发光法检测食品微生物课件

发光法检测食品中微生物讲解生物发光ATP法微生物检测介绍ATP生物发光法检测的原理ATP生物发光法的检测步骤ATP生物发光法的特点ATP生物发光法的应用发光生物真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们最熟悉的萤火虫海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光”现象。

多年前，科学家已经将生物萤光应用到生命科学领域。与化学荧光（fluorescence）相比，生物萤光（bioluminescence）更灵敏、更可信、效果更好。

多数海洋生物都靠'荧光素——荧光素酶'系统发光。不同的'荧光素——荧光素酶'反应产生不同的光。有一些动物虽然自己不闪光，但把荧光素和荧光素酶分泌入水中，让它们相互作用，产生光雾，掩护自己逃走。一、生物发光ATP法微生物检测

在食品微生物生物发光检测方面，主要的方法为ATP酶法。20世纪80年代，英国人首先研制出ATP检测仪（检测系统）。1983年，Moyer等最早提出细胞内源性ATP的含量可以反映细胞的活性和活细胞的数量。同年Gronroos等也证实该技术是一种可靠、灵敏度高的确定细胞活性度的检测方法。目前，这一技术已经应用于各项食品产业，包括生乳生菌数估算[Giese,1997]、果汁产业的菌数估算[Graumlich,1985]等。

由于在活细胞中ATP含量近乎是恒定的，所以通过检测ATP，可以间接地证明生物体的存在。生物发光法无需培养过程，操作简便、灵敏度高，整个过程仅为十几分钟，具有其他微生物检测方法无可比拟的优势。。ATP理化性质ATP(adenosinetriphosphate，三磷酸腺苷)是高能磷酸化合物的典型代表。ATP是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三个相连的磷酸基团构成的核苷酸，其分子结构式如图1所示。ATP是细胞内特殊的自由能载体，广泛地存在于细胞内，如细胞核、细胞溶胶、线粒体等。易水解，且水解时可释放出大量的能量，但水解易受细胞内环境的pH、Mg2+浓度等的影响。ATP在生命活动中起着传递能量的作用。二、ATP生物发光法检测的原理

ATP普遍存在于所有活的生物体中，被用来贮存和传递化学能，称作为“能量货币”。当生物体死亡后，在细胞内酶的作用下，ATP很快被分解掉。因此，测定样品中的ATP浓度，即可推算出活菌数。

McElroy最先引入“荧光素酶---ATP”检测法，其反应机理为：在Mg2+存在下，荧光素酶(fireflyluciferase)以D-荧光素酶、ATP、O2为底物，将化学能转化为光能。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。三、ATP生物发光法的检测步骤

ATP生物发光法的检测步骤大体包括：取样、样品ATP的萃取、添加‘荧光素-荧光素酶’、测定生物发光量、求出ATP浓度和活菌数。

通常，样品未经处理是不能测定ATP的。测定时需先将样品与ATP提取剂混合，使细胞膜和细胞壁溶解，释放出ATP。ATP提取剂是以表面活性剂为基质的专用试剂。然后，提取出的ATP再与‘荧光素-荧光素酶’生物发光剂作用，用发光检测仪测定ATP与发光剂反应的生物发光量。通过预先测定的ATP标准曲线，得出活菌的总ATP量，即可得出细菌总数。ATP生物发光法检测微生物，需要先将