干细胞考试要点

胚胎工程胚胎工程精子结构精子获能精子获能过程精子获能意义顶体反应皮层反应胚胎发育的过程胚胎工程（embryoengineering）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。哺乳动物的胚胎工程意义较低等动物大，因此本章将要介绍有关哺乳动物胚胎工程中的配子操作（gametemanipulation）和胚胎操作（embryomanipulation）。胚胎工程主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术、胚胎嵌合、性别控制技术等。1、精卵发生哺乳动物的生殖是一个相当复杂的生命现象，在胚胎早期，生殖细胞首先与体细胞分离，形成的细胞为原生殖细胞(PGCs),其后，经过性别决定和将要进行的性别分化，形成两种生殖细胞。生殖细胞经过增殖期、生长期和成熟期,最终形成精子和卵子。1.1精子的发生睾丸是精子“诞生地“。人的睾丸内主要有三种细胞：支持细胞、生殖细胞和间质细胞。支持细胞和生殖细胞组成了曲细精管的生精上皮，而间质细胞存在于曲细精管之间。支持细胞是一种高柱状细胞，各级生精细胞镶嵌在上面。过去人们认为支持细胞的主要作用是为生精细胞提供支持和营养，所以把它称为支持细胞。实际上支持细胞有多种功能。从支持细胞的底部到顶部，精子细胞成熟程度越来越高。分布在底部的是精原细胞，往上依次是初级、次级精母细胞和精子细胞。一个精原细胞经过多次有丝分裂和两次成熟分裂（减数分裂），可以形成256个仅有半数染色体的精子细胞，其中50％含Ｘ染色体，另50％含Ｙ染色体。精原细胞和精母细胞外形是圆形的，没有尾巴，到了精子细胞才逐渐出现尾巴。精子细胞经过一系列变化，最后成熟，形成如蝌蚪样的精子，排放进曲细精管内。精子在曲细精管内成熟时间大约为64-72天。另外，在附睾内还要停留19-25天左右才能进一步成熟，这时精子才具有活动性和受精能力。所以，精子整个成熟过程大约需要90天的时间。精子的结构头部：顶体、细胞核尾部：颈、中段、主段和末端。顶体内部含有水解酶，能协助精子穿入卵周围的卵膜。鞭毛为9＋2微管结构精子质膜外表面存在有多种凝集素受体——特异决定簇（糖蛋白或结合糖的蛋白）。精子膜上的特异决定簇一旦与卵细胞透明带上的表面精子受体相识别，将会激发顶体反应等一系列连锁过程，顶体内含有的多种蛋白水解酶和磷酸脂酶将被释放出来，溶解卵放射冠及透明带，精子才能穿入卵细胞与其融合，完成受精最终完成受精。2.2卵子的发生一个卵巢包含三个世代的卵母细胞，每年当一个世代的卵母细胞成熟后，就被新的世代所取代。在哺乳类，所有卵原细胞成熟后和卵原细胞转变为卵母细胞是在胎儿分娩前完成。卵母细胞形成阶段是从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵为止。直到青春期卵母细胞才进行生长，以后每个性周期后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中未成熟就退化。卵母细胞的成熟过程受MPF(成熟促进因子）和CSF（细胞生长抑制因子）的相互调节。卵子的结构卵细胞内部物种空间结构排列具有极性，卵内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成动物级和植物级。卵细胞分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为皮层，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有皮层颗粒和色素颗粒。卵细胞排出卵巢后，有卵膜包被。2、受精作用成熟精子的获能精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能，才具有使卵受精的能力。精子获能是指精子在雌性生殖道内获能获得穿透卵子透明带能力的生理过程,是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。精子获能生理过程：在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋白，称为去获能因子，精液中的精子表面被覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生一系列变化。精子的获能过程是一个多时相的过程：先在子宫内，后在输卵管内。随着精子的获能，氧耗量增加，精子运动加速，并迅速游向卵子，最终使精卵结合。精子获能的生育意义在于:①去除精子表面的覆盖物（精浆蛋白），暴露出精子膜表面与卵子相识别的位点。②增加精子活力，改变膜的通透性。③精子头部出现流动性不相等的区域，为精子膜与顶体膜融合做好准备。④精子顶体后区膜的流动性加大，以准备与卵膜结合。卵子的成熟P99精子的行进在正常生殖过程中，精子在阴道和子宫内的运动速度很快，十几分钟即达到输卵管，积聚在输卵管峡部下2-3cm处，在此停留十几到几十个小时，然后继续上行，只有少数精子可以达到输卵管壶峡连接部，在此与刚排出的卵相遇，完成受精过程。顶体反应(acrosomereaction)：精子在同卵子表面接触或与卵膜分泌的物质相遇后，精子的顶体就会发生一系列的变化。包括顶体内小泡形成及顶体内酶的的激活和释放的过程，它是精子穿过透明带的前提。顶体反应顶体反应的生理过程：精子顶体帽部分的质膜和顶体外膜（精子获能）在多处发生融合，因此在该部出现很多裂口，使得顶体内部的物质释放出来，包括各种水解酶（如顶体蛋白酶、透明质酸酶、酸性磷酸酶等），从而使它们在受精中起作用。顶体反应酶包括：透明质酸酶，帮助精子通过卵丘细胞层；放射冠透过酶，分解卵子周围的放射冠；顶体蛋白酶，使精子穿过透明带。此外还有磷酸酯酶A和磷酸酯酶C参与反应。顶体——一种钻头卵子的激活精子一旦与卵子接触，卵子本身就开始发生一系列深刻的变化，即卵子的激活。卵子激活时，皮层颗粒首先于接触点发生破裂，然后波及整个卵子的皮层，发生皮层反应。皮层反应：皮层颗粒内含物被排出，一部分与卵外的卵黄膜一起形成受精膜，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜间的卵周隙中，吸收水分，使受精膜逐渐与卵子分开而举起。另外，皮层颗粒排放出的粘多糖形成一种粘性的透明膜物质，与卵表面紧密相粘，作用是保持随后的分裂球聚集在一起。精卵融合融合过程：A顶体反应后，精子穿过透明带进入卵周隙B以赤道段与卵质膜相融合，融合部分向后扩展到顶体后区。C精核膜消失、融合、核开始去致密。D精子头部完全入卵，卵的皮层包裹了精子整个顶体部。多精受精的阻止1）皮层反应产生受精膜可以阻断另外的精子与透明带和卵子质膜的结合，有效避免了多精受精。2）透明带反应：在皮层反应后，由于皮层颗粒内物质释放到透明带表面，透明带的结构发生变化，破坏了精子受体，其它精子不能再与透明带结合，保证了正常的单精受精。原核变化及融合精子进入卵内后，精子核膨大，核膜由于泡状化而破裂，并分散在卵细胞质中，其中的染色质也由致密状态开始松散而成为颗粒或细丝状，逐渐形成雄原核。雄原核：雌原核：卵子细胞核在完成两次减数分裂后，染色体首先分散，沿着分散的染色体的边缘汇集了一些小囊，逐渐融合形成一双层包膜，从而形成了一些内含染色体的小囊，即染色体泡。然后，它们相互接近，包膜彼此合并成为一个不规则的雌原核。核融合：雌、雄原核移向卵的中央，相遇，核膜消失，染色体彼此混杂在一起，从而使配子的单倍体恢复成为合子的双倍体。受精完成。卵裂3、胚胎的发育精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。早期胚胎发育卵裂：合子发生分裂形成无数小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名。(哺乳动物的受精卵在受精后72小时已分裂为12-16个细胞，形似桑葚）囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层胚泡：桑椹胚继续分裂，出现小的腔隙，逐渐融合为一个大腔，腔内充满液体。此时透明带开始溶解，胚呈现为囊泡状，故称为胚泡。由滋养层和内细胞群构成。滋养层细胞哺乳动物胚泡及着床内细胞团（ICM)：在胚泡胚极一端，能够发育成为胚胎主体的一团细胞。滋养层细胞：外层发育成为胎盘的细胞。着床：胚泡和子宫壁相互接触并侵入子宫组织的过程。胚胎发育原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。胚胎发育精子卵子卵子经过大约15厘米长的、狭窄的输卵管向子宫游动，它周围的营养细胞像一串串美丽的光环围绕着它。很快，它将与精子相遇并开始受精的过程。受孕过程穿过放射冠穿过透明带透明带为哺乳动物胚胎所特有的结构，本质是一种非细胞结构的糖蛋白。胚胎切割时发现处于发育阶段越早的胚胎对透明带的依赖性越强。形成受精卵受精卵(第1天)细胞期1二核融合开始分裂(卵裂)1二核融合开始分裂(卵裂)2细胞期2桑椹胚胚泡(第4天)孕4、5、6周孕7、9周孕16、26、28周精子穿卵受精卵6周胚胎11周胚胎12周胚胎4月胚胎配子操作人工精液采取的方法？人工精子获能方法？人工采卵方法？超数排卵？体外受精获取成熟卵母细胞的方法？配子操作精子卵母细胞体外受精精子精液的采取方法通常有：人工阴道法、电刺激法、阴道内回收法等。对于个体较大的动物多采用人工阴道法。而对于小动物而言多采用电刺激法采精。人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（38℃－40℃），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作。另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。精液的保存精液的保存可以分为常温（15-25℃）、低温（0-5℃）和超低温冷冻（-79℃—-196℃）三种。其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力。保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等：稀释剂包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，营养剂包括糖类、奶类和卵黄等，保护剂包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、DMSO、糖类等。人工精子获能方法1.可以利用自然交配法：在交配后，由雌性生殖道回收精子。雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。2.可以利用人工诱导的方法使得精子获能：Bracktt和Oliphant(1975)在特定培养液(Bracktt-Oliphant，BO液）中加高浓度的NaCl处理家兔精子15min体外受精后获得试管兔。以相同的方法处理牛精子获得试管牛（Bracktt等，1982）。其他有高离于强度处理法、高pH处理法、IA(钙离子载体）处理法、肝素处理法、咖啡因处理法以及添加牛卵泡液、猪卵泡液、子宫液、输卵管液等。卵母细胞人工采卵是得到卵母细胞的方法，通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。超数排卵利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）。可以利用促性腺激素或黄体激素，对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵。以小鼠为例，通常可用3－5IUPMSG或2－3IUhCG或100μgFSH或100μgLH或0.02－0.05μgLH－RH皮下或腹腔内注射，12-14小时可以有70％-100％正常排卵。采卵1．输卵管内采卵：小动物、体外。以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。２．活体输卵管采卵：适于稍大一些的动物。例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗液；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。采卵3.对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中取卵。4.对人而言在超数排卵步骤处理后，用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针取卵。用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵