。答案：（（1）aa（2）基因枪枪法（花花粉管通通道法））（3）植物组组织培养养（1分）脱分化（（去分化化）再再分化（4）耐盐基基因（目目的基因因）一一定定浓度盐盐水浇灌灌（移栽栽到盐碱碱地中））①基因组文文库的构构建（2）基因文文库的构构建方法法通过对受体体菌的培养养而储存基基因②cDNA文库的构建建-----反转录法：：以目的基因因转录成的的信使RNA为模板，反反转录成互互补的单链链DNA，然后在酶酶的作用下下合成双链链DNA，从而获得得所需的基基因。目的基因的的mRNA单链DNA反转录酶DNA聚合酶双链DNA(目的基因)1)基因组文库库是指将某种种生物体的的全部基因组组DNA用限制性内内切酶或机机械力量切切割成一定定长度范围围的DNA片段，再与与合适的载载体在体外外重组后，，导入受体体细菌的群群体中储存存，这个群群体就称为为该生物的的基因组文文库。其目目的是分离离有用的目目的基因和和保存某种种生物的全全部基因。。一、目的基基因的获取取基因组DNA限制酶基因重组转化细菌体外包装（一）从基基因文库中中直接获取取1.基因文库1、原核细胞胞的基因结结构非编码区非编码区编码区编码区上游游编码区下游游与RNA聚合酶结合合位点启动子终止子启动子：位于基因的的首端的一一段特殊的的DNA片断，它是是RNA聚合酶识别别和结合的的部位，有有