发酵工程下游加工过程概论

第十二章发酵工程下游加工过程简介一、发酵工程下游加工过程概论1、发酵工程下游加工过程的特点

1）所需产物在培养液中浓度较低，且稳定性差2）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题发酵液是复杂的多相系统2、发酵工程下游加工过程的一般程序成品加工发酵液的预处理和过滤提取精制采用凝聚和絮凝技术加速固、液分离；如产物在细胞内，还要进行细胞破碎提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质精制（高度纯化）是采用对产品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质最终获得质量合格的产品3、主要操作单元：絮凝离心过滤细胞破碎萃取沉淀层析结晶干燥二、发酵液预处理和过滤为什么要对发酵液进行预处理？预处理的目的是什么？发酵液的基本特性

产物浓度低具有极性黏度大表面张力大性质不稳定一）发酵液的预处理1、目的：

发酵液中杂质多且成分复杂，其中对纯化影响最大的是高价无机离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+等)和杂蛋白等改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；（一般为液相）能够除去部分杂质。2、高价无机离子的去除镁离子的去除：常用草酸与钙离子生成草酸钙沉淀草酸为弱酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸价格较高，生产上一般需回收钙离子的去除：铁离子的去除：常用三聚磷酸钠与镁离子形成可溶性络合物Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na+常用黄血盐与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+3、可溶性杂蛋白的去除

杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的吸附量，如采用溶剂萃取，会发生乳化，影响两相分离。此外，在常规过滤和膜过滤时，还会使滤速下降，使膜受到污染。1）沉淀法

调等电点

因羧基的电离度比氨基大，所以大多数蛋白质的等电点都在酸性范围(pH4.0-5.5)

但仅靠调等电点还不能使大部分蛋白质沉淀蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子物质如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐和过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Pb2+等形成沉淀2）变性法

变性蛋白溶解度较小

最常用加热法

加热不仅能使蛋白变性，还可降低液体黏度，提高过滤速率；

其他方法：

大幅度调节pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂

变性法存在一定的局限

如加热法只适用于对热较稳定的目的产物；极端pH也会导致某些目的产物失活，且需消耗大量酸碱，而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。3）吸附法加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去

如四环素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化钾的胶状沉淀来吸附蛋白；在枯草芽孢杆菌发酵中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去凝聚和絮凝都都是发酵液预预处理的重要要方法，其处处理过程就是是将化学药剂剂预先投加到到悬浮液中，，改变细胞、、菌体和蛋白白质等粒子的的分散状态，，破坏其稳定定性，使它们们聚集成可分分离的絮凝体体，再进行分分离。发酵液预处理理的方法—凝凝聚和絮凝凝聚指在投加的化化学物质（如如水解的凝聚聚剂：铝、铁铁的盐类或石石灰等）作用用下，胶体脱脱稳并使粒子子相互聚集成成1mm大小小块状凝聚体体的过程。电解质的凝聚聚能力可用凝凝聚值表示，，即使胶粒发发生凝聚作用用的最小电解解质浓度（mmol/L）。一般反离子的的价数越高，，凝聚值越小，，即凝聚能力力越强。如Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+絮凝指使用絮凝剂剂（通常是天天然或合成的的大分子量聚聚电解质）将将胶体粒子交交联成网，形形成10mm大小絮凝团团的过程。其中絮凝剂主主要起架桥作作用，工业上上使用到的有有聚丙烯酰胺胺类衍生物、、聚合铝盐、、海藻酸钠、、壳聚糖等，，目前最常用用的是聚丙烯烯酰胺类衍生生物。1）板框(plateandframe)压滤机板框过滤机结构图

1-尾板2-滤框3-滤板4-主梁5-头板6-紧压装置二）发酵液过过滤常用设备备板框过滤机

Plateshifter1500x1500FilterPressClothwashing1）板板框(plateandframe)压滤滤机2）带带式压压滤机机二）发发酵液液过滤滤常用用设备备发酵后后期要要少加加消泡泡剂和和少进进行补补料，，防止止消泡泡剂和和未用用完的的培养养基增增加过过滤难难度；；菌体自自溶前前放罐罐可防防止因因菌体体自溶溶释放放出的的代谢谢产物物增加加发酵酵液黏黏度影响发发酵液液过滤滤的因因素1）菌菌体细细胞体体积真菌菌菌丝体体较粗粗大，，发酵酵液不不需特特殊处处理，，易过过滤；；放线菌菌菌丝丝细而而分支支，交交织成成网格格状，，较难难过滤滤，发酵液液需经经预处处理，，凝固固蛋白白质等等胶体体物质质，提提高过过滤速速度；；细菌菌菌体更更小，，发酵酵液如如不经经絮凝凝等预预处理理，很很难用用常规规过滤滤设备备进行行过滤滤操作作。2）培培养基基组成成黄豆饼饼粉、、花生生饼粉粉等会会增加加过滤滤难度度3）放放罐时时机当发酵酵液中中有不不溶性性多糖糖时，，会使使发酵酵液的的黏度度增大大而影影响过过滤速速度；；可用用酶将将其转转化成成可溶溶性单单糖，，提高高滤速速。提高过过滤性性能的的方法法1）加助助滤剂

助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；

常用硅藻土、珍珠岩等；

加入方法有两种：a)预先在滤布上铺上一层1-2mm厚的助滤剂；b)直接把助滤剂加入发酵液中。2）添加加填充凝凝固剂如CaSO4、AlPO4等本身就就是助滤滤剂，且且能使胶胶状物和和悬浮物物凝固3）酶解解法（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物（加热、调pH、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离)（匀浆、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞内产物提取精制——产品品的收得得率和质质量控制制。细胞破碎碎目的代谢谢产物并并非都是是分泌型型的，许许多是存存在于细细胞内的的，特别别是基因因工程菌菌在细胞胞内形成成的包含含体是不不分泌的的，故需需进行细细胞破碎碎。大规模破破碎细胞胞常用方方法；利用高压压使细胞胞悬液通通过针型型阀，由由于突然然减压和和高速冲冲击撞击击环，造造成细胞胞破碎。。影响破碎的主主要因素是压压力、温度和和循环次数1）高压匀浆浆法高压匀浆器排出阀2）高速球磨磨法高速球磨机1-物料进口2-物料出口3、4-冷却水进、出口5、6-夹套冷却水进、出口由于圆盘的高高速旋转，细细胞悬浮液与与极细的玻璃璃小珠、石英英砂或氧化铝铝一起快速搅搅拌或研磨，，使细胞得以以破碎。3）超声波法法常用超声波频频率15-25kHz；；原理：由于超超声波产生极极为强烈的冲冲击波压力，，引起黏滞性性旋涡在介质质中的细胞上上造成了剪切切力，促使细细胞内液体发发生流动，造造成细胞破碎碎；超声波振荡易易引起温度的的剧烈上升，，操作时需冷冷却；通常杆菌比球球菌易破，阴阴性菌比阳性性菌易破4）酶解法专一性强，条条件温和；但但费用较高酶解法的另一一方式是利用用微生物的自自溶作用大多数微生物物都能产生一一种可以水解解自身细胞壁壁的酶；当改改变一定的环环境条件，可可诱发这种酶酶的过量产生生或激发其他他自溶酶产生生，而发生自自溶现象。5）渗透压冲冲击法将细胞先放入入高渗透压的的介质中，如如高浓度的甘甘油或蔗糖液液，在达到平平衡后，介质质突然被稀释释，或将细胞胞转入水或缓缓冲液中，水水就会迅速进进入细胞内，，致使细胞膨膨胀，引起细细胞壁的破裂裂；此法适用于细细胞壁较脆弱弱的，或者细细胞壁预先用用酶处理的，，或细胞壁合合成受到抑制制的微生物；；6）反复冻结结-融化法将细胞反复在在低温下突然然冷冻后在室室温下融化，，引起细胞破破裂；低温冷冷冻一方面能能使细胞膜的的疏水键结构构断裂，从而而增加细胞的的亲水性能；；另一方面胞胞内水结晶使使细胞内外溶溶液浓度发生生变化，引起起细胞突然膨膨胀而破裂。。该法适用于细细胞壁较脆弱弱的细胞细胞破碎方法法二、提取（初初步分离）（一）沉淀法法（Precipitation））沉淀是通过改改变条件或加加入某种试剂剂，使溶液中中的溶质由液液相转变为固固相析出的过过程。方法简单、成成本低、使用用广泛，初步步分离的常用用手段。盐析法有机溶剂沉淀淀法等电点沉淀法法非离子型聚合合物沉淀法聚电解质沉淀淀法生成盐复合物物沉淀法热变性及酸碱碱变性沉淀法法中性盐的加入入能破坏蛋白质的的胶体性质，使蛋白质的的溶解度降低低而析出。1.盐析法(Saltingout)破坏了蛋白质质在水中存在在的两个因素素(水化层和和电荷),从从而使蛋白质质沉淀。将大量盐加到到蛋白质溶液液中，高浓度度的盐离子（（如硫酸铵的的SO4和NH4)有很很强的水化力力，可夺取蛋蛋白质分子的的水化层，使使之“失水””，于是蛋白白质胶粒凝结结并沉淀析出出。蛋白质盐析常常用的中性盐盐，主要有硫硫酸铵、硫酸酸镁、硫酸钠钠、氯化钠、、磷酸钠等。。盐溶(saltingin)：许多蛋白在低低盐浓度下发发生盐溶现象象（比在纯水水中的溶解度度大大增加））；高盐浓度则盐盐析，离子强强度越大，蛋蛋白质的溶解解度越低；由于各种蛋白白质分子颗粒粒大小、亲水水程度不同，，故盐析所需需的盐浓度也也不一样，因因此调节混合合蛋白质溶液液中的中性盐盐浓度可使各各种蛋白质分分段沉淀。1）蛋白质浓浓度蛋白质浓度高高时，欲分离离的蛋白质常常常夹杂着其其他蛋白质地地一起沉淀出出来（共沉现现象）。因此此在盐析前血血清要加等量量生理盐水稀稀释，使蛋白白质含量在2.5-3.0%。2）离子强度度和种类3）温度温度是影响溶溶质溶解度的的重要因素，，升高温度可可以增加许多多无机盐和小小分子有机化化合物的溶解解度；4）pH由于蛋白质在在等电点时最最易沉淀，故故可选择等电电点的pH作作为盐析pH影响盐析的因因素2.等电点沉沉淀法原理：利用两性电解解质在电中性性时溶解度最最低优点：许多蛋白的等等电点都在偏偏酸范围内，，而许多无机机酸的价格低低廉；缺点：酸化时易引起起蛋白失活不少蛋白质与与金属结合后后会发生等电电点偏移，如如胰岛素的等等电点为5.3，在与Zn2+结合形成胰岛岛素锌盐，其其等电点升为为6.2；故故加入金属离离子后选择等等电点沉淀时时，要注意调调整pH。二、提取（初初步分离）（二）结晶法法（crystallization）物质从液态（（液体或熔融融体）或气态态形成晶体的的过程叫结晶。加入能使结晶晶溶质溶解度度降低的物质质，让结晶溶溶质形成过饱饱和液；例如卡那霉素素不溶于乙醇醇，向卡那霉霉素脱色液中中加入终浓度度为60%-80%的乙乙醇，就结晶晶析出;在普鲁卡因青青霉素结晶时时，加入一定定量的食盐，，可使结晶更更易析出结晶方法（过饱和溶液液形成的方法法）1）浓缩结晶晶减压蒸发浓缩缩，达到过饱饱和2）冷却结晶晶适用于溶解度度随温度变化化很大的物质质；先加热使使其溶解，然然后冷却结晶晶；3）化学反应应结晶加入反应剂或或调pH，使使生成更低可可溶性物质；如在青霉素醋醋酸丁酯提取取液中，加入入乙醇-醋酸酸钾，因形成成的青霉素钾钾盐难溶于醋醋酸丁酯而结结晶析出。4）解析结晶晶（drowningout）三、精制（高高度纯化）（一）离子交交换法(Ionexchange)离子交换工作作原理根据物质的酸酸碱性、极性性不同，在水水溶液中所带带阴阳离子不不同，电荷不不同的物质对对层析柱上的的离子交换剂剂有不同的亲亲和力，改变变洗脱液的离离子强度或pH，不同物物质就能依次次从层析柱中中分离出来。。在离子交换过过程中，离子子首先扩散到到树脂表面，，通过树脂扩扩散到交换位位置，在交换换位置进行离离子交换。被被交换的分子子所带电荷越越多，它与树树脂的结合越越紧密，也就就越不容易被被其它离子所所取代。被交交换的离子扩扩散到树脂表表面，洗脱液液通过，被交交换的离子扩扩散到外部溶溶液中。三、精制（高高度纯化）（二）色谱分分离法用微量注射器器针头或微细细管把样品点点一小点在层层析床的一端端。要求层析析床必须完全全干燥，点样样之后转入装装有展层剂的的玻璃槽中。。当展层剂的的前沿跑到滤滤纸全长的80％-90％时，将层析析床取出。纸层析可以用相对迁移率（（Rf）来表示一种物物质的迁移：：或者也可以用用相对于一种已已知迁移率的的标准物的迁迁移（Rx））来表示：待测物移动的距离标准物移动的距离Rx=组分移动的距离溶剂移动的距离Rf=薄层扫描仪快速；可用腐蚀性试试剂显色；易于制备少量量样品。薄层层析十六元环大环环内酯类抗生生素的薄层色色谱图1:乙酰螺旋霉素素;2:麦迪霉素;3:麦白霉素;4:吉他霉素;5:乙酰吉他霉素素9、静夜四无邻邻，荒居旧业业贫。。12月-2212月-22Wednesday,December21,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。21:28:0421:28:0421:2812/21/20229:28:04PM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2221:28:0421:28Dec-2221-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。21:28:0421:28:0421:28Wednesday,December21,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2221:28:0421:28:04December21,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。21十十二二月20229:28:04下下午21:28:0412月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月229:28下下午12月-2221:28December21,202216、行动出成成果，工作作出财富。。。2022/12/2121:28:0421:28:0421December202217、做前，能能够环视四四周；做时时，你只能能或者最好好沿着以脚脚为起点的的射线向前前。。9:28:04下下午9:28下下午21:28:0412月-229、没没有有失失败败，，只只有有暂暂时时停停止止成成功功！！。。12月月-2212月月-22Wednesday,December21,202210、很多多事情情努力力了未未必有有结果果，但但是不不努力力却什什么改改变也也没有有。。。21:28:0421:28:0421:2812/21/20229:28:04PM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。12月月-2221:28:0421:28Dec-2221-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。21:28:0421:28:0421:28Wednesday,December21,202213、不知知香积积寺，，数里里入云云峰。。。12月月-2212月月-2221:28:0421:28:04December21,202214、意意志志坚坚强强的的人人能能把把世世界界放放在在手手中中像像泥泥块块一一样样任任意意揉揉捏捏。。21十十二二月月20229:28:05下下午午21:28:0512月月-2215、楚楚塞塞三三湘湘接接，，荆荆门门九九派派通通。。。。。十二二月月229:28下下午午12月月-2221:28December21,202216、少年十十五二十十时，步步行夺得得胡马骑骑。。2022/12/2121:28:0521:28:0521December202217、空山山新雨雨后，，天气气晚来来秋。。。9:28:05下下午9:28下下午午21:28:0512月月-229、杨柳散和和风，青山山澹吾虑。。。12月-2212月-22