药物分析 04第四章 药物定量分析与分析方法验证课件

第四章

药物定量分析与分析方法验证基本要求

一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分中的应用。

第四章药物定量分析与分析方法验证定量分析样品前处理方法

定量分析方法特点

药品质量标准分析方法验证123定量分析样品前处理方法直接测定法－含金属或C-M不牢固的有机金属经水解后测定法－卤素联脂肪碳链（溶于适当溶剂再水解）直接回流后测定 碱化回流后测定硫酸水解后测定经氧化还原后测定法－卤素联芳环牢固（一般用于测碘）碱性还原后测定法－如泛影酸利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量不经有机破坏的分析方法:（一）直接测定法例如：富马酸亚铁

溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂邻二氮菲与亚铁离子的配合物显红色，化学计量点后，指示剂中的Fe2+→Fe3+，生成邻二氮菲铁，显淡蓝色指示终点。

2FeS04+2Ce（S04）2→Fe2（S04）3+Ce2（S04）3（二）经水解后测定法

1.碱水解后测定法例如：三氯叔丁醇的含量测定

CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH(CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2ONaCl+AgNO3AgCl+NaNO3AgNO3+NH4SCNAgSCN+NH4NO3

2.酸水解后测定法例如：硬脂酸镁的含量测定

Mg(C17H35COO)2+H2SO4

MgSO4+2C17H35COOH

H2SO4+2NaOHNa2SO4

+2H2O

△（三）经氧化还原后测定法碱性还原后测定例如：泛影酸的含量测定

碱性条件下Zn还原，生成无机碘化物，用银量法测定

空心A.燃烧瓶B.铂丝网C.D.盛固体样品滤纸及其折叠法E.F.G.称取液体样品方法7mm50mm30mm尾部7mm13mm20mm25mm356mm166mm滤纸滤纸AGFEDCB氧瓶燃烧装置及称样方法碘苯酯含量测定

取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用NaOHT.S.2ml与H2O10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液10ml，密塞，振摇放置数分钟，加甲酸约1ml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约3~5min，以除去剩余的溴蒸气，加KI2g，密塞，摇匀，用Na2S2O3液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml的硫代硫酸钠液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2（二）容量分析法的计算问题

1.滴定度（T）的概念每1ml溶液相当于被测物质的量(mg)2.滴定度的计算aA+bBcC+dD

T=M×a/b×m

3.百分含量的计算（1）直接滴定法D%=V×F×T/W×100%

F=实际标定的浓度/规定的浓度

（2）间接滴定法（回滴定法；剩余滴定法）

D%=（VO

–

VB)×F×T/W×100%

二、光谱分析法

（一）紫外-可见分光光度法（200nm～760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml1.特点准确度高，SRD（%）为2%～5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范围广。2.朗伯-比耳定律A=ECLE1%1cm=ε×10/M

3.仪器校正和检定

波长校正用汞灯中较强谱线237.38,253.65,275.28,296.73,313.16,334.15,365.02,404.66,425.83,546.07nm与576.96nm

或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/LH2SO4液至1000ml

波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大)

E1%1cm124.5144.048.62106.6

杂散光检查：试剂浓度(g/ml)测定波长透光率(%)

NaI1.00220nm＜0.8NaNO25.00340nm＜0.84.对溶剂的要求:220～240nm241～250nm251～300nm300nm以上溶剂+吸收池A＜0.41＜0.20＜0.10＜0.05

5.测定方法：要求供试品溶液的A应在0.3～0.7

标准曲线法常用方法：对照品比较法：Cx=(Ax/Ar)Cr;含量%=Cx×D/W×100%吸收系数法：含量%=(E1%1cm

)x/(E1%1cm

)r×100%

计算分光光度法：VA的三点校正法（二）荧光分光光度法

灵敏度高，可达10-10g/ml～10-12g/ml

在低浓度进行测定，防止F与C不成正比及自熄灭作用1.特点用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品液荧光衰减灵敏度高，但干扰因素多。

制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选择性。用样品量少，操作简单，方法快速，应用范围较广。

三、色谱分析法

按分离原理分为：吸附；分配；离子交换；排阻色谱方法分类按分离方法分为：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC。

（一）HPLC法1.对HPLC仪器一般要求色谱柱、流动相按品种项下要求。色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)22.系统性试验分离度：R=2（tR1–tR2)/(W1+W2);要大于1.5拖尾因子：T=W0.05h/2d1

应在0.9～1.05

内标法加校正因子测定供试品中主成分含量3.测定方法

标准曲线法

外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：RP-HPLC法测定盐酸黄酮哌酯片含量，用标准曲线法如头孢拉丁；头孢羟氨苄；头孢唑啉钠用外标一点法内标法加校正因子测定供试品中主成分含量

3.测定方法

标准曲线法

外标法测定供试品中主成分含量外标一点法应用示例：Ch.P(2000)收载的月桂卓酮、维生素E及其片剂、注射剂、甲酚皂溶液等均采用GC法中的内标法加校正因子测定含量。药品质量标准分析方法验证

指导原则药品质量标准分析方法验证药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则药物稳定性试验指导原则缓释、控释制剂指导原则微囊、微球与脂质体制剂指导原则细菌内毒素检查法应用指导原则(1)准确度（accuracy）：测量值与真实值接近的程度表示:回收率测定方法：回收试验加样回收试验1.原料药可用已知纯度对照品或样品进行测定；或与已建准确度的另一方法测定的结果进行比较。2.制剂要考察辅料对回收率的影响。采用在空白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试验，然后计算RSD。

具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率的RSD＜2%；用UV和HPLC法时，一般回收率可达98%～102%；容量法可达99.7%～100.3%

回收率%=（测定平均值—空白值）/加入量×100%要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。(3)专属性（specificity）:

指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。含量测定和杂质测定:

色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。鉴别反应:应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。(4)检测限（limitofdetection，LOD）：药物能被检出的最低浓度(µg/ml)

测定:信噪比法(S:N=3:1)(5)定量限（1imitofquantitation，LOQ）：药物能被定量测出的最低浓度(µg/ml)

测定:信噪比法(S:N=10:1)药品质量标准分析方法验证

------------性能指标(6)线性与范围（linearityandrange）：待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围线性关系：Y=a+bx（r=0.9999)

线性程度：相关系数(7)耐用性（robustness）:

测定条件稍有变动时，对测定结果的影响程度影响因素：被测溶液的稳定性，流动相的组成和pH，商品柱的品牌，柱温等药品质量标准分析方法验证

------------性能指标检验项目和验证内容：项目内容鉴别杂质测定含量测定及溶出量测定定量限度准确度＋＋精密度－＋重复性＋＋中间精密度

＋①

＋①

专属性②＋＋＋＋检测限

－③＋－定量限＋－线性＋＋范围＋＋耐用性＋＋＋①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充③视具体情况予以验证生物样品分析的基本步骤1.药物从蛋白结合或缀合物中释出⑴蛋白变性：如应用三氯醋酸、HClO4、有机溶剂(乙醇、丙酮、乙腈)使蛋白沉淀⑵盐酸水解⑶酶消化法：最常使用蛋白水解酶中枯草菌溶素(一种细菌性蛋白分解酶，可在pH7.0~11.0使肽键降解)定量分析方法的验证

----------生物样品分析（一）特异性 内源性物质不得干扰原药、代谢物（二）标准曲线

r≥0.9900，至少5个浓度，不许外延（三）精密度和准确度

RSD≤15％、20％ 相对回收率85～115％（80～120％）（四）最低定量限LOQ 3~5倍t1/2，或1/10～1/20倍Cmax（五）样品稳定性 室温、冻融、冰冻长期（六）提取回收率（绝对回收率） 一般低于100％，须稳定（七）质控样品 已知浓度样品均匀放入待测生物样品序列中，以确保定量测定的准确度定量分析方法的验证

----------生物样品分析样品固相净化

及反相高效液相色谱法

测定血浆中茶碱伍朝筼等药学学报,1989,24(10):769~773血浆样品净化后空白血浆净化前空白血浆ColumnZorbaxC185µm2.5cm4.6mm254nmPrecolumnYWG-ODS9-11µm54.6mmMobilePhase:甲醇-醋酸钠(0.05mol/LpH3.0)50׃5012840min茶碱咖啡因12840min12840min50100150200252015105茶碱(µg/ml)(min)·······················五例病人血浆茶碱浓度测定6.412.819.225.63232.41.81.20.60茶碱(µg/ml)·····标准曲线Y=9.56610-2X+6.15310-3

r=0.9995练习与思考[A型题]

1．药品的鉴别是证明A．未知药物的真伪B．已知药物的真伪C．已知药物的疗效D．药物的纯度E．药物的稳定性2．相对标准差表示的应是A．准确度B．回收率C．精密度D．纯净度E．限度3．用移液管量取的25ml溶液，应记成A．25mlB．25.0mlC．25.00mlD．25.000mlE．25±1ml4．以下三个数字0.5362、0.0014、0.25之和应为A．0.79B．0.788C．0.787D．0.7876E．0.85．表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A．相关规律B．比例常数C．相关常数D．相关系数E．精密度6．减小偶然误差的方法是A．做空白试验B．做对照实验C．做回收试验D．增加平行测定次数E．选用多种测定方法[B型题]

1～4A．1.23B．1.22C．2.54D．2.53E．2.511．1.22522．2.53513．2.53484．2.5068ACDE

5～8A．空白试验B．对照试验C．回收试验D．鉴别试验E．检测试验5．以同量的溶剂替代供试品同法