紫外吸收法测定蛋白质DNA浓度用户指导书(Final)

紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度用户指导书北京普析通用仪器有限责任公司应用技术部2004年7月

目录TOC\h\z\t"样式1,1,样式2,2"前言： 图所示。图2DNA蛋白质参数设置WL（A1，A2）：表示DNA蛋白质的两个测定波长。Df（A1，A2）：表示DNA的两个系数。Pf（A1，A2）：表示蛋白质的两个系数。如果您要进行320nm的背景校正，点击【320nm背景校正】选择框，然后输入相应的校正系数即可。DNA蛋白质的计算方法如下：不进行320nm校正DNA浓度＝Df1×A1－Df2×A2蛋白质浓度＝Pf2×A2－Pf1×A1进行320nm校正（A1＝A1－A320，A2＝A2－A320）DNA浓度＝Df1×A1－Df2×A2蛋白质浓度＝Pf2×A2－Pf1×A1另外，在控制台按钮中，还有一个名为【仪器】的按钮，点击此按钮即可打开仪器参数设置窗口，如光谱带宽等。4.3．处理测量结果DNA蛋白质的测量是非常简单的，您只需要将样品放入样品池，然后点击控制台上的【测量】按钮即可完成测量。如果您要对测量结果进行打印输出，点击控制台上的【打印】按钮。如果您要导出测量结果，点击【导出】按钮。5．影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的最大特点就是操作简单、测量迅速，而且不需要引入试剂；但是它也面临着很多问题，诸如测量准确性的问题。本节将讨论影响测定的一些主要因素。（1）蛋白质的不同对测定结果的影响。由于蛋白质是生物大分子，而紫外吸收往往是其分子内的小基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。因此当蛋白质不同，其包含的上述小基团含量发生变化时，就会影响蛋白质含量的测定。然而蛋白质种类繁多，结构复杂，很难对其进行有效的归类。例如人体内含蛋白质的种类约有10万种，整个生物界的蛋白质种类估计有100亿种。建议：测量过程中如果条件允许，应尽量使用相近的蛋白质做标准曲线，修正测量参数，以便得到更为准确的数值。（2）溶液中干扰物质的影响。由于蛋白质所包括的具有紫外吸收的小基团为常见基团，其产生紫外吸收的特异性并不强，很多具有类似结构的有机溶剂都会有类似的紫外吸收，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类，这些混入蛋白质溶液都会对测量产生干扰。另外，一些高浓度的无机化合物也会对蛋白质的含量测定产生干扰，例如NaOH、NaCI等等。建议：测量时应尽量排除干扰物质，同时选择合适的参比溶液。（3）溶剂吸收的影响。如果以一些在紫外区有吸收的物质做溶剂（例如醇、酮类），会对测量结果产生很大的影响。建议：测量时尽量不要使用此类溶剂，或者在测量时选择合适的参比。（4）PH对测定的影响。PH变化时对蛋白质含量测定的影响非常大，例如：下图为Tyr的吸收谱线与PH的关系。由图可以发现，PH=6和PH=13时，光吸收度已经有了非常大的差异。maxmaxatpH6:274nmmaxatpH13:295nm建议：测定样品时不要使溶液处于过酸或者过碱的状态，同时样品的PH值要与标准品的PH值尽量保持一致。（5）环境极性、蛋白质构象、蛋白质折叠与变性都会对蛋白含量的测定产生影响。6．测定蛋白质/DNA浓度的其他应用方法简介紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的方法虽然因其操作简单、快速的特点已经被广泛应用，但是因其准确度较差，测量过程中干扰物质较多，不能满足用户精确测量的需求。本节将介绍一些使用化学试剂来测定蛋白质/DNA浓度的应用方法。（1）考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白质浓度这是目前最常用的使用化学试剂测量蛋白质浓度的方法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，溶液的颜色由棕黑色变为兰色，同时使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。目前普遍认为，G-250染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合而变色。因此，在595nm下测定溶液的吸光度值A595，该吸光度值与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：①灵敏度高。本方法灵敏度可达1ug/mL。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有非常高的消光系数。②测定快速、简便。本方法只需加一种试剂考马斯亮蓝G-250，而且染料与蛋白质结合非常快，大约只要2分钟即可完成，其颜色又可以在1小时内保持稳定，其中在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。测量时，将染料与样品混合摇匀，测定其A595值即可，完成一个样品的测定，只需要1分钟左右。③干扰物质相对较少。主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH等。值得注意的是，该法也有一些缺陷：①由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，该法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，因此，在制作标准曲线时通常选用g-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。②标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（2）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法测定蛋白质浓度这是一种经典方法。蛋白质样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨；经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之含氮量。该方法灵敏度较低（0.2－1mg/mL），操作复杂，比较费时（约8－10小时），不过干扰物质非常少。该方法目前已经很少使用。（3）双缩脲法（Biuret法）测定蛋白质浓度双缩脲（NH2-CO-NH-CO-NH2）是两个分子脲（NH2-CO-NH2）经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。蛋白质可以和CuSO4发生双缩脲反应，形成的紫色络合物的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。此法的优点是较快速，干扰物质少（主要干扰物质有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等），不受蛋白质差异的影响；主要的缺点是灵敏度差（1~10mg/mL）。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（4）Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度Folin-酚试剂法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin-酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因都是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。

该法的优点是灵敏度高（5ug/mL），比双缩脲法灵敏得多，缺点是时间较长（大约2小时），要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，也会干扰Lowry反应，而且对后者的影响还要大得多。例如酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠-氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。依干扰物质的不同，本方法常作为考马斯亮蓝法的备选方法，交替使用。（5）BCA（Bicinchonincacid）法测定蛋白质浓度BCA法与Lowry法相似，主要差別在碱性溶液中，蛋白质使铜离子由二价转变成一价后，进一步的以BCA取代Folin-酚与一价铜离子结合产生很深的紫色，在波长562nm有很强的吸光度，该吸光度值与蛋白质浓度成正比。本法的优点在于碱性溶液中BCA比Folin-酚稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。本法的灵敏度与Lowry法相似，以微量分析（microassay）灵敏度可测至约0.5-10mg/ml。本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂、盐酸胍和尿素较具容忍度，不易受干扰，但也会受原糖以及EDTA的干扰。BCA法和Folin-酚法一样，通常作为考马斯亮蓝法的备选方法，交替使用。（6）琼脂糖凝胶电泳法测定DNA浓度从生物体中提取的总DNA浓度一般是通过紫外吸收法（A260法）来测定，当需要测定某些特定DNA浓度时，通常先进行琼脂糖凝胶电泳分离DNA，然后用溴化乙锭进行染色（溴化乙锭能够插入到DNA的双链上，而且在紫外灯的照射下又会产生荧光），再用凝胶成像系统进行分析，最后可以得出各个特定DNA的浓度。