基因表达调控及重组DNA技术

第十三---十五章基因表达调控及重组DNA技术1主要内容基因及基因表达调控相关概念原核基因表达调控基本原理真核基因表达调控基本原理重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理2

负载特定遗传信息的DNA片段，包括：DNA编码序列、非编码调节序列和内含子序列。

基因（Gene）3基因组（Genome）来自一个遗传体系的一整套遗传信息原核：单个环状染色体所含的全部基因真核：一个生物体的染色体所包含的全部DNA，又称染色体基因组线粒体基因组叶绿体基因组4HumanGenome5人类基因组计划（HumanGenomeProject,HGP）1985年美国提出计划投入30亿美元，15年完成1990年正式启动英、法、德、日、中国等先后加入中国的任务：人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序，该区域约占人类整个基因组的1％。

6年10月启动2000年6月完成草图2001年2月《nature》公布草图

Nature,409(6822):860-921,2001

2004年10月《nature》公布精度>99%的测序图人类基因数：2-2.5万Nature,431(7011):931-945,2004HGP的进展Thepost-genomeeraiscoming7谱主为生物学大师耗资200万完成盼未来降价普及助提早预防疾病“生命天书”——首份个人基因图公布(2007.5.30)JamesWaston8

基因表达调控是指细胞生物接受环境信号刺激或适应环境营养供给状况的变化，在基因表达水平上作出应答反应的分子机制。重组DNA技术本质上是一项生物技术，目的在于通过人工重组DNA的方法，获得某一目的基因的无性繁殖系—DNA克隆，或使目的基因在一定的表达体系表达有特殊意义的蛋白质。主要研究内容：基因表达方式、规律、调节机理9第一节基因表达调控10一、基因表达达的概念*在各种调节机机制控制下，，从基因激活活开始，经历历转录、翻译译等过程产生生具有生物学学功能的蛋白白质分子，从从而赋予细胞胞一定的功能能或表型，或或使生物体获获得一定的遗遗传性状。11DNARNA蛋白质转录翻译逆转录简单定义：转转录＋翻译译广义：包括rRNA、、tRNA的的表达12二、基因表达达调控的意义义生物体基因数数量很多，但但在某一特定定时期只有一一小部分基因因处于活化状状态，能进行行转录（例如如，真核细胞胞约2～5％％基因具转录录活性）。因因此，机体内内存在着复杂杂的调节机制制，调节基因因的表达。通过调控基因因的表达，使使生物体适应应环境、调节代谢、维维持其生长与与繁殖。基因表达调控控的意义：13三、基因表达达的规律*阶段特异性（（时间特异异性）组织特异性（（空间特异异性）14阶段特异性（（时间特异异性）甲胎蛋白某一特定基因因的表达严格格按一定的时时间顺序发生，称时间特异性*多细胞生物的的不同基因在在不同发育阶阶段按特定时间顺序开启启和关闭，称称阶段特异性*哺乳类nAChR：胚胚胎型αα2βγδ(烟碱型乙酰酰胆碱受体)成年型α2βεδ15组织特异性（（空间特异异性）在个体生长的的某一阶段，，不同细胞胞有不同基因因表达胰岛素：胰岛细胞血红蛋白：红细胞鸟氨酸循环酶类：肝细胞X

YXY

AB16四、基因表达达的方式有些基因的产产物对于生物物体的整个生生命过程都是是必不可少的的，这类基因因在生物体的的几乎所有细细胞中持续表表达，这类基基因被称为管家基基因。。这类基基因的的表达达称为为基本的的基因因表达达*。例如：：葡萄萄糖酵酵解途途径中中各种种酶的的编码码基因因基本的的基因因表达达也是是在一一定机机制控控制下下进行行（一））基本本的基基因表表达17（二））可调调节的的基因因表达达与管家家基因因不同同，另另一些些基因因表达达状况况极易易受外外环境境变化化的影影响，，随外外环境境变化化，这这类基基因表表达水水平可可升高高或降降低,又称称适应应性性表表达达；又又称称奢侈侈基基因因。特点点：：不不是是细细胞胞生生命命必必不不可可少少的的表达达受受外外环环境境的的影影响响较较大大，，不不恒恒定定表表达达有间间断断性性和和空空间间特特异异性性18诱导导基因因表表达达水水平平在在特特定定环环境境中中增增高高的的现现象象这类类基基因因叫叫可诱诱导导基基因因阻遏遏基因因对对环环境境信信号号应应答答表表现现为为表表达达水水平平降降低低这类类基基因因叫叫可阻阻遏遏基基因因DNA损损伤伤：：DNA损损伤伤修修复复酶酶被被诱诱导导色氨氨酸酸供供应应充充足足：：参参与与合合成成色色氨氨酸酸的的酶酶被被阻阻遏遏19五.基基因因表表达达的的多多级级调调控控基因因表表达达调调控控在在多多级级水水平平上上进进行行基因激活转录起始*转录后加工及转运mRNA降解翻译及翻译后加工蛋白质降解20六、、基基因因表表达达调调控控原原理理以mRNA转转录录为为例例DNA元元件件调节节蛋蛋白白RNA聚聚合合酶酶活活性性*调控控要要素素（一一））转转录录起起始始调调节节基基因因表表达达21（1））DNA元元件件：：具有有调调节节功功能能的的特特异异DNA序序列列操纵纵子子：：由功功能能上上相相关关的的一一组组酶酶或或蛋蛋白白质质基基因因在在染染色色体体上上串串联联一一起起并并共共同同享享用用同同一一表表达达调调控控的的DNA组组件件所所构构成成的的一一个个转转录录单单位位。。操纵纵子子调节节序序列列编码码序序列列：：编编码码蛋蛋白白质质启动序列：结结合RNA聚聚合酶操纵序列：结结合阻遏蛋白白*1、原核生物物22操纵子结构编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)23原核生物启动动序列（启动动子）RNA转录起始-35区-10区TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrptRNATyrlacrecAAraBADTTGACA

TATAAT一致序列24（2）调节蛋白特异因子决定RNA聚聚合酶特异识识别并结合启动序列的能能力（σ因子）阻遏蛋白与操纵序列结结合，抑制RNA聚合酶酶活性（负性调节））激活蛋白促进RNA聚聚合酶活性（正性调节））25（3）RNA聚合酶酶活性DNA元件与调节蛋白对转录激活的的调节作用最最终由RNA聚合酶酶活性体现。启动序列或启启动子的结构构、调节蛋白白的性质对RNA聚合酶酶活性影响最最大。262.真核核生物（1）顺式作用元件件：（2）反式作用因子子：（3）mRNA转录录激活及其调调节27第二节原原核基因表达达调控与真核核基因表达调调控的基本原原理28一、原核基因因表达及其调调控的特点1、转录与翻翻译两过程紧紧密偶联3、操纵子调调节机制中普普遍存在阻遏遏蛋白介导的负性调节*2、普遍存在在操纵子调节节机制阻遏蛋白操纵序列结合阻遏解聚结合去阻遏阻碍294、转录产物物为多顺反子子mRNA5、转录起始是基因表达调调控的最关键键环节*多顺反子mRNA：多个功能相关关的基因串联联，转录产产物在一条mRNA上，翻译产产物为多个多多肽链30二、操纵子理理论通常一个操纵纵子含有一个启动序列列及数个编码码基因（2～6个，，甚至更多）），还有其它它调节序列。。编码序列

启动序列

操纵序列其他调节序列(promoter)(operator)PO(codingsequence)操纵子结构31乳糖操纵子调节机制阻遏蛋白的负负性调节CAP的正性性调节协调调节32乳糖操纵子结结构CAP结合位点PIIPOZYA调控区结构基因I:阻遏蛋白编码基因

PI:阻遏蛋白基因启动序列

Z:β-半乳糖苷酶Y:透酶

A:乙酰基转移酶结构基因O:操纵序列（阻遏蛋白结合部位）P:启动序列CAP结合位点调控区331.阻阻遏遏蛋蛋白白的的负负性性调调节节（无无乳乳糖糖））*阻遏遏蛋蛋白白与与O序序列列结结合合,抑抑制制转转录录,lac操纵纵子子关闭闭阻遏遏蛋蛋白白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚聚合合酶酶34诱导导剂剂结结合合于于阻阻遏遏蛋蛋白白，，阻阻遏遏蛋蛋白白与与O序序列列解解离离，，转转录录抑抑制制解解除除，，lac操纵纵子子开开启启乳糖糖别乳乳糖糖CAP结合位点PIIPOZYAmRNA阻遏遏蛋蛋白白的的负负性性调调节节（有乳乳糖糖）*35CAP:分分解代代谢基基因激激活蛋蛋白catabolitegeneactivatorprotein同二聚体cAMP

结合区

DNA

结合区362.CAP的的正性性调节节（无葡萄萄糖）*cAMPCAP蛋白白PIIPOZYACAP结合位点mRNA无葡萄糖，cAMP浓度高cAMP与CAP结合与CAP结合位点结合转录活性提高约50倍37CAP的正正性调调节（有葡萄萄糖）*cAMPCAP蛋白白PIIPOZYACAP结合位点mRNA有葡萄糖，，cAMP浓度低cAMP与CAP结合受阻转录活性下下降38阻遏蛋白白mRNACAP结合位点PIIPOZYARNA聚聚合酶3.阻阻遏蛋蛋白与CAP的的协调调调节*（1）无无乳糖时时,阻阻遏蛋白白封闭转转录，CAP无作用用39（2）有有乳糖糖时,乳乳糖操操纵子去去阻遏,虽可可转录录,但活性很很低,必必须由由CAP的正性性调节来来加强PIIPOZYACAP结合位点mRNA40乳糖操纵纵子强的转录活活性既需要乳乳糖存在在又需要缺缺乏葡萄萄糖41（一）真真核基因因结构特特点1.转转录产物物为单顺顺反子一个基因因——一一条mRNA——一一条多多肽链2.重重复序列列高度重复复序列、、中度重重复序列列、单拷拷贝序列列3.基基因不连连续性非编码序序列内内含子1235’3’三、真核核基因表表达调控控42（二）真真核基基因转录录特点活性染色色体结构构变化对核酸酶酶敏感、、甲基化化程度降降低、组组蛋蛋白乙酰酰化修饰饰2.正正性调调节占主主导真核RNA聚合合酶对启启动子的的亲和力力极小或或根本没没有实质的亲亲和力，，转录起起始需依依赖多种种激活蛋蛋白的作作用3．转录录与翻译译分隔进进行转录在核核内进行行，翻译译在胞浆浆进行43转录（起始））调节实质上上是调节蛋白白与DNA的的相互作用1、顺式作用元件件：2、反式作用因子子：3、mRNA转录录激活及其调调节（三）真核基基因转录激活活调节441.顺式作作用元件*指结构基因两两侧或内部具具有调节功能能的DNA序序列，因其作作用于自身分分子并发挥作作用，所以称称顺式作用元件件。根据位置、性性质及作用方方式的不同分分为启动子、增强强子和抑制子子。45真核生物——顺式作用元件件结构基因序列

启动子(promoter)P

抑制子(silencer)增强子(enhancer)增强子(enhancer)46RNA聚合酶酶II启动位位点周围一组组转录控制制组件常见组件：TATA盒（TATAAA）-25bp~-30bpGC盒（GGGCGG）CAAT盒（CCAATC）CAAT盒GC盒TATA盒转录起始点-30bp~-110bp启动子promoter47增强子*：远离转录起始始点、决定组组织特异性表表达、增强启启动子转录活性的特异异DNA序列列，其发挥作作用的方式与与方向、距离无关。抑制子*：对启动子转录录活性起抑制制作用的DNA序列负性调节元元件482、反式作作用因子（（转录因子子）转录因子、、转录调节节因子、转转录调节蛋蛋白基本转录因因子转录激活因因子转录抑制因因子49绝大多数数转录因因子属于于反式作用用因子*真核生物物：由某一基基因表达达后，通通过DNA-蛋蛋白质或或蛋白质质-蛋白白质相互互作用控控制另一一基因的的转录。。50AB51RNA聚聚合酶结结合启动动子所必必须的一一组转录录因子基本转录录因子FEBDARNA

polⅡTATADNATATATFⅡD

TFⅡA

TFⅡB

TFⅡF

TFⅡERNApolⅡ52转录激活活因子（（正正性调节节因子））通过DNA－蛋蛋白质、、蛋白质质－蛋白白质相互互作用起起正性调节节作用的的转录因因子。转录抑制制因子（（负性性调节因因子）通过DNA－蛋蛋白质、、蛋白质质－蛋白白质相互互作用起起负性调节作作用的转转录因子子。与增强子子结合的的转录因因子与抑制子子结合的的转录因因子53真核RNA聚合合酶II不能单单独识别别启动子子，而是是由基本本转录因因子TFIID识别并结结合启动动子，形形成TFIID－启动动子复合合物，然然后有一一系列的的转录因因子（如如TFIIA、、TFIIB、、TFIIE、、TFIIF等等）加入入形成前前起始复复合物，，调节转转录的起起始。3．mRNA转转录激活活及其调调节54第三节重重组DNA技技术55基因重组组（geneticrecombination）自然发生生的基因因重排真核、原原核均会会发生基因变异异、物种种演变、、生物进进化的基基础基因工程（geneticengineering）重组DNA技术人工进行基因重组56克隆*(名词)：就是指来来自同一一母本的的所有副副本或拷贝的集集合。克隆化（（动词））：获取同一一拷贝的的过程。。二、重组组DNA技术相关关概念母本克隆clonecloning（一）克克隆与与克隆化化57细胞克隆：从大量群体细细胞中分离出出某一种类型型细胞，经扩增获得这这样一类相同同的细胞。在分子生物学学领域所说的的分子克隆专专指DNA克隆(DNAcloning)。分子克隆：从众多不同的的分子群体中中分离到的很很多相同分子子的集合。58（二）重组DNA技技术*应用酶学的方方法，在体外外将各种来源源的遗传物质质（目的基因因或目的DNA）与载体体DNA连接接成复制子，，然后通过转转化或转染等等方法导入宿宿主细胞，生生长、筛选出出含有目的基基因的转化子子细胞。转化化子细胞经扩扩增、提取，，获得大量目目的DNA的的无性繁殖系系，即DNA克隆，基因因工程。59目的DNA载体DNA连接复制子（重组组DNA）导入宿主细胞胞（转化或或转染）转化子细胞转化子细胞扩扩增，可获得得大量重组DNA60基因克隆DNA克隆重组DNA同一概念生物技术工程基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程获得DNA的无性繁殖系获得目的基因的表达产物重组DNA的目的

61（三）工工具酶限制性核酸内内切酶连接酶DNA聚合酶酶反转录酶多聚核苷酸激激酶62限制性核酸内内切酶*识别和切割双双链DNA分分子内部特异异核苷酸序列列的一类核酸酸酶。限制性核酸内内切酶共分三三类，基因工工程常用II类酶，这这类酶常识别别DNA的回文文序列*。63HpaI：：5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’’平端PstI：：5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’’3’突出粘性性末端EcoRI：：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’突出粘性性末端64（四）目的基基因targetgenecDNA(complementaryDNA)在体外以RNA（通常为为mRNA））为模板，经反转录合成成的单链DNA。基因组DNA(genomicDNA)代表一个细胞胞或生物体整整套遗传信息息的所有DNA序序列。目的基因又称称外源DNA65携带外源DNA，实现外外源DNA无无性繁殖或表表达有意义的的蛋白质所采用用的一些DNA分子。常用载体：质质粒噬噬菌体体DNA病病毒毒DNA质粒（1）双链环环状DNA，，细菌染色体体外（2））2-3kb或或数数百百kb（3）独立自自主复制，稳稳定遗传（4）遗传标标志(五)基基因载体（（克隆载体体）66三、重组DNA技术的原理与基本过程*1.获取目目的基因2.选择、、构建基因载载体3.目的基基因与载体连连接，形成重重组分子4.重组分分子导入受体体细胞5.筛选、、扩增6.表达目目的基因67+载体目的基因重组DNA分分子细菌转化或转染扩增筛选68（1）化学学合成（4）PCR（2）基因因组DNA文文库（3）cDNA文库1.获取目目的基因69组织或细胞染染色体限制性内切酶酶多个DNA片片段载体多种转化子（基因文库））重组DNA导入宿主细胞胞mRNA逆转录cDNAcDNA文库70聚合酶链式反反应（PCR）在有特定模板板、特异DNA引物及合合成DNA所所需要的dNTP存在时时，向DNA合成体系内内加入耐热的的DNA聚合合酶（如TaqDNA聚合酶酶*），经反复变变性、退火及及延伸的多个个循环反应，，生成特异DNA产物的的过程。71变性：解开模板双链链DNA95℃退火：使引物与单链链模板DNA结合55℃延伸：DNA链的合合成72℃722.克隆载载体的选择与与构建目的基因不能能自我复制3.目的基因与载