阿维菌素选择性抑制剂的研究

阿维菌素选择性抑制剂的研究河北化工医药职业技术学院毕业生论文第14页共14页第13页共14页1绪论1.1阿维菌素1.1.1阿维菌素的概述阿维菌素(Avermeetins，AVM)，是1976年美国Merek公司的研究者从一株来源于日本的阿维菌素链霉菌的发酵液中发现的一簇结构相似的化合物。经结构鉴定该化合物为16元环大环内酯类抗生素，是C5，C22-C23和C25三个位上结构不同的8种同系物，具体结构见图1和表1所示[1]。图1阿维菌素的分子结构图1阿维菌素的分子结构表1阿维菌素的各个组分的不同基团从图1和表1中可知:在C5位上是甲氧基则称为A组分，如果是轻基则称为B组分;在C22与C23之间以双键连接则称为A1，或B1，以单键连接并在C23位含有一个轻基则称为A2或B2;在C25上连接的是叔丁基时则分为Ala，A2a，Bla和B2a。，是异丙基时则分为Alb，A2b，B1b和B2b。在通常情况下，菌株的发酵产物中A1a，A2a，Bla和B2a组分之和的比例在80%以上，而A1b，A2b，B1b和B2b组分之和的比例在20%以下。该簇化合物被统称为阿维菌素，或称阿弗菌素或埃维菌素。1.1.2阿维菌素的有关理化性质性状:白色或黄色粉末;无味。溶解性:在乙酸乙醋、丙酮、氯仿中易溶;在甲醇、乙醇中略溶;在正己烷、石油醚中微溶;在水中几乎不溶。熔点:157-162紫外吸收:在243-247nm和236-240nm的波长处有最大吸收。化学稳定性:阿维菌素对酸和碱都较敏感，其化学稳定性情况如图2所示。阿维菌素B1组分因光照或暴露在空气中均容易被降解。图2阿维菌素的化学稳定性图2阿维菌素的化学稳定性1.2.3阿维菌素生产中解决杂菌污染的重要性阿维菌素发酵要求纯种培养，不仅斜面、种子、培养基以及发酵罐、管道等须经严格消毒除去各种杂菌，而且通入的空气也需经过无菌处理；并需保持机械搅拌系统、发酵废气排放系统、补料和取样系统的无菌操作。只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。发酵染菌能给生产带来严重危害，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产，解决杂菌污染是阿维菌素发酵工厂的一项重要工作内容。1.2抑菌剂抑菌剂就是能抑制细菌生长的物质。抑菌剂可能无法杀死细菌，但它可以抑制细菌的生长，阻止细菌滋生过多、危害健康。所有的精油，或多或少都有抑制细菌生长的能力。有些精油只抑制某些特殊病菌的生长，而有些精油，抑制病菌的种类很多。同时，重要非常少量的精油，就可以产生很好的抑菌效果，如丁香、薰衣草、迷迭香、鼠尾草和百里香等精油，抑菌的效果都很好。1.2.1抑菌剂种类新型杀菌消毒剂森可洛日本坷柯阿公司于1998年开发了一种粉状的含氯杀菌消毒剂，称森可洛。每10L自来水溶入3g森可洛，该杀菌液可在5秒内将0-157杀灭。水中残氯量约80mg/kg，水的pH=5左右，氧化还原电位(ORP)在+500mV以上[2]。是一种具有强杀菌能力的弱酸性电解质水。除0-乳铁蛋白肤乳铁蛋白(Lactofe币n;LF)是存在于母乳、牛乳等中的一种多功能因子，可由干酪乳清或脱脂乳经分离提纯而得。具有抗菌、提高免疫能力、抑制肿瘤、调节无机盐吸收等作用。乳铁蛋白经胃蛋白酶等酸性蛋白酶酶解后，可获得乳铁蛋白肤(Lactofe州ncin;LFein)，其抑菌能力(包括O-157)比乳铁蛋白高400倍，分子量约3100，是由25或26个氨基酸残基所组成的碱性多肤。乳铁蛋白肤对O-157的最低抑制浓度为8-10ug/mL，用10ug/mL浓度的乳铁蛋白肤水溶液对平板计数为106/mL的O-157处理，经3小时后全部消灭。从透过型电子显微境观察，经乳铁蛋白肤处理过的细胞形态无论是细胞膜或细胞质均有被消化的作用。因此，其用于各种乳及乳制品之类，可预防致命O-157作祟。最近(2000年6月)日本又暴发出儿童饮用日本雪印乳业公司所生产的脱脂乳后，因受到金黄色葡萄球菌所产生的A型肠毒素的危害而导致大量食物中毒，中毒人数已达1.4万人。使日本全国8500家食品超市停售该公司乳制品，公司被迫于7月宣布所属21家工厂停业整顿。可见其危害之广。乳铁蛋白肤对金黄色葡萄球菌也有很好的抑菌作用，其最低有效浓度为3ug/mL(或mg/L)。乙醇制剂乙醇具有强烈的杀菌作用是早己知道的事实，日本自八十年开始即已广泛在鱼糜和肉糜类制品的真空斩拌过程中使用，此外作为食品加工机械和设备表面消毒的需用量也不少。日本自1996年0-157等食物中毒事件暴发后，作为对策之一，食品用乙醇消毒制剂耗用量大幅度上升，1996年比1995年猛增24.5%，1997年增长7.2%。增加乙醇用量可提高抑菌效果，但会有乙醇臭。按日本消防法，若浓度大于60%，对保存场所和保存量等均有很大制约，因此一般所用的乙醇浓度均不超过60%。但低浓度有挥发度低，与食品的接触时间长、食品表面干燥缓慢、易使设备生锈等缺点。因此作为商品的乙醇消毒杀菌剂，也常与其他抑菌剂配合使用以减少用量。如菜肴(半成品菜和熟菜)用的一般与中碳链脂肪酸甘油醋或聚赖氨酸合ASAP抑菌剂近年来，随着消费者对妇科消毒产品品质要求的不断提高，各级卫生行政部门逐渐加强对妇科洗液的抽检监督。然而，抽检结果往往不尽人意。各种不合格产品的曝光报道，屡见报端。行业的声誉也屡受影响，对当事企业而言，更是左右命运、关乎前途。A．SAP属全球首创天然有机抗菌除臭剂，以大豆萃取液为主成份[3]。它正广泛应用于妇科洗液、卫生巾、湿巾、漱口水、净水、生食蔬菜消毒液、洗手液、环境消毒等各领域。藉由其安全、高效、性价比高等特点，正广受关注，逐步取代醋酸洗必泰等传统抗菌剂，在国际同类产品中属于领先水平。新型抑菌剂Tallofin(太乐芬)工业循环水系统在水质处理过程中有机物与无机物的浓度逐渐升高,绝大部分有机物是可生物降解的,是微生物的营养源。适宜的生存环境和充足的营养物使得微生物在循环水系统大量繁殖,形成生物粘泥。生物粘泥会给系统运行造成许多障碍。传统上用于工业循环水系统中的杀菌剂,其作用机理是通过直接破坏微生物生命过程和细胞核物质来控制微生物的繁殖。这些杀菌剂在杀死细菌的同时对人体及环境也容易造成极大的危害。而Tallofin(太乐芬)通过与微生物之间的分散、包覆、剥离多重物理作用达到控制细菌的目的,并且对人体及环境不会造成危害[4]。因此,我们在第三循环水场进行了现场应用试验,通过对水质指标的跟踪分析,确定该药剂的使用效果及最佳投加方法。ECL-1501高效抑菌剂高效抑菌剂是一种含有广谱杀菌剂的液态产品，适用于食品厂、啤酒厂巴氏线、巴氏杀菌及中水的微生物控制[5]。当用于整个水处理程序时，ECL-1051高效抑菌剂既可用作系统运作过程中的动态杀菌和抑菌处理，又可用作系统关闭过程中的静态杀菌和抑菌处理。eq\o\ac(○,1)安全，在使用效抑制各种容器中的微生物，可防止粘状污垢的形成。eq\o\ac(○,2)使用简便，可作为动态杀菌。它也适合静态杀菌。eq\o\ac(○,3)产品优点相容性好，与其他清洗剂等相容。eq\o\ac(○,4)降低杀菌剂清洗难度，节约大量人工。eq\o\ac(○,5)高效长效，能有降低水耗。eq\o\ac(○,6)减少杀菌剂换水频次，浓度下对各种材料的容器，工具等无腐蚀性。1.3抑菌剂现状1.3.1防腐抑菌剂现状随着近代盒饭、半成品菜和熟菜的大量增加，传统的干制、盐渍、糖渍类产品大幅下降，而低糖、低盐、高水分柔软食品的大量开发，使防腐保鲜向较短时间(如3-7日而不是半年左右)方向发展，要求用量低，不影响原有风味，使用方便，不要求灭菌，只要求抑制微生物的活性静菌，使之不能繁殖而导致变质。这种趋势在日本尤为明显，日本在超市、大卖场中冷藏出售的半成品菜、熟菜(非速冻蔬菜)、湿熟面条、拌凉皮等即食制品，1988年为24，563亿日元，至1995年上升至39，559亿日元。如包括大型的小卖店等在内，1995年估计达到45，544亿日元。已在食品加工业中占有重要地位。在日本，凡进人超市、大卖场等大型商场的食品(包括半成品菜、熟菜等)，其杂菌数不得过106个/100g[6]1.3.2农杆菌介导的植物转基因研究中抑菌剂的应用现状自1983年第－个转基因植物问世以来，植物转基因研究发展迅速，转基因作物已成为普及应用速度最快的农作物改良手段。迄今为止，全世界已获得转基因植物近200种，其中大部分为农杆菌转化成功的的植物。在农杆菌介导转化中，植物外植体与农杆菌共培养后需要使用抑菌剂脱菌，以抑制农杆菌的进一步生长，目前较常使用的抑菌剂是头抱菌素类和青霉素类抗生素[7]。但不同植物或同一种植物不同品种间甚至基因型间对抗生素的敏感性或毒害忍受程度也存在着较大差异。有些植物材料对头抱菌素类和青霉素类极其敏感，既使低微浓度即会对外植体产生毒害作用，因此大环内醋类抗生素的作用也是不容忽视的。总之，在进行农杆菌介导植物转基因之前，对受体材料进行抗生素敏感性测定是十分必要的。研究确定适用抗生素种类及其浓度，以保证抑菌剂既能有效地清除农杆菌或抑制农杆菌的生长，又能使转化细胞不受或少受影响，从而获得较高的转化效率。随着抗生素研究与应用的不断发展，新型抗生素不断问世，相信研究者们能发现更适用于农杆菌介导的植物转基因研究的抑菌剂类型。

2实验材料和实验方法2.1研究目的由于操做过程中染菌现象不可避免，因此我们加入抑制剂，该抑制剂要求对生产菌株无抑制作用，但抑制杂菌的生长和繁殖。阿维菌素发酵过程中的杂菌主要为细菌，其分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，而生产阿维菌素的菌株为放线菌。因此实验中我们选取其特征菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌与放线菌形为实验菌种，并做平行实验，进行比较、观察，从而得出结论。以在生产发酵过程中得到应用，抑制杂菌。2.2实验材料2.2.1菌种大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；放线菌2.2.2培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏：5g/L；蛋白胨：10g/L；氯化钠：5g/L；琼脂：2%；蒸馏水；pH7.0-7.2高氏一号培养基：可溶性淀粉：20g/L；KNO3：1g/L；K2HPO4：0.5g/LMgSO4·7H2O：0.5g/L,NaCl：0.5g/L;FeSO4·7H2O:0.01g/L琼脂:2%；蒸馏水;pH7.2～抑菌剂A3;A82.2.4实验器材：三角瓶，量筒(1000ml，100ml)，烧杯(1L)，移液枪（包含枪头），EP管，无菌水，蒸馏水，棕色瓶，试管（3支10ml蒸馏水，6支9.9ml蒸馏水），容量瓶(50ml)，玻璃棒，棉塞，报纸，镊子，超净台，酒精灯，接种针，涂布器，培养皿，锥形瓶（一个瓶装200ml培养基）2.3实验方法2.3.1培养基配制依据培养及配方配制即可。2.3.2灭菌把包好的仪器、培养基等放入灭菌锅内进行灭菌。温度：121℃2.3.3抑制剂的配制（此操作在无菌台上进行）A9浓溶液的配制A9：取A8药品0.5g,放在小烧杯中用无菌水溶解，搅拌待完全溶解后，用50ml的小容量瓶定容到50ml。配制好以后放在棕色小瓶中待用。用移液枪取0.2ml上述试剂,在用无菌水定容到A8浓溶液的配制浓度6.4mg/ml配制方法取A8药品0.32g,放在小烧杯中用无菌水溶解，搅拌待完全溶解后，用50ml的小容量瓶定容到50ml。配制好以后放在棕色小瓶中待用。配置后浓度为64ppm。2.3.4倒平板在已经经过15min灭菌的超净台上，把热的培养基按要求在酒精火焰的保护下倒入灭好菌的平皿中，至凝固。2.3.5菌悬液制备将接种针在酒精火焰上灼烧，稍凉片刻。用针在单菌落上取一环金黄色葡萄球菌，接种到装有10ml无菌水的试管中，震荡、摇匀。用移液枪取0.1ml菌悬液置装有9.9ml无菌水的试管中，震荡、摇匀，得到浓度为10-2的菌悬液。继续用移液枪从浓度为10-2的菌悬液中取0.1ml菌悬液置装有9.9ml无菌水的试管中，震荡、摇匀，得到浓度为10-4的菌悬液。同样的方法得到浓度为10-4的大肠杆菌和浓度为100的放线菌的菌悬液。2.3.6抑菌剂的添加用移液枪取0.1ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为20ppm的菌液;用移液枪取0.3ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为10ppm的菌液;用移液枪取0.7ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液放入EP管中，加入0.1ml抑制剂，得到抑制剂浓度为,5ppm的菌液。盖好EP管盖，等待十分钟。同理对浓度为10-4的大肠杆菌添加抑制剂；浓度为100的放线菌添加抑制剂。2.3.7涂布用移液枪取0.1ml浓度为10-4的金黄色葡萄球菌的菌液滴入装有牛肉膏蛋白胨培养基的平皿中进行涂布。用移液枪取0.1ml已经加入抑制剂十分钟的菌液进行涂布，并依次标号菌种名称、时间、制作人、所加抑制剂浓度。同理将大肠杆菌的原液和加入抑制剂的菌液涂布到牛肉膏蛋白胨培养基的平皿中；将放线菌的原液和加入抑制剂的菌液涂布到高氏1号培养基的平皿中。2.3.8菌种的培养将涂布好的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌放入温度为37℃的培养箱中培养1-2天，放线菌放入温度为282.3.9观察记录对培养好的平板中的菌落进行计数。

3实验结果及分析3.1试验结果3.1.1A8抑制剂的实验结果表2A8抑制剂的实验记录金黄色葡萄球菌大肠杆菌放线菌-2-4加-2加-4-2-4加-2加-4-2-4加-2加-411.22156125452357448711178360280683411.2392572412312219896710889201611.251118732221801359949600以上500左右1208911.2865432315160123895699891193.1.2A9抑制剂的实验结果表3A9抑制剂的实验记录金黄色葡萄球菌大肠杆菌放线菌20105不20105不20105不12.28271891507712112914089121512.5366571791011501402333338414512.7456764681101211321627684859812.92435253613014216518910110310911512.1351617811121737345058089929010212.15272938641291952402601072172212353.2实验分析3.2.1实验结论由以上数据分析，A8对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制效果不错，但是其对放线菌的抑制效果也很明显，而我们所需要的是在阿维菌素生产中，即在放线菌发酵的过程中使用的抑菌剂，所以A8可以排除。A9的效果不是很明显，在浓度为20ppm时，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌可以抑制一半，但是同浓度下对放线菌亦有些微抑制的效果，故不建议应用A9。3.2.2实验小结此次实验让我学到了很多东西，对于阿维菌素的生产情况有了更深层次的了解，也了解到其染菌现象的严重性，也明白了解决其染菌现象的迫切性。所以在我认真的对待每一次实验，认真分析实验结果，希望早日选择出合适的抑菌剂，A9虽说对放线菌的抑制效果不明显，但是其对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑制效果也不是非常好，我建议选择效果更好的抑菌剂，在前几次试验中，我们发现菌落个数很多，并且非常小而密，不易数清楚，且效果不明显，所以我们调节了取菌的量及菌液的浓度，最终调节出适合的浓度。4结论导致阿维菌素发酵染菌的原因很多，主要有种子带菌、空气带菌、灭菌不透、操作不当等方面。染菌对于阿维菌素发酵生产十分不利，轻则影响产量和质量，重则倒罐，甚至停产，造成巨大损失。因此，防止染菌对于阿维菌素发酵具有重大意义。本实验的结果A8都对工业生产的意义不大，A9的效果虽有但是并不明显，但我们可以从这方面考虑并进行改良。随着发酵工业的不断深入发展，预期、防止发酵染菌将会扩大至更广的范畴，可望把阿维菌素发酵染菌造成的损失降到最小。

参考文献[1]彭柏林.阿维菌素菌种生产工艺的研究(硕士论文)[D].沈阳:沈阳药科大学微生物药学系,2001.[2]凌关庭.防腐抑菌剂的进展[J].粮食与油脂，2000[3]\o"查看此用户资料"ASAP12345.抑菌剂./view/2468070.htm.2011.12.22.[4]吴雪洁,孟云平.新型抑菌剂Tallofin（太乐芬）在循环水系统的应用[J].工业水处理,2010.12[5]吕长征.高效抑菌剂./classificationmodule/biz/index_view.do?id=3656807.2011.12.22 [6]凌关庭.防腐抑菌剂的进展[J].粮食与油脂，2000[7]代容春.农杆菌介导的植物转基因研究中抑菌剂的应用现状[M].福建:福建师范大学生命科学学院.2009.05[8]吴剑波.微生物制药[M].北京:化学工业出版社,2002:142-143.

致谢本文是在孙祎敏老师对我大力帮助下完成的。她渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪同时为我提供了大量的实验材料。在此次毕业设计过程中我也学到了许多关于材料方面的知识，实验技能有了很大的提高，对研究性实验的过程安排有了清楚的了解。学会了独立安排实验，独立思考问题，认真分析问题，仔细讨论问题。而且对一些平常接触不多的仪器有了更深的认识，可以进行熟练的操作。对一些已经掌握的技能进行了提升，比如对于大肠杆菌等3种菌取菌的多少有了初步的掌握。而且也很感谢在实验过程中其他的辅导老师，在我遇到瓶颈时，循循善诱的引导我的思路，让我有了更深的提高。让我依依不舍的还有各位学友、同门和室友。在我需要帮助的时候，伸出温暖的双手，鼎立襄助。能和相遇、相交、相知是人生的一大幸事。最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢。TOC\o"1-3"\u1绪论 11.1阿维菌素 11.1.1阿维菌素的概述 11.1.2阿维菌素的有关理化性质 21.2.3阿维菌素生产中解决杂菌污染的重要性 21.2抑菌剂 21.2.1抑菌剂种类 31.3抑菌剂现状 41.3.1防腐抑菌剂现状 41.3.2农杆菌介导的植物转基因研究中抑菌剂的应用现状 52实验材料和实验方法 62.1研究目的 62.2实验材料 62.2.1菌种 62.2.2培养基