抗植物病毒天然抽提物的研究进展

PAGEPAGE6福建农林大学研究生学年论文授课时间2011—2012学年度第二学期学号：1110204012研究生姓名：袁素素课程名称：植物分子病毒学论文题目：抗植物病毒天然抽提物的研究进展授课或主考教师：魏太云抗植物病毒天然抽提物的研究进展摘要：综述了自然界中对植物病毒具有抑制作用的植物和微生物提取物,并对提取物的提取方法，抑制作用，抑制机理，研究方法，发展前景做了论述。关键词:植物病毒；天然抽提物；抑制作用几乎每种农作物和经济作物都受到2～3种病毒的危害植物病毒病害[1]，在农业生产上造成严重的危害。据估计，全世界每年因植物病毒病害造成的损失就超过150亿美元，其中仅烟草花叶病毒病(Tobaccomosaicvirus)的危害每年造成的损失就达1亿多美元。由于植物病毒对寄主的专性寄生性，加上植物缺乏完整的免疫代谢系统，使得植物病毒病的防治一直十分困难[2]，所以寻找一种安全、有效的抗病毒制剂是目前生产的需要。从自然界的生物中筛选抗病毒物质是寻找抑制植物病毒资源的研究热点。1.天然产物抑制病毒的研究现状Swain认为，植物是生物活性化合物的天然宝库，其产生的次生代谢产物超过40万种，其中大多数化学元素物质如：萜烯类、生物碱、类黄酮、甾体、酚类、独特的氨基酸和多糖等均具有杀虫或抗菌活性[3]。Mahadeve指出，591种植物抽取物对真菌或细菌具有拮抗作用，173种植物含抗病毒物质。1.1植物中提取的抗病毒天然产物自1914年Allard首次报道商陆汁液具有抗病毒活性后，国内外学者对许多植物提取液的抗病毒活性进行了广泛的研究[4]。它们大多集中在石竹目，包括商陆科(Phytolaccaceae)、藜科（Chenopodiaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)以及莲子草属(AlternantheraForsk)和叶子花属(BougainvilleaComm.exJuss.)等数百种植物中。沈建国[5]等试验了78科162种植物，发现其中160种对病毒侵染具有一定的抑制作用，抑制率在50%以上的有83种，抑制率超过95%的有19种：麻黄、杠板归、雷公藤、莲、木瓜、山楂、羊蹄甲、夜交藤、火炭母、辣蓼、榕树、柿、水蜈蚣、金石榴、石韦根、哥兰叶、杨梅、鼠尾粟。抑制率在90%以上的还有菊花、叶下珠、连翘、小藜、玉簪、菠菜、苋色藜、大蒜、板蓝根、三叶鬼针草等。林存銮，裘维蕃等[6]在测定的90种植物中，小藜(ChenopodiumserotinumL.)和玉簪[Hostaplantaginea(Lam.)Aschers.]两种植物抽提液对番茄花叶病毒(Tomatomosaicvirus,ToMV)有较强的抑制作用，其它大部分抽提液对病毒有明显的体外钝化作用，但对病毒的治疗效果很弱，并发现有些抽提液似有协生作用。Duarte[7]证实叶子花(BougainvileaglabraChoisy)、红叶藜(C.rubrumL.)和红花马齿苋(Portulacasplendens)对马铃薯X病毒(PotatoXvirus,PVX)的抑制率可高达40%以上，恢复实验显示无症植株不带毒。而红叶藜对马铃薯Y病毒(PotatoYvirus,PVY)治疗效果甚微。另外，红叶藜和红花马齿苋可以抑制TMV-Leg的系统感染，却对菜豆金黄花叶病毒(Beangoldenmosaicvirus,BGMV)无效。已发现含病毒抑制剂的植物种类越来越多，这些抑制剂大多集中在植物的茎、叶、根、花和种子内。除石竹外，已报道对病毒有抑制作用的植物还有庭荠(Alyssumsp.)、油菜(Brassicacampestris)、蔓陀萝(Daturastramonium)、烟草(Nicotianatabacum)、酸模(Rumexcrispus)、粉草(Pseuderanthemumbicolor)[8]。许玉娟等从苍耳幼苗中提取得苍耳多糖，发现苍耳多糖对TMV具有一定的抑制作用，在浓度为1.0mg／mL时，乙醇浓度为30％的条件下获得的多糖对TMV的抑制率为48.36％[9]。1.2微生物病毒抑制剂早在19世纪70年代，人们就发现多种担子菌子实体、食用菌深层发酵液和固体培养物水浸液对植物病毒有抑制作用[10-12]。研究报道从榆黄蘑(Plearotuscitrinopileatus)[13]、金针菇(Flammulinavelutipes)[14]、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)[15]、杨树菇(Agrocybeaegerita)[16]、灰花树(Grifolafrondoca)[17]、毛头鬼伞(Coprinuscornatus)[18]等多种食用菌中分离到具有抗TMV活性的蛋白质。马学萍[19]等测试了鸡油菌(CantharellusminorPeck)、蘑菇(AgaricnscampestrisL.Fr)、香菇[Lentinuedodes(Berk.)Sing.]、平菇(Pluribus)、茶树菇[Agrocybeaegerita(Brig.)Sing.]、鸡腿菇(Coprinuscomattts)、真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)、金针菇(Flammulinavelutipes)8种食用菌乙醇提取物水溶液对烟草花叶病毒(TobaccoIllosaicvirus.TMV)的抑制作用，实验结果表明：8种食用菌提取物在体外都具有钝化病毒(TMV)及抑制病毒(TMV)侵染的作用；除鸡油菌(CantharellusminorPeck)外，其它7种食用菌提取物对TMV有不同程度的治疗作用。李丹[20]等对采自自云南的17种大型食用真菌子实体的浸提液及其多糖组分对TMV从预防(施用提取物24h后接种病毒)、钝化(提取物与病毒混合后接种)、治疗(接种病毒24h后施用提取物)3个方面进行抑制活性检测。结果表明，l6种食用菌子实体的浸提液对TMV有较好的预防和钝化作用，预防效果最好的真菌为火碳菌，预防效果达到99.95％。火碳菌、奶浆菌、扫把菌、白奶浆菌、美味牛肝菌、黄虎掌、黄牛肝、黑虎掌、冬瓜菌、红乳菇、北风菌的水浸液对TMV的钝化效果均在80％以上。火碳菌、青杆菌等9种食用菌的多糖组分与其子实体浸提液对TMV的抑制效果相似，表明其多糖组分具有抑制TMV的主要活性成分。实验真菌的治疗效果总体不如钝化效果明显，治疗效果在70％以上的有扫把菌、黄虎掌和冬瓜菌。其中，火碳菌和黄牛肝等对TMV抑制效果较好的食用菌及其多糖可作为环保型农药及生物保健产品的开发对象。据报道部分抗病毒菌素对植物病毒病的抑制和延缓病害发生具有一定作用[21]。辛玉成等发现微生物菌株Penicilinsp.的代谢产物对黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)作用效果良好。抑病毒菌素对菜豆上CMV在500mg/L的钝化效果为75.4%，抑病毒菌素对番茄上CMV在500mg/L处理的钝化效果为61.2%。抑病毒菌素对病毒初侵染也有一定的抑制作用[22]。2.研究方法2.1抽提方法2.1.1多糖提取方法许玉娟用水提醇沉法从苍耳幼苗中获得不同醇沉级的苍耳多糖。具体过程如下：取苍耳幼苗100g，加200mL蒸馏水，匀浆，80℃提取2次，合并提取液，减压浓缩至1／3体积。Sevag法脱蛋白，离心，除去变性蛋白，浓缩至1／3体积，加95％乙醇，使含醇量达到30％，4℃放置过夜，离心收集沉淀，复溶于水，水浴加热挥发乙醇，冷冻干燥后得30％粗多糖组分。上清液继续加入95％乙醇，使含醇量达到60％，同前处理得60％粗多糖组分，同样方法得到80％粗多糖组分[9]。在多糖的提取中多用水提醇沉法，此方法简单可行，提取多糖含杂质较少，但是提取工艺的不合理，醇溶性差异，以及提取过程中易受各种外在因素的影响，导致提取物中多糖分子结构的改变2.1.2蛋白提取方法王芳等研究拮抗细菌活性蛋白对CMV的体外钝化作用为86.97%，通过离子交换层析和凝胶过滤层析的方法粗提蛋白，并测得活性蛋白的分子量大小为40.6KD。离子交换层析和凝胶过滤层析是蛋白提出的基本方法。前者是利用各带电蛋白与离子交换剂之间的差异进行物质分离的操作方法。后者是根据蛋白质的大小和形状，在层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖类物质，使蛋白混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。2.2抑制方法在植物病毒抑制物的筛选和抑制效果试验中，枯斑分析法与漂浮叶圆片法是最常用的两种方法。其中，前者主要用来研究抑制物抑制病毒侵染作用及抑制病毒复制的定量分析，而后者则被普遍认为是抗病毒化学成分测试的一种重要模式。此外，在研究抑制病毒增殖作用的测定中，还有棉线法、局部病斑法、水培法等。此外，在研究抑制病毒增殖作用的测定中，还有棉线法、局部病斑法、水培法等。在试验中，往往采用系统感染寄主的方法，通过田间实际传染方式相近的方法如喷雾、灌根等接种病原物，根据植物发病率、病情指数或植物体内的病毒含量来评价有效成分的抑制效果。另外，江山[23]提出药物是否影响TMV衣壳蛋白聚合可作为筛选植物病毒抑制剂的方法之一；侯玉霞[24]验证了病毒／细胞同步侵染体系筛选抗植物病毒剂是可行的方法。许玉娟采用枯斑半叶法在心叶烟上进行抗烟草花叶病毒(TMV)活性的检测[9]。3.抗植物病毒的化学物质①金属盐类，如ZnSO4、CaC12；②有机化学物质，如水杨酸、聚苯烯酸、类黄酮、季胺化合物、非环式连氮结构化合物、蒽醌类等；③嘌呤和嘧啶类，如8一氮杂腺嘌呤、2一硫脲嘧啶、三嗪类等；④氨基酸，如原亮氨酸、半磺氨酸等；⑤维生素类；⑥植物激素类，如赤霉素、抗病毒醚、胞激素、激动素等；⑦蛋白质类，如牛奶和脱脂牛奶。这些化学物质有的对植物病毒只有体外钝化作用，有的在活体内有抑制病毒和治疗作用，有的可以诱导寄主植物产生与病程相关的蛋白，从而提高植株的抗病性。4.抑制机理刘学端等从600多种植物中筛选复配了一种对烟草花叶病防效较理想的药剂MHll-4。研究结果表明，MH11-4的防病机理表现在体外钝化病毒、体内抑制病毒增殖和诱导烟株产生抗性3个方面。随着研究手段的H臻完善，许多天然抑制剂对靠机械传播的病毒特别有效。从现有的研究结果看，高等植物中抑制病毒的有效成分大多属于碱性蛋白或蛋白类似物，诸如多肽、酶等。高等植物和微生物代谢产物对病毒的抑制作用机理还不完全清楚，天然抑制剂主要是使病毒粒子的蛋白凝聚和蛋白合成受阻，从而使病毒不能复制。从香菇中提取的苯恩特明对TMV的抑制作用，可在电镜下观察到病毒凝聚，这表明是其外壳蛋白引起某些变性造成的[25]。Grasso等[26]认为喷洒天然抑制剂后，使寄主核糖体上的病毒蛋白合成受阻，病毒不能复制。关于病毒蛋白合成受阻的原因，Grasso认为抑制剂使病毒的RNA失去了mRNA的功能，从而不能合成病毒复制所需要的早期蛋白。雷新云等认为NS-83与植物激素的作用和机制相类似，制剂作用于植物细胞膜，启动质子泵，控制了膜的通透性。同时，NS-83引起植物一系列生理生化变化，并认为NS-83中存在激素特性的证明为这一解释提供了依据。林存銮和裘维蕃[27]根据多种抽提液对病毒有体外钝化作用，但很少具有病毒治疗效果的现象认为，这些物质具有不同的作用机制，即具有强体外钝化作用的物质不一定在植物体内起治疗作用；相反，在体外钝化作用较弱的也有可能有一定的治疗作用。对病毒的体外钝化作用，一般认为是钝化物质对病毒直接的物理作用。而对病毒的治疗作用，则可能是在寄主体内对病毒增殖过程的抑制作用，也可能是通过诱导寄主植物在生理机制上发生一系列变化，从而产生一定的抗性或耐性，降低病毒的增殖，甚至可能二者兼有。许玉娟等测定了苍耳多糖处理普通烟后烟草叶片中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化，发现喷施苍耳多糖后，可提高烟草叶片POD、PPO、PAL酶的活性，因此苍耳幼苗多糖可能通过诱导烟草中防御酶活性形成对TMV的抑制活性[9]。但是植物抽提物和微生物代谢产物对病毒产生的抑制机理还不是完全清楚。现有的研究也仅限于初步了解，真正的作用机理还需要进行深入研究。5.存在的问题及发展前景5.1存在问题当前还没有一种理想的药剂能够有效地防治植物病毒病。虽然在抗植物病毒天然物质筛选研究中取得了一些成果，但仍存在许多问题，主要表现在以下几个方面：①筛选的面不宽。目前抗植物病毒天然物质筛选多以中草药为主，筛选的面较窄。②抗植物病毒天然物质筛选方法的局限性。建立标准体系是一个重要基础工作，然而由于对植物病原物致病机理的研究不够深入，特别是对植物、病原物和药剂之间相互作用的关系不够明朗，使得有效成分筛选没有较好的理论基础。③活性成分缺乏跟踪研究。目前提取有效成分的方法常用乙醇或直接用水浸提，虽然含有许多活性和非活性成分，但确切的活性成分、结构及构效关系探讨缺乏深入的跟踪研究。④抑制机理没有完全弄清楚。目前，对有效成分在病原物一寄主之间的识别作用、诱导信号传导等方面尚有许多问题没有完全弄清楚，还需进一步的研究。5.2发展前景由于病毒病是仅次于真菌病害的第二大病害，每年病毒病造成的损失相当严重，所以寻找一种安全、有效的抗病毒制剂是目前生产的需要。天然抑制剂的开发与利用为研制抗病毒制剂开辟了一条崭新的途径，具有美好的前景。首先，由于植物本身存在方式的特殊性，在植物王国中可供开发的有效成分种类十分丰富。其次，植物源活性成分的研究与开发符合绿色思维。大多有效成分属于小分子物质，易被植物吸收，同时其本身又来源于植物，一般都易在环境中降解，不易造成环境污染和残留毒性问题。开发的制剂与环境有较高和谐度，是目前无公害农药、动植物绿色生产的重要方向。此外，利用有效成分结构作为先导化合物进行仿生合成，也可能筛选出比天然活性更理想的新制剂，这也是新型药剂(包括农药)开发的重要思路。参考文献：[1]安德荣.植物病毒化学防治的研究现状和所面临的问题[J].生命科学,1994,6(2):16—18.[2]吴云峰.生物病毒农药筛选及应用[J].世界农业,1995,(5):35—36.[3]李永刚,文景芝,都中娜.植物源杀菌剂的研究现状与展望[J].东北农业大学学报,2002,33(2):198—202.[4]沈建国,翟梅枝,林奇英,等.我国植物源农药研究进展[J].福建农林大学学报(自然科学版)[J].2002,31(1):26—31.[5]沈建国,谢荔岩,吴祖建,等.药用植物提取物抗烟草花叶病毒活性的研究［Ｊ］.中草药,2006,37(2):259-261.[6]林存銮,裘维蕃.植物保护学报[J],1987,14(4):218～221.[7]DuarteLML.MicrobiosLetters[J],1990,45:131～137.[8]AbidAli,KhanMM,VermaHN.AnnalsofAppliedBiology[J],1990,117(3):617～623.[9]许玉娟,范素素等.苍耳多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及对烟草几种防御酶活性的影响.山东农业大学学报（自然科学版）,2010,41（4）:485-488.[10]王晶英,郑雅莺,张建光,等.食用菌代谢产物研究及其在农业上的应用[J].中国食用菌,1997,16(2):6—7.[11]高木康至,岛田和纯.伞菌类锯木屑培养物提取液对TMV的防治效果[J].日植病报,1977,43:211—214.[12]王先彬,王启燕.香菇培养物水浸液对烟草花叶病毒(TMV)侵染心叶烟的抑制作用[J].微生物学报,1986,26(4):363—365.[13]付鸣佳,吴祖建,林奇英,等.榆黄蘑中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗烟草花叶病毒和乙型肝炎病毒的活性[J].中国病毒学,2002,17(4):350—353.[14]付鸣佳,吴祖建,林奇英,等.金针菇中一种抗病毒蛋白的纯化及其抗烟草花叶病毒特性[J].福建农林大学学报(自然科学版),2003,2(1):84—88.[15]付鸣佳,林健清,吴祖建,等.杏鲍菇抗烟草花叶病毒蛋白