我所认识的拉曼光谱

我和拉曼的那些不得不说的事——披着羊皮的杨帆一、拉曼光谱(Ramanspectra)的历史过程：拉曼光谱得名于印度物理学家拉曼(Raman)。1928年，拉曼首先从实验观察到单色的入射光投射到物质中后产生的散射，通过对散射光进行光谱分析，首先发现散射光除了含有与入射光相同频率的光外，还包含有与入射光频率不同的光。以后，人们将这种散射光与入射光频率不同的现象称为拉曼散射。拉曼因此获得诺贝尔奖。当一束入射光通过样品时，在各个方向上都发生散射。拉曼光谱仪收集和检测与入射光成直角的散射光。由于收集和检测的散射光强度非常低，因此拉曼光谱的应用和发展受到很大限制。30年代拉曼光谱曾是研究分子结构的主要手段，此时的拉曼光谱仪是以汞弧灯为光源，物质产生的拉曼散射谱线极其微弱，因此应用受到限制。上世纪60年代，激光的问世为拉曼光谱仪的发展带来了蓬勃生机。早期作为光源使用的汞弧灯，被高功率、高能量、高单色性和高相干性的激光光源所代替。另外，高分辨率、低杂散光的双联和三联光栅单色仪，高灵敏度光电接收系统(光电倍增管和光子计数器)也在此期间研制成功，并实现了计算机和拉曼光谱仪的联机。70年代中期，不断提高的激光技术使得拉曼光谱技术的发展和应用更为广泛。

对在很大光谱范围内吸收的样品，激光器的多谱线输出和可调谐激光器的连续谱线输出，可以使人们很方便地选择合适的激发光进行共振拉曼光谱测量。用于样品的微区分析、不均匀表面检测等的空间分辨拉曼光谱技术(激光拉曼探针)也于同期诞生，到90年代末，高空间分辨拉曼光谱技术已经可以做到单分子检测。多通道测量和短脉冲激光技术配合，则实现了时间分辨拉曼光谱测试。这种光谱技术可用于短寿命自由基、化学反应的中间态、物质和系统的瞬间过程等方面的研究。1983年，Jennings等人成功地进行了傅里叶变换拉曼实验。此后，各型号的傅里叶变换拉曼光谱仪也先后问世。1986年，Hirschfeld和Chase在技术上实现了FT-拉曼光谱。1987年PE公司推出了第一台近红外激发傅里叶变换拉曼光谱仪。首部Fr-Raman专著于1991年正式出版。90年代初，为满足社会生产活动的需要，人们不断探索出多项新技术并应用于拉曼光谱仪中。例如：引进光纤对远距离或危险处的样品进行测量，用声光调制器(AOTF)代替光栅作为分光元件测量拉曼光谱；利用全息带阻滤光片滤除瑞利散射的干扰等。激光拉曼光谱仪的性能也日臻完善，如：美国Spex公司和英国Reinshow公司相继推出了拉曼探针共焦激光拉曼光谱仪，低功率的激光光源的使用使激光器的使用寿命大大延长，共焦显微拉曼的引入实现了类似生物切片的激光拉曼扫描，从而得到样品在不同深度时的拉曼光谱。Dilor公司推出了多测点在线工业用拉曼系统，采用的光纤可达200m，从而使拉曼光谱的应用范围更加广阔。拉曼光谱仪以激光（excitation）作光源，光的单色性和强度都大大提高，拉曼散射仪的信号强度因而提高，拉曼光谱技术得以迅速发展，应用领域遍及物理，材料，化学，生物等学科，并已成为光谱学的一个分支——拉曼光谱学(RamanSpectroscopy光谱学)。二、拉曼光谱的原理：光照射到物质上发生弹性散射和非弹性散射.弹性散射的散射光是与激发光波长相同的成分,非弹性散射的散射光有比激发光波长或长和或短的成分,统称为拉曼效应。拉曼效应是光子与光学支声子相互作用的结果。拉曼光谱原理：拉曼效应起源于分子振动(和点阵振动)与转动，因此从拉曼光谱中可以得到分子振动能级(点阵振动能级)与转动能级结构的知识。用虚的上能级概念可以说明了拉曼效应:拉曼光谱为散射光谱，1928年，C.V.拉曼实验发现，当光透过透明介质被分子散射的光发生频率变化，这一现象被称为拉曼散射。在透明介质的散射光谱中，频率与入射光频率v0相同（及波长λ不变）的成分称为瑞利散射(Rayleighscattering)弹性碰撞，无能量交换，仅改变方向；频率对称分布在v0两侧，即v0±v1（波长λ改变）为拉曼散射（Ramanspectra）无弹性碰撞，有能量交换，改变方向。其中频率较小的成分(v0-v1)又称为斯托克斯线（Stockslines)，频率较大的成分(v0+v1)又被称为反斯托克斯线（Anti-Stockslines）。因为斯托克斯线的强度远远强于反斯托克斯线，且基态分子比较多，所以拉曼光谱仪一般记录斯托克斯线。靠近瑞利散射线两侧的谱线称为小拉曼线，远离的则称为大拉曼线。瑞利散射线的强度只有入射光强度的l0-3-10-5，拉曼光谱强度大约只有入射光强的10-7-10-9。小拉曼光谱与分子的转动能级有关，大拉曼光谱与分子振动一转动能级有关。拉曼位移（Ramanshift)：拉曼位移的大小与入射光的频率无关，只与分子的能级结构有关，其范围为25～4000cm-1，因此入射光的能量应大于分子振动跃迁所需能量，小于电子能级跃迁的能量。Raman散射光的频率与入射光的频率相差∆v。对不同物质：∆v不同；对同一物质：∆v与入射光频率无关；可应用于表征分子振-转能级的特征物理量；定性与结构分析的依据。拉曼谱线强度与入射光强和样品分子的浓度成正比例关系，因此可利用拉曼光谱来进行定量分析，在与激光入射方向垂直的方向上，能收集到的拉曼散射光的光通量φR为：

φR=4nφL·A·N·L·K·sinα2(θ／2)

式中，φR为入射光照射到样品上的光通量；A为拉曼散射系数，约等于10-28～10-29mol／sr；N为单位体积内的分子数；L为样品的有效体积；K为考虑到折射率和样品内场效应等因素影响的系数；α为拉曼光束在聚焦透镜方向上的角度。利用拉曼效应及拉曼散射光与样品分子的上述关系，可对物质分子的结构和浓度进行分析研究。Raman散射的产生：光电场E中，分子产生诱导偶极距ρ，ρ=α*Eα分子极化率；Rayleigh/RamanTransitionsandSpectraRayleigh/RamanTransitions∆E=h∆vE0=hv0基态E1振动激发态实线代表realstates真实能级；虚线代表virtualstates虚能级VibrationalStates振动能级GroundState基级Fluorescence荧光拉曼光谱的一个重要参数：（强度，频率）退偏振比r（去偏振度depolarization）由于激光是线偏振光，而大多数的有机分子是各向异性的，在不同方向上的分子被入射光电场极化程度是不同的。在激光拉曼光谱中，完全自由取向的分子所散射的光也可能是偏振的，因此一般在拉曼光谱中用该参数ρ表征分子对称性振动模式的高低。（注缺失）去偏振度与分子的极化度有关，通过测定拉曼谱线的去偏振度，可以确定分子的对称性。拉曼光谱的特征(优、缺、难）：a.拉曼散射谱线的波数虽然随入射光的波数而不同，但对同一样品，同一拉曼谱线的位移与入射光的波长无关,只和样品的振动转动能级有关；b.在以波数为变量的拉曼光谱图上，斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布在瑞利散射线两侧,这是由于在两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子的能量。c.一般情况下，斯托克斯线比反斯托克斯线的强度大。这是由于玻尔兹曼（Boltzmann）分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发态上的粒子数。d.波长位移在中红外区。有红外及拉曼活性的分子,其红外光谱和拉曼光谱近似。可使用各种溶剂，尤其是能测定水溶液，样品处理简单。低波数段测定容易(如金属与氧、氮结合键的振动nM-O,nM-N等)。而红外光谱的远红外区不适用于水溶液，选择窗口材料、检测器困难。由Stokes、反Stokes线的强度比可以测定样品体系的温度。e.显微拉曼的空间分辨率很高，为1mm。时间分辨测定可以跟踪10-12s量级的动态反应过程。利用共振拉曼、表面增强拉曼可以提高测定灵敏度。f.其不足之处在于，激光光源可能破坏样品；荧光性样品测定一般不适用，需改用近红外激光激发等g.对样品无接触，无损伤；样品无需制备；快速分析，鉴别各种材料的特性与结构；能适合黑色和含水样品；高、低温及高压条件下测量；光谱成像快速、简便，分辨率高；仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。H.难点，拉曼散射信号弱（比荧光光谱平均小2－3数量级）。激光激发强。拉曼信号频率离激光频率很近。激光瑞利散射比拉曼信号强1010－1014，对拉曼信号干扰很大。拉曼光谱仪器的设计，必须能排除瑞利散射光，并具有高灵敏度（体现在弱信号检测的高信噪比），才能有效地收集拉曼谱。测定拉曼散射光谱时，一般选择激发光的能量大于振动能级的能量但低于电子能级间的能量差，且远离分析物的紫外-可见吸收峰。当激发光与样品分子作用时，样品分子即被激发至能量较高的虚态(上图中用虚线表示)。左边的一组线代表分子与光作用后的能量变化，粗线出现的几率大，细线表示出现的几率小，因为室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。中间一组线代表瑞利(Rayleigh)散射，光子与分子间发生弹性碰撞，碰撞时只是方向发生改变而未发生能量交换。右边一组线代表拉曼散射，光子与分子碰撞后发生了能量交换，光子将一部分能量传递给样品分子或从样品分子获得一部分能量,因而改变了光的频率。能量变化所引起的散射光频率变化称为拉曼位移。由于室温下基态的最低振动能级的分子数目最多,与光子作用后返回同一振动能级的分子也最多,所以上述散射出现的几率大小顺序为：瑞利散射>Stokes线>反Stokes线。随温度升高，反Stokes线的强度增加。CCl4的拉曼光谱usinganAr+laserat488nmRayleigh/RamanTransitionsandSpectra组成：AcompleteRamanspectrumconsistsof:一个完整的拉曼光谱由：•aRayleighscatteredpeak(highintensity强度,samewavelength波长asexcitation激发，激动，反应)•瑞利散射峰（高强度，相同的波长作为激发激发，激动，反应）•aseriesofStokes-shiftedpeaks(lowintensity,longerwavelength)斯托克斯移峰（低强度，长波长）•aseriesofanti-Stokesshiftedpeaks(stilllowerintensity,shorterwavelength)一系列的反斯托克斯移峰（仍然较低的强度，较短的波长）•spectrumindependentofexcitationwavelength(488,632.8,or1064nm)频谱独立的激发波长（488，632.8，或1064纳米）在坐标系中，拉曼光谱的横坐标为拉曼位移，以波数表示,是相对激发波长偏移的波数，波数就是波长的倒数，以cm-1为单位。其中和分别为Stokes位移和入射光波数。纵坐标为拉曼光强，纵坐标是光子计数,就是散射光的强度。由于拉曼位移与激发光无关，只与分子的能级结构有关，一般仅用Stokes位移部分。对发荧光的分子，有时用反Stokes位移。拉曼光谱的对应关系拉曼光谱的仪器：（一）分类：滤光器型拉曼光谱仪：有单色光源、滤光器、光学检测器组成，结构简单，可以制作的很小，只有很狭窄的光谱段进入检测器，大部分拉曼散射光被浪费。分光仪型拉曼光谱仪：将不同波长的光分散开，使他们成像于不同的位置。通常是将来自入射狭缝的光照射于衍射光栅，后将衍射光聚焦在光谱仪输出平面上，平面上安置探测器。光栅刻度线密度越大，光谱分辨率越高。干涉性（傅里叶变换）拉曼光谱仪：（二）具体组成：拉曼光谱仪一般由以下五个部分构成。1、光源：它的功能是提供单色性好、功率大并且最好能多波长工作的入射光。目前拉曼光谱实验的光源己全部用激光器代替历史上使用的汞灯，提供高功率、高能量、高单色性和高相干性的激光。对常规的拉曼光谱实验，常见的气体激光器基本上可以满足实验的需要。在某些拉曼光谱实验中要求入射光的强度稳定，这就要求激光器的输出功率稳定。2、外光路：外光路部分包括聚光、集光、样品架．滤光和偏振等部件。(1)聚光：用一块或二块焦距合适的会聚透镜，使样品处于会聚激光束的腰部，以提高样品光的辐照功率，可使样品在单位面积上辐照功率比不用透镜会聚前增强105倍。(2)集光：常用透镜组或反射凹面镜作散射光的收集镜。通常是由相对孔径数值在1左右的透镜组成。为了更多地收集散射光，对某些实验样品可在集光镜对面和照明光传播方向上加反射镜。(3)样品架：样品架的设计要保证使照明最有效和杂散光最少，尤其要避免入射激光进入光谱仪的入射狭缝。为此，对于透明样品，最佳的样品布置方案是使样品被照明部分呈光谱仪入射狭缝形状的长圆柱体，并使收集光方向垂直于入射光的传播方向。(4)滤光：安置滤光部件的主要目的是为了抑制杂散光以提高拉曼散射的信噪比。在样品前面，典型的滤光部件是前置单色器或干涉滤光片，它们可以滤去光源中非激光频率的大部分光能。小孔光栏对滤去激光器产生的等离子线有很好的作用。在样品后面，用合适的干涉滤光片或吸收盒可以滤去不需要的瑞利线的一大部分能量，提高拉曼散射的相对强度。(5)偏振：做偏振谱测量时，必须在外光路中插入偏振元件。加入偏振旋转器可以改变入射光的偏振方向；在光谱仪入射狭缝前加入检偏器，可以改变进入光谱仪的散射光的偏振；在检偏器后设置偏振扰乱器，可以消除光谱仪的退偏干扰。3、色散系统：色散系统使拉曼散射光按波长在空间分开，通常使用单色仪。由于拉曼散射强度很弱，因而要求拉曼光谱仪有很好的杂散光水平。各种光学部件的缺陷，尤其是光栅的缺陷，是仪器杂散光的主要来源。当仪器的杂散光本领小于10-4时，只能作气体、透明液体和透明晶体的拉曼光谱。4、接收系统：拉曼散射信号的接收类型分单通道和多通道接收两种。光电倍增管接收就是单通道接收。5、信息处理：为了提取拉曼散射信息，常用的电子学处理方法是直流放大、选频和光子计数，然后用记录仪或计算机接口软件画出图谱。具体实例：拉曼光谱仪的光源为激光光源。由于拉曼散射很弱，因此要求光源强度大，一般用激光光源。有可见及红外激光光源等。如具有308nm，351nm发射线的紫外激光器；Ar+激光器一般在488.0nm,514.5nm等可见区发光；而Nd:YaG激光器则在1064nm的近红外区使用。色散型拉曼光谱仪有多个单色器(doubleortriplemonochrometersystem)。由于测定的拉曼位移较小，因此仪器需要较高的单色性。在傅立叶变换拉曼光谱仪中，以迈克尔逊干涉仪代替色散元件，光源利用率高，可采用红外激光，用以避免分析物或杂质的荧光干扰。拉曼光谱仪的检测器为光电倍增管、多探测器(如CCD:ChargeCoupledDevice)等。微区分析装置的应用。微区分析装置是拉曼光谱仪的一个附件，由光学显微镜、电子摄像管、显象荧光屏、照相机等组成。可以（作用）将局部样品的放大图显示在荧光屏上，用照相机拍摄样品的显微图象。如人眼球晶体中白内障病变部位的观测等。（三）现在应用的拉曼光谱仪激光Raman光谱仪：(laserRamanspectroscopy)激光光源：He-Ne激光器，波长632.8nm;Ar激光器，波长514.5nm，488.0nm；散射强度∝1/λ4单色器：光栅，多单色器；检测器：光电倍增管，光子计数器；激光拉曼的应用的优势：激光拉曼光谱之所以一开始就受到重视，因为它与红外光谱有着相同的波长范围，操作比红外光谱简单，还具有以下优点：（1）单色光源的频率可根据样品颜色而有所选择。而红外光谱的光源不能任意调换。（2）激光拉曼光谱谱峰尖锐、分辨性好。而红外谱峰往往很宽。（3）在显微分析中，拉曼光谱有更高的分辨率。激光拉曼光谱的常规试样用量为2~2.5ug,微量操作时用量为0.06ug；红外光谱的常规用量为100ug,微量操作用量为0.1ug.(4)激光拉曼光谱可用于单晶的低频晶格频率及高频分子频率的研究红外光谱不能做这些单晶的数据。（5）激光拉曼光谱可测水溶液，而红外光谱不适用于水溶液的测定。（6）激光拉曼光谱的频率范围可为20～4000cm-1(500~2.5um)。一般红外光谱的测量范围只能为200～4000cm-1（50～2.5um）,200cm-1以下的需要用远红外光谱。（7）激光拉曼光谱对C=C,C≡C,S-S,C=S,P-S等红外弱谱峰很灵敏，能出现强峰，对易产生偏振的一切重元素（过渡金属超铀元素）的配位键均可出现拉曼强峰。（8）拉曼光谱中只有少量的倍频及组频。在红外光谱上，易出现倍频和组频。所以，在激光拉曼谱图上谱峰清楚，谱峰较少，往往出现基频峰，比红外光谱更容易分析。激光拉曼光谱法的应用激光拉曼光谱法的应用有以下几种：在有机化学上的应用，在高聚物上的应用，在生物方面上的应用，在表面和薄膜方面的应用。有机化学：拉曼光谱在有机化学方面主要是用作结构鉴定的手段，拉曼位移的大小、强度及拉曼峰形状是碇化学键、官能团的重要依据。利用偏振特性，拉曼光谱还可以作为顺反式结构判断的依据。高聚物：拉曼光谱可以提供关于碳链或环的结构信息。在确定异构体（单休异构、位置异构、几何异构和空间立现异构等）的研究中拉曼光谱可以发挥其独特作用。电活性聚合物如聚吡咯、聚噻吩等的研究常利用拉曼光谱为工具，在高聚物的工业生产方面，如对受挤压线性聚乙烯的形态、高强度纤维中紧束分子的观测，以及聚乙烯磨损碎片结晶度的测量等研究中都彩了拉曼光谱。生物：拉曼光谱是研究生物大分子的有力手段，由于水的拉曼光谱很弱、谱图又很简单，故拉曼光谱可以在接近自然状态、活性状态下来研究生物大分子的结构及其变化。拉曼光谱在蛋白质二级结构的研究、DNA和致癌物分子间的作用、视紫红质在光循环中的结构变化、动脉硬化操作中的钙化沉积和红细胞膜的等研究中的应用均有文献报道。利用FT-Raman消除生物大分子荧光干扰等，有许多成功的示例。表面和薄膜拉曼光谱在材料的研究方面，在相组成界面、晶界等课题中可以做很多例作。最近，对于拉曼光谱在金刚石和类金刚石薄膜的研究工作中的应用，国内外学者的兴趣有增无减。拉曼光谱已成CVD（化学气相沉积法）制备薄膜的检测和鉴定手段。另外，LB膜的拉曼光谱研究、二氧化硅薄膜氮化的拉曼光谱研究都已见报道。尽管拉曼散射很弱，拉曼光谱通常不够灵敏，但利用共振或表面增强拉曼技术就可以大大加强拉曼光谱的灵敏度。表面增强拉曼光谱学（SERS）已成为拉曼光谱研究中活跃的一个领域。发展传统的光栅分光拉曼光谱仪，彩的是逐点扫描，单道记录的方法，十分浪费时间。而且激光拉曼光谱仪所用的激光很容易激发出荧光来，影响测定。为避免传统激光光谱仪的弊端近来研制出了两种新型的光谱仪：傅里叶变换近红外激光拉曼光谱仪和共焦激光光谱仪。傅里叶拉曼光谱仪由激光光源、试样室、迈克尔逊干涉仪、特殊滤光器、检测器组成。傅里叶拉曼光谱仪和光路与傅里叶红外光谱仪的光路比较相象。检测到的信号经放大器由计算机收集处理。1.T64000型拉曼光谱仪：64000系统是由ISA/JOBIN-YVON公司研制生产的能兼顾单、多道检测，设计新颖的新一代全电脑化的三级光谱系统，用于常规Raman光谱，变温等极端物理条件下的Raman光谱，显微Raman光谱和发射光谱的测量。它可以取得样品表面1um尺寸上的Raman信号。系统内有多个平面反透镜和狭缝。通过不同反射镜和狭缝的组合，T64000可以作为单级、双级和三级色散不同的光谱仪使用。系统装备的CCD探测器可以使得光谱探测的效率大大提高。主要技术指标如下：1800条/mm全息光栅光谱范围：350-900nm；杂散光：10-14；重复性：±0.1cm-1；精度：0.01%；600条/mm全息光栅闪烁在1.5mm，光谱范围：800nm-2.5mm；极低噪声的CCD探测器光谱范围：400-1000nm；显微入射系统配有×100，×50（长焦距），×50，×10物镜。T64000型光谱仪的内光路示意图外观图2.傅立叶变换-拉曼光谱仪:(FT-Ramanspectroscopy)光源：Nd-YAG钇铝石榴石激光器（1.064m）；检测器：高灵敏度的铟镓砷探头；特点：避免了荧光干扰；精度高；消除了瑞利谱线；测量速度快。 3.Renishaw拉曼光谱仪（优点）高灵敏度：

灵敏度远高于其它同类拉曼谱仪，

检验标准：硅三阶峰（约在1440cm-1）的信噪比≧10:1，检测条件为：激光输出功率20mW，波长514.5nm，狭缝宽度50微米，曝光时间60秒，累加次数5次，binning（分级）为1或2，光栅为1800刻线。显微镜头为X50常规镜头。高稳定性、高重复性

稳定性、重复性标志一台仪器的质量，保证了数据的可靠性及重复性，是检测光谱微小变化的关键性能，

如材料的应力、应变引起的波数位移。雷尼绍拉曼光谱仪的传动部件使用了世界领先的RG2线形和圆形编码器，克服了机械间隙。能够给光谱仪带来空间与光谱的高稳定性，高重复性，高精度与高准确度同步连续扫描专利技术（SynchroScan）

可一次性连续获取任意宽波段范围光谱（拉曼及发光光谱）无需人为接谱，无需使用低分辨率的光栅，且保证高分辨率，并可平均掉单探测点噪音及缺陷。应用技术1、光栅连续转动2、CCD电荷的移动与光栅的转动同步。优点：无需接谱；连续极端大范围扫描（9000cm-1以上）；信号横越CCD的整个宽度，可将电荷漏电等噪声平均掉，不会产生赝谱；避免了材料的荧光背景虽时间逐渐减弱(淬灭)产生明显赝谱的问题。采用Leica显微镜

高热稳定性和机械稳定性目镜：Leica原配，符合欧洲及北美等安全标准。好处是a.高分辨，大视野，可方便、准确地寻找微米级样品：如矿物包裹体等，以及低反差样品；b.可安全地观察激光焦点，以确认激光焦点是否聚焦在微米颗粒上。同时配有摄像机：彩色，高分辨，可观察激光焦点，不饱和，提供图像采集卡及软件，可在计算机上存储白光照片，无需照相机。照明光源：Leica原配，确保质量。数字化显微共焦系统专利技术

受专利保护的最新的显微共焦系统技术，无需调节针孔，并可连续调节共焦深度，大大提高了仪器的光通量和稳定性。16级激光功率缜密衰减（可从100%至5x10-8%）采用激光扩束器技术，可以连续改变激光焦点处光斑大小（1-250微米），进而可以连续改变作用于样品上的功率密度

注：激光功率过高或者激光功率密度过高，有的样品可能被烧，也有的样品虽然不会破坏，但在激光加热下，会产生应力，导致拉曼峰的移动，影响了实验结果的准确性。自动化程度高

激光光路：计算机控制、调节、存储激光光路的位置。激光光路可自动准直。激光波长可自动切换

部件：瑞利滤光片自动切换。光栅可自动切换。狭缝大小可自动调节

功能：共焦与非共焦可自动切换。取谱模式与观察样品模式可自动切换。自动切换激光的16级衰减模式。选择了最佳成像质量的CCD芯片尺寸可以选择的仪器分辨率/灵敏度

分辨率和灵敏度是一对矛盾，分辨率提高的同时，灵敏度将会下降。分辨率和多种因素有关，不仅仅取决于焦长。在Renishaw的仪器上，用户可根据所研究的样品来选择分辨率和灵敏度，既可选择高分辨率，也可选择高灵敏度。功能扩展能力强

可与扫描电镜（电子探针，能谱，阴极荧光）联用。可与原子力显微镜/近场光学联用。可与付立叶红外光谱仪联用。可与共聚焦扫描显微镜联用。（四）减少拉曼光谱中的噪音的方法：是信号还是噪音取决于分子的对象和目的；增加重复光谱次数改善噪音比；用较长波长的激发光或测定开始前用激光对试样照射一段时间减弱背景荧光；加化学试剂破坏荧光结构。（五）拉曼仪器的发展：1.显微拉曼光谱仪：2.共焦显微拉曼光谱仪：在样品成像处放置一个光阑，提高轴向分辨率。3.纤维光学拉曼光谱仪：不成像纤维光学探针，最简单的形式是两根紧靠在一起平行排列的光纤。其中一根纤维传送激光，而在另一根纤维的芯部收集其接受角锥体内的拉曼散射光，传到仪器中；聚焦纤维光学探针，将来自光线的激光聚焦于样品的小区域，来自该区域的拉曼散射光则被聚焦到另一根返回光纤传回仪器检测（六）仪器使用注意事项：具备暗室条件，无强振动源，无强电磁干扰，不可受阳光直射。光学器件表面有灰尘，不允许接触擦拭，可用气球小心吹掉。实验结束，先取出试样，关断电源。注意激光器电源开关顺序正好相反。四、拉曼与红外的区别：苯benzene的红外与拉曼图相同：激光拉曼光谱与红外光谱一样，都能提供分子振动频率的信息，对于一个给定的化学键，其红外吸收频率与拉曼位移相等，均代表第一振动能级的能量。不同：1、红外光谱的入射光及检测光都是红外光，拉曼光谱的入射光及散射光大多是可见光。拉曼效应为散射过程，拉曼光谱为散射光谱，红外光谱对应的是与某一吸收频率相等的（红外）光子被分子吸收，因而红外光谱是吸收光谱。机理不同：从分子结构性质变化的角度来看，拉曼散射过程来源与分子的诱导偶极矩，与分子的极化率的变化相关。通常非极性分子及基团的振动导致分子变形，引起极化率的变化，是拉曼活性的。红外吸收过程与分子永久偶极矩的变化相关，一般极性分子及基团的振动引起永久偶极矩的变化，故通常是红外活性的。制样技术不同：红外光谱制样复杂，拉曼光谱无需制样，可直接测试水溶液。联系：相互排斥规则：凡有对称中心的分子，若有拉曼活性，则红外非活性。反之亦然。相互允许规则：凡无对称中心的分子，大多数分子红外拉曼都有活性。相互禁止规则：少数的分子振动，二者都不是。如、乙烯分子的扭曲振动，在红外和拉曼光谱中均观察不到该振动的谱带。Eer红外活性振动:ⅰ永久偶极矩；极性基团；Eer红外活性振动—伴有偶极矩变化的振动可以产生红外吸收谱带.拉曼活性振动:诱导偶极矩=E;非极性基团，对称分子；拉曼活性振动—伴随有极化率变化的振动。对称分子：对称振动→拉曼活性。不对称振动→红外活性PolarizationEffects极化效应Raman光谱选律是分子具有各向异性的极化率：即分子中的电子在电场作用下沿键轴方向变形大于垂直于键轴方向的变形,则分子的诱导偶极矩要发生变化.五、拉曼光谱学的优势：HerearesomereasonswhysomeonewouldprefertouseRamanSpectroscopy.以下是为什么有人会喜欢使用拉曼光谱的一些原因。•Non-destructivetosamples(minimalsampleprep)对样品的非破坏性（最小样本准备）•Highertemperaturestudiespossible(dontcareaboutIRradiation)尽可能更高的温度研究（不关心红外辐射）•Easilyexaminelowwavenumberregion:100cm-1readilyachieved.轻松检查低波数区：100cm-1的容易实现。•Bettermicroscopy;usingvisiblelightsocanfocusmoretightly.更好的显微镜；使用可见光，所以可以更紧密地聚焦。•Easysampleprep:waterisanexcellentsolventforRaman.Canprobesamplethroughtransparentcontainers(glassorplasticbag).容易的样品制备.水是一种很好的拉曼光谱.通过透明容器（玻璃或塑料袋）可探测样品。（一）拉曼光谱技术的优越性提供快速、简单、可重复、且更重要的是无损伤的定性定量分析，它无需样品准备，样品可直接通过光纤探头或者通过玻璃、石英、和光纤测量。此外1由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光谱是研究水溶液中的生物样品和化学化合物的理想工具。2拉曼一次可以同时覆盖50-4000波数的区间，可对有机物及无机物进行分析。相反，若让红外光谱覆盖相同的区间则必须改变光栅、光束分离器、滤波器和检测器。3拉曼光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究、数据库搜索、以及运用差异分析进行定性研究。在化学结构分析中，独立的拉曼区间的强度可以和功能集团的数量相关。4因为激光束的直径在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫米，常规拉曼光谱只需要少量的样品就可以得到。这是拉曼光谱相对常规红外光谱一个很大的优势。而且，拉曼显微镜物镜可将激光束进一步聚焦至20微米甚至更小，可分析更小面积的样品。5共振拉曼效应可以用来有选择性地增强大生物分子特个发色基团的振动，这些发色基团的拉曼光强能被选择性地增强1000到10000倍。（二）拉曼光谱用于分析的不足(1)拉曼散射面积(2)不同振动峰重叠和拉曼散射强度容易受光学系统参数等因素的影响(3)荧光现象对傅立叶变换拉曼光谱分析的干扰(4)在进行傅立叶变换光谱分析时，常出现曲线的非线性的问题(5)任何一物质的引入都会对被测体体系带来某种程度的污染，这等于引入了一些误差的可能性，会对分析的结果产生一定的影响。六、拉曼光谱的应用：（一）拉曼光谱与有机结构：由拉曼光谱可以获得有机化合物的各种结构信息：1）同种分子的非极性键S-S，C=C，N=N，CC产生强拉曼谱带，随单键双键三键谱带强度增加。2）红外光谱中，由CN，C=S，S-H伸缩振动产生的谱带一般较弱或强度可变，而在拉曼光谱中则是强谱带。3）环状化合物的对称呼吸振动常常是最强的拉曼谱带。4）在拉曼光谱中，X=Y=Z，C=N=C，O=C=O-这类键的对称伸缩振动是强谱带，反这类键的对称伸缩振动是弱谱带。红外光谱与此相反。5）C-C伸缩振动在拉曼光谱中是强谱带。6）醇和烷烃的拉曼光谱是相似的：I.C-O键与C-C键的力常数或键的强度没有很大差别。II.羟基和甲基的质量仅相差2单位。III.与C-H和N-H谱带比较，O-H拉曼谱带较弱。（二）用通常的拉曼光谱可以进行半导体、陶瓷等无机材料的分析。如剩余应力分析、晶体结构解析等。拉曼光谱还是合成高分子、生物大分子分析的重要手段。如分子取向、蛋白质的巯基、卟啉环等的分析。直链CH2碳原子的折叠振动频率可由下式确定：n=2400/Nc(cm-1)。Nc为碳原。由图可知，材料不同，拉曼光谱不同。（三）领域：1.石油领域：检测石油产品质量、定性分析石油产品组成或种类2.食品领域;用于食品成分的“证实”，以及掺杂物的“证伪”3.农牧领域:农牧产品的分类及鉴定4.化学、高分子、制药及医学相关领域:过程控制；质量控制、成分鉴定、药物鉴别、疾病诊断5.刑侦及珠宝行业:毒品检测；珠宝鉴定6.环境保护:环保部门水质污染监测、表面污染检测和其他有机污染物7.物理领域；光学器件和半导体元件研究8.鉴定：古物古玩鉴定、公安刑事鉴定等其他领域。9.地质领域;现场探矿、矿石成分的定量定性分析和包裹体的研究等。七、拉曼信号的选择入射激光的功率，样品池厚度和光学系统的参数也对拉曼信号强度有很大的影响，故多选用能产生较强拉曼信号并且其拉曼峰不与待测拉曼峰重叠的基质或外加物质的分子作内标加以校正。其内标的选择原则和定量分析方法与其他光谱分析方法基本相同。斯托克斯线能量减少，波长变长；反斯托克斯线能量增加，波长变短八、发展前景：(一）激光技术（二）纳米科技九、相关技术：（一）高温法高温激光拉曼技术被用于冶金、玻璃、地质化学、晶体生长等领域，用它来研究固体的高温相变过程，熔体的键合结构等。然而这些测试需在高温下进行，必须对常规拉曼仪进行技术改造。（二）共振法RRS(ResonanceRamanScattering)激光共振拉曼光谱(RRS)产生激光频率与待测分子的某个电子吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度可达到正常拉曼谱带的104～106倍，并观察到正常拉曼效应中难以出现的、其强度可与基频相比拟的泛音及组合振动光谱。与正常拉曼光谱相比，共振拉曼光谱灵敏度高，结合表面增强技术，灵敏度已达到单分子检测。以分析物的紫外-可见吸收光谱峰的邻近处作为激发波长。样品分子吸光后跃迁至高电子能级并立即回到基态的某一振动能级，产生共振拉曼散射。该过程很短，约为10-14秒。而荧光发射是分子吸光后先发生振动松弛，回到第一电子激发态的第一振动能级，返回基态时的发光。荧光寿命一般为10-6-10-8秒。共振拉曼强度比普通的拉曼光谱法强度可提高102-106倍，检测限可达10-8摩尔/升，而一般的拉曼光谱法只能用于测定0.1摩尔/升以上浓度的样品。因此RRS法用于高灵敏度测定以及状态解析等,如低浓度生物大分子的水溶液测定。共振拉曼的主要不足是荧光干扰。例如用共振拉曼确定血红蛋白和细胞色素c中Fe的氧化态和Fe原子的自旋状况。此时共振拉曼仅取决于四个吡咯环的振动方式，与蛋白质有关的其它拉曼峰并不增强，在极低浓度时并不干扰。（三）共焦显微法显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的一种应用技术。与其他传统技术相比，更易于直接获得大量有价值信息，共聚焦显微拉曼光谱不仅具有常规拉曼光谱的特点，还有自己的独特优势。辅以高倍光学显微镜，具有微观、原位、多相态、稳定性好、空间分辨率高等特点，可实现逐点扫描，获得高分辨率的三维图像，近几年共聚焦显微拉曼光谱在肿瘤检测、文物考古、公安法学等领域有着广泛的应用。（四）傅立叶变换法傅立叶变换拉曼光谱是上世纪90年代发展起来的新技术，1987年，PerkinElmer公司推出第一台近红外激发傅立叶变换拉曼光谱(NIRFT—R)仪，采用傅立叶变换技术对信号进行收集，多次累加来提高信噪比，并用1064mm的近红外激光照射样品，大大减弱了荧光背景。从此，Fr—Raman在化学、生物学和生物医学样品的非破坏性结构分析方面显示出了巨大的生命力。（五）光纤法光纤的引入,使拉曼光谱仪用于工业在线分析以及现场遥测分析成为可能。Huy等使用两个10m长、100μm直径的光纤,激光波长为514.5nm,对苯/庚烷混合物进行分析,获得非常好的结果。Benoit等将光导纤维传感器用于拉曼光谱仪,使得液体样品的拉曼信号增强了50倍。Cooney等人比较单个光纤与多个光纤应用于拉曼光谱仪的结果,发现多个光纤的应用将改善收集拉曼光的有效性。Cooper等利用光纤遥控拉曼技术分析了石油染料中的二甲苯异构体。近年来,国外将1550nm光纤激光器、EDFA光纤放大器技术应用于拉曼散射型分布光纤温度传感器系统,取得了较好的结果。分布式光纤拉曼光子温度传感器已成为光纤传感技术和检测技术的发展趋势。由于它具有独特的性能,因此已成为工业过程控制中的一种新的检测装置,发展成一个工业自动化测量网络。（六）固体光声法光声拉曼技术是通过光声方法来直接探测样品中因相干拉曼过程而存储能量的一种非线性光存储技术。光声拉曼信号正比于固体介质三阶拉曼极化率的虚部,与非共振拉曼极化率无关,因而完全避免了非共振拉曼散射的影响,并且克服了传统的光学法受瑞利散射,布里渊散射干扰的缺点,具有高灵敏度(能探测到10-6cm-1的拉曼系数)、高分辨率和基本上没有光学背景等优点。在气体、液体样品的检测分析中获得了理想的效果。由于不像相干斯托克斯拉曼过程那样有比较严格的相位匹配角要求,因而它也很适合用于研究固体介质特性。Barrett等人从理论上分析了气体样品中的光声拉曼光谱技术过程,但与之不同,固体介质的光声拉曼效应是由相干拉曼增益过程产生的局部热能耦合到样品本身的振动模式的热弹过程,对于介质各向异性结构,三阶非线性拉曼极化率张量形式表现出对称性,因而,情况要复杂得多,运用平行模型和热弹性理论,导出固体介质样品中光声拉曼信号的解析式,对固体中光声拉曼效应的一些特性进行分析。（七）联用法近两年，实现拉曼与其它多种微区分析测试仪器的联用，其中有：拉曼与扫描电镜联用(Raman—SEM)；拉曼与原子力显微镜/近场光学显微镜联用(Raman—AFM/NSOM)；拉曼与红外联用(Raman—iR)；拉曼与激光扫描共聚焦显微镜联用(Raman—CLSM)，这些联用的着眼点是微区的原位检测。通过联用可以获得更多的信息，并提高可靠度。（八）表面增强法SERS(Surface-EnhancedRamanScattering)

自1974年Fleischmann等人发现吸附在粗糙化的Ag电极表现的吡啶分子具有巨大的拉曼散射现象，加之活性载体表面选择吸附分子对荧光发射的抑制，使激光拉曼光谱分析的信噪比大大提高，这种表面增强效应被称为表面增强拉曼散射(SERS)。SERS技术是一种新的表面测试技术，可以在分子水平上研究材料分子的结构信息。表面增强拉曼是用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。尽管原因尚不明朗，人们发现被吸附的样品其拉曼光谱的强度可提高103-106倍。如果将表面增强拉曼与共振拉曼结合，光谱强度的净增加几乎是两种方法增强的和。检测限可低至10-9-10-12摩尔/升。表面增强拉曼主要用于吸附物种的状态解析等。一般物质分子的拉曼光谱很微弱,为了获得增强的信号,可采用电极表面粗化的办法,可以得到强度高104-107倍的表面增强拉曼散射(SurfaceEnhancedRamanScattering,SERS)光谱,当具有共振拉曼效应的分子吸附在粗化的电极表面时