医学蛭类与水蛭素参考模板

46/46医学蛭类与水蛭素蛭类动物在我国俗称蚂蟥、水蛭、马鳖等，全世界有六百余种，我国也有近百种。它们生活在淡水、潮湿的陆地以及海水里，作为暂时性体外寄生虫有的取食鱼、龟、鳖、蛙、水鸟以及像牛、马和人这样一些哺乳动物的血液，也有的取食蚯蚓、昆虫幼虫、虾、蟹和螺、蚌之类的无脊椎动物的体液、组织以致整个身体。我国对蛭类动物的记载早在公元前2世纪汉朝初期的《尔雅》中已经出现，对水蛭的应用在《神农本草经》中记述较为详细，谓其“主逐恶血、瘀血、月闭、破血消积聚┅┅┅┅”。医圣张仲景（168-188）的《金匮玉幽经》里所谓“下血”即是抗凝血的“破血”作用，由此可见我国早在公元2世纪便已发现水蛭的抗凝血功能了，这比西方国家利用水蛭的历史要早千年以上。到15世纪我国明朝李时珍著的《本草纲目》中则对水蛭在内科方面的药效作了详细的说明，并列举出不少的民间处方，主要用来治疗女子月闭、跌打损伤、漏血不止以及产后血晕等症。古籍中还记载有把饥饿的蚂蟥装入竹筒扣在洗净的皮肤上，令其吸食脓血以治疗赤白丹肿以及将蚂蟥研成干粉末与其它中药配伍治疗跌打损伤等症。自梁代陶弘景《本草经集注》以后历代的《本草》中都认为中药用的蚂蟥是指吸哺乳动物血液的种类。不管是水蛭、草蛭、山蛭、泥蛭，在吸牛、马和人血这一点上是共同的，而且强调“用之当以小者为佳”。但是我国早期的文献不可能说清楚使用吸食哺乳动物血液的蚂蟥治病的道理，以致在现今的《中国药典》中仍然将不吸哺乳动物血液的宽体金线蛭（Whitmaniapigra）和尖细金线蛭（Whitmaniaacranulata）列为规定的种类，用作传统中药材,谓其功能是破血通经，消积散瘀，消肿解毒和堕胎。在第二届全国活血化瘀学术会议上，还笼统地将主要是宽体金线蛭的水蛭确定为35味活血化瘀中药之一，归属于“作用峻裂的破血药范畴”，这些都是缺乏科学依据的，也给水蛭的医药应用造成了很大的混乱。笔者曾对我国安徽亳州、河南禹州、四川成都荷花池和湖北蕲春几个主要中药材市场销售的水蛭以及近十种水蛭中成药的原料作了调查，发现这些全都是一种不吸哺乳动物血液，终身取食螺类，主要生活在我国山东、江苏、安徽和湖北广大湖区以及长江流域及其以北各地河滩与池塘里的宽体金线蛭，全国每年消耗数以十吨计的干品，不断地捕捉大大破坏了这个物种在自然界的资源分布，同时也是与我国古代《本草》中的记载以及现代生物医药研究成果不相符的。造成这种现状的原因在于我国中医药管理、研制和临床应用部门缺乏对蛭类动物生物学与生物化学的深入认识，不知道在动物分类学上是环节动物门一个纲的蛭类动物在我国就有近百个种，它们分属于不同的目、科和属，在形态结构、取食习性、生活环境以及体内所含生物活性物质的结构和功能方面都是十分不相同的。几个世纪以前西欧国家也开始使用水蛭治疗心血管病、神经系统病、炭疽、青光眼和乳突炎等病。18-19世纪医蛭吸血法在欧洲曾风行一时，随着科学的进步，这种带有迷信色彩的治疗方法才逐渐被放弃了。近百余年来，随着西方国家首先对吸食哺乳动物血液的水蛭唾液腺分泌物的深入研究，人们又发现了它们在医疗临床上的许多新用途。1884年威尔士国家医学院海克拉夫特（J.B.Haycraft）首先发现吸血水蛭咽部具有的水溶性抗凝血物质。1904年雅各比（C.Jacoby）将这种物质命名为“水蛭素”（Hirudin）。1955年德国马克沃德特（F.Markwardt）首次从吸血水蛭体内分离提取出较纯的水蛭素，此后对水蛭素的纯化和标准化技术日臻完善。迄今已有十多个国家公布了水蛭素研究的专利并有英国水蛭生物药物公司（BiopharmUKLtd）、美国水蛭公司（LeechesU.S.A.Ltd）以及美国Sigma生化试剂公司等多家公司在销售不同纯度的天然水蛭素以及其它水蛭产品。研究表明水蛭素是已知最有效的天然凝血酶抑制剂，在治疗某些血液性疾病方面优于肝素，能够更有效地抑制凝血酶诱发的弥散性血管内凝血和静脉血栓形成，在处理诸如败血休克、动脉粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、眼科以及遗传性疾病等缺少抗凝血酶Ⅲ的病例方面显示出巨大的优越性，从而引起各国医药和生物学工作者的广泛重视。除此以外，各国科学家还在吸血水蛭唾液腺分泌物中发现了许多与吸食哺乳动物血液相关联的生物活性物质，如麻醉剂（Anaesthetic）、血管扩张剂（Vasodilator）、水蛭透明质酸酶（Hyaluronidase,HAse）、裂纤酶（Hementin）、前列腺素（Prostaglandins）、抗生素（Antibiotic）、安替斯塔辛（Antistasin）以及博待啉（Bdellins）和伊格啉（Eglins）等其它蛋白酶抑制剂。目前国际上是将吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情景的蛭类动物统称为医学蛭类。1986年至1990年先后在英国威尔士的斯旺西市、加拿大的多伦多市以及耶路撒冷召开了国际水蛭科学家学术讨论会，笔者应邀出席了其中两次会议并在会上发言介绍了我国蛭类动物研究概况。1990年至2003年先后六次在欧洲各地召开了包括医学蛭类在内的国际生物治疗学术讨论会。然而至今我国没有任何人报道过宽体金线蛭和尖细金线蛭体内含有以上任何生物活性物质，它们也不吸食哺乳动物的血液，所以在本书中笔者未将其归入医学蛭类的范围加以介绍。我国有着丰富的吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用情景的医学蛭类有待我们去开发和利用，现将这些医学蛭类的种类特征和生态分布列述如下。

9.2

我国医学蛭类的种类特征和生态分布蛭类动物（Hirudinea）在动物分类系统中与寡毛类动物（Oligochaeta）作为两个纲划归环节动物门（Annelida）的有环带亚门（Clitellata）。它们都具有环带，又都是雌雄同体动物并通过分泌容纳受精卵的卵茧（cocoon）繁殖后代，胚胎发生也相同，都缺少外骨骼和功能性的叶足。在蛭纲中较高等的类群都有恒定的体节数而且又都具有用作运动器官的尾吸盘，其中真蛭亚纲（Euhirudinea）是主要的类群。它们都有32个口后节，尾吸盘又都由7节组成，根据有无可伸缩的吻可以分成为吻蛭目（Rhynchobdellida）和无吻蛭目（Arhynchobdella）。在无吻蛭目中医蛭形亚目（Hirudiniformes）较低等，多数有发达的颚，每个完全体节通常5环或更少。笔者在本书中讨论的我国医学蛭类就属于医蛭形亚目医蛭科（Hirudinidae）中的医蛭属（Hirudo）和牛蛭属（Poecilobdella）以及山蛭科（Haemadipsidae）中的山蛭属（Haemadipsa）。根据笔者统计，目前我国已发现医蛭属2种、牛蛭属6种、山蛭属10种，它们在医药上都具有广阔应用情景，现将这3属医学蛭类主要种类的形态特征及其生态分布列述如下。

(一)医蛭属HirudoLinnaeus,1758体中型至大型，长度30-150毫米。背面通常有纵行的条纹。头部背面有5对眼，甚明显。体表感觉乳突通常背面8列，腹面6列。节IX至XXIII或XXIV为完全体节，每节5环相等。环带占据15环，位于X至XIII。体内嗉囊在节X至XIX之间，每节各有一对大的初生侧盲囊和一对小的次生侧盲囊，末对最大并向后伸至节XXV。水生种类，已知全世界有17种，我国仅有2种，其区分见以下检索表。

医蛭属分种检索表1（2）

背面黄白色纵纹宽阔，灰绿色的纵纹狭窄，腹侧各有一条很细的灰绿色的纵纹，

阴道囊狭长┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本医蛭Hirudonipponia2(1)

背面冬青绿色纵带宽阔，淡绿色的纵纹狭窄，腹侧没有细长的纵纹，阴道囊卵

圆形┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅丽医蛭Hirudopulchra

日本医蛭HirudonipponiaWhitman,1886（图9-1）身体狭长，略呈圆柱形，背腹稍扁平。体长30-60毫米；最大体宽4.0-8.5毫米；尾吸盘直径40-5.5毫米。头部背面有5对眼，大而明显，在节II-VI背侧排列成弧形。前3对各占一环；第3，4对相隔一环；第4，5对相隔2环。背面有5条黄白色的纵纹，以中间一条最宽和最长。黄白色的纵纹又将灰绿的底色隔成6道纵纹，以背中两条最宽阔，背侧的两对较细。腹面两侧缘，各有一条很细的灰绿色纵纹。雄性生殖孔位于第31/32环沟上，雌性生殖孔位于第36/37环沟上，两孔相隔5环。咽部有6条内纵褶，背中及腹侧各一对。阴道囊狭长。本种在我国分布很广，北起东北各省和内蒙古，西至四川和甘肃，南达台湾和广东，但以长江流域各地数量较多。广泛栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，特别是常年积水或排水不良的沤田和坂心田中数量最多。在水田里多集中在四角或田边，也有钻进田埂泥土中的。每年11月底开始潜入深土中越冬，第二年3月下旬到4月上旬，当气温达到10-13℃时开始出土活动。在长江中、下游地区，当气温升至13-15℃时开始交配，约经一个月后开始产茧，再经过16-25天孵化，幼蛭即可以从茧中钻出。通常每茧孵出3-22条幼蛭，多数10条左右。日本医蛭是被中国药典列入的唯一吸食哺乳动物血液的种类，也是具有很好医疗效果的种类，可以用于显微外科手术后的吸血治疗以及水蛭素、水蛭透明质酸酶等生物活性物质的分离和提取。

图9-1日本医蛭HirudonipponiaWhitman,1886背面观全形图

an.肛门；cs.尾吸盘；eyes眼；ggs.灰绿色的纵纹；

sen.体表感觉乳突；yws.黄白色纵纹.(笔者图，1996)

（二）牛蛭属PoecilobdellaBlanchard,1893身体中等大小至大型，长度40-210毫米，体形粗壮。皮肤粗糙，前后端成网状或有许多疣状突起。体色艳丽，有线形色斑或条纹，具有绿色、褐色或淡红颜色。头部背面5对眼，排列如医蛭属。共有15个完全体节，各有5环，在节IX至XXIII之间。体节感觉器大而明显，是区分体节的标记。两生殖孔被5-9环隔开，分别位于节IX–XIII上。具齿的颚两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突。雌性生殖器官很特殊，有一个很大的盲囊，阴道长短不一。总输卵管与阴道一起开口向外，或开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上。水生种类，已知全世界有8种，我国已发现6种，主要分布在广东、广西、云南、海南以及福建等地，其区分见以下检索表。

牛蛭属分种检索表1（5）

阴道短，总输卵管与其一起开口向外┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅22（3）

两生殖孔被7环隔开，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上，尾吸盘直径等于体宽

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅棒纹`牛蛭Poecilobdellajavanica3（4）

两生殖孔被5环隔开，雌生殖孔在节XII的b5/b6上，尾吸盘直径小于体宽

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅菲牛蛭Poecilobdellamanillensis4（3）

两生殖孔被9环隔开，雌生殖孔在节XIII的b2/a2上，尾吸盘直径接近体宽

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅远孔牛蛭Poecilobdellasimilis5（1）

阴道有长柄，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端，或直接开口到盲囊上┅66（7）

阴道柄几乎与盲囊及阴道管的长度相等，总输卵管开口到远离盲囊的阴道管端

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅颗粒牛蛭Poecilobdellagranulosa7（8）

阴道盲囊呈卵圆形，总输卵管直接开口到靠近阴道管的盲囊部位┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅湖北牛蛭Poecilobdellahubeiensis8（7）

阴道盲囊呈棒槌形，总输卵管直接开口到远离阴道管的盲囊部位

┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅南京牛蛭Poecilobdellananjingensis

菲牛蛭Poecilobdellamanillensis(Lesson,1842)(图9-2)个体较大，体长40-113毫米或更长；最大体宽3..5–20毫米；尾吸盘直径3–14毫米，明显小于体宽。身体狭长且扁平。活着时背面黄褐色或橄榄绿色，背中有一条不显著的兰灰色纵纹，体表皮肤体节感觉器大而明显。两生殖孔通常被5环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XII的b5/b6上。尾吸盘直径明显小于体宽。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有150个锐利的齿。射精管粗大，呈纺锤形。精管膨腔短，呈圆球形并被一层疏松的腺体覆盖着。阴道短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国分布很广，北起浙江南部、福建、台湾、广东、广西、海南和香港均有发现，以两广和海南各地数量较多。生活于水田、沟渠或池塘里，主要吸食水牛和人的血液，造成危害。每当插秧或在水田边洗手造成水的波动时，菲牛蛭随即漂游而来，甚至顺着稻丛爬到人的手上吸血，吸饱血液后有的离去，有的前吸盘松开就像葫芦状悬挂在牛的肚皮下。吸一次血可以一年多不再吸血，只要有水仍能够活得很好。据中国中医研究院基础理论所欧兴长等人的研究证明菲牛蛭所含氨基酸总量为73.11%，在所测十种水蛭中含量最高，其抗凝血酶活性（176抗凝单位/克），在所测四种水蛭中最高。可见用菲牛蛭来分离和提取水蛭素等生物活性物质将是十分有前景的。图9-2菲牛蛭Poecilobdellamanillensis(Lesson,1842)a.背面观全形图χ2；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ6

an.肛门；cod.总输卵管；cs.尾吸盘；de.射精管；eb.射精球；ep.贮精囊；

eyes

眼；ga.

蛋白腺；o.卵巢；od.

输卵管；pr.前列腺；sp.侧中斑点；

sen.

体节感觉器；ss.上缘斑点；vad.

阴道管；vc.

阴道盲囊；vd.输精管。

（笔者图，1996）

棒纹牛蛭Poecilobdellajavanica

(Wahlberg，1855)（图9-3）图9-3

棒纹牛蛭Poecilobdellajavanica

(Wahlberg，1855)

a.背面观全形图χ1.5；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ4.5

an.肛门；at.精管膨腔；bas.棒纹；cod.总输卵管；cs.尾吸盘；

de.射精管；ep.贮精囊；eyes

眼；ga.蛋白腺；o.卵巢；od.

输卵管；ps.阴茎囊；sp.侧中斑点；qs.方形侧缘黑斑；sen.体节

感觉器；te.精巢；vad.

阴道管；vc.

阴道盲囊；vd.输精管。

（a.笔者图；b.自宋大祥等，1978）个体很大，体长60–170毫米或更长，个别的可达225毫米；最大体宽为10–19毫米；尾吸盘直径10–19毫米，常常等于最大体宽。身体狭长且扁平。活着时体表颜色极为艳丽，背面橄榄绿或草绿色，偶尔橄榄棕色。背中自眼间区至肛门前，有一断裂为22根棒的黑褐色纵纹。两生殖孔通常被7环隔开，雄生殖孔在XI的b5/b6上，雌生殖孔在节XIII的b1/b2上。皮肤感觉器非常地大而明显，伸长并与体轴倾斜或成直角。皮肤成网状，特别是在身体的两端。尾吸盘很大，直径常常等于最大体宽的宽度。颚很大，两侧表面有排列成3或4纵列的唾液腺乳突，通常颚脊上约有100-140个锐利的齿。精管膨腔很短，具有比较宽的阴茎囊。阴道也短，没有柄，总输卵管与其一起开口向外。本种在我国云南西南部地区，如西双版纳等地广泛分布，栖息于水田及其与之相通的沟渠、池塘和沼泽中，数量众多。这些孽生地杂草丛生，水流缓慢或停滞。平时它们潜伏在草丛中，当人、畜下水产生水波时立即漂游而来并爬到人、畜身上吸血，直至饱食后离去。雨季本种牛蛭最为繁盛，而在干旱季节里则极少见到，通常潜伏在泥草里越冬。（三）山蛭属HaemadipsaTennent,1859身体小而细长，呈亚圆柱形，从尾吸盘至头部渐渐变细，大小与形状又随取食程度而改变，通常8–50毫米长。棋盘格形的皮肤，特别是在头部及尾吸盘上最明显。头部背面有5对大眼，分别位于第2、3、4、5、8环上或2、3、4、6、9环上，第4、5对眼被2环隔开。身体背面通常有纵纹及斑点。完全体节有5环。两生殖孔通常被5环（节XIb5/b6和节XIIb5/b6）隔开，但少数种可能被更多的环隔开。尾吸盘巨大，在其背侧与体部交界处有2或3对叶状的耳状突，腹面有许多明显的辐射肋。口内有3个非常高而明显的颚，但其上没有唾液腺乳突，具有锐利并弯曲排列的细齿。射精球不发达，呈梨形的精管膨腔小，其表面覆盖有疏松的腺体。阴道分成为狭窄的管部和大而呈圆柱形的盲囊。已知全世界有12种和8亚种，我国已发现9种和2亚种，主要分布在华南和西南一些潮湿的山林地区，其区分见以下检索表。山蛭属分种检索表1（2）在第3和第4眼之间几乎总被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋74–76

条┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

32（1）在第3和第4眼之间可以或不被多角形小区隔开，尾吸盘腹面通常有辐射肋71–

73条┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

43（6）背部有3条黑色或暗褐色条纹，中央一条狭细，有时断裂或完全消失┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅森林山蛭Haemadipsasylvestris4（5）身体通常红褐色或橙色，具有黑色斑，背中有一条黄色或黄绿色条纹┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，模式亚种Haemadipsazeylanicazeylanica5（8）身体颜色通常易变，但褐色斑点图案不变，背中较暗的区域有一条黑色或褐色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅斯里兰卡山蛭，敏捷亚种Haemadipsazeylanicaagilis6（7）背部有3条深褐色条纹，中央一条完整，贯穿前后

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅日本山蛭Haemadipsajaponica7（8）背中及两侧缘上方有3条黑褐色条纹，中央一条粗大┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅珠峰山蛭Haemadipsaqomolangma8（9）背中黄褐色带状区的边缘有由17对弧形线联结成的两条黑褐色条纹，中央尚有一

根细条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅盐源山蛭Haemadipsayanyuanensis9（10）背中宽阔的淡黄色带状区的边缘有的地方突向外侧区内，中央及其两侧有3条

较细的棕色条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅海南山蛭Haemadipsahainana10（11）背中较宽的浅色带状区两侧共有6条粗而直的黑色条纹，无中央条纹┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅天目山蛭Haemadipsatianmushana11（12）背中宽阔的乳白色带状区共有5个条纹并在各节上有凸向外的斑块，中央一条

狭细┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

广川山蛭Haemadipsaguangchuanensis12（11）背中乳白色带状区无中央条纹，内背侧一对纵纹粗而直，外背侧一对纵纹细

┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅┅

盐边山蛭Haemadipsayanbianensis

日本山蛭HaemadipsajaponicaWhitman,1886(图9-4)身体短小，略呈圆柱形，前半部逐渐变得狭细。体长10–36毫米；最大体宽2–5毫米；尾吸盘直径2.0–4.5毫米。体色黄褐，背面有深褐色的纵纹3条，中央一条较粗并贯穿身体前后，腹侧没有两条纵纹。头部背面有5对排列成弧形的大眼，分别位于第2、3、4、5和8环的背侧，第3、4对眼常在连续的环上。完全体节各有5环，共有14节。雄生殖孔位于节XIb5/b6环沟上，雌生殖孔位于节XIIb5/b6环沟上，两孔相隔5环。肛门在最后一环与尾吸盘交界线上。尾吸盘腹面通常有74–76条辐射肋。贮精囊甚大，呈U形来回折叠。阴道囊是一薄壁的葫芦形盲囊。本种在我国主要分布于云南西部及西南部（如西双版纳等地区）、四川西南部，以及台湾的山地。营陆地生活，栖息温暖、潮湿的山谷和坡地树林中，在高山围成的平坝地带最多，也见于池塘、溪沟的岸边和稻田田埂杂草丛以及竹林中，但决不在平原上活动，不水溪亦不会游泳。一般呈点状或块状分布，每平方米的杂草、石头、泥土范围内可以采集到上百条之多。平时潜伏在草丛根基部分，石缝内，苔藓或落叶与枯枝上。离人、畜1米远以外即能感觉得到，动作十分敏捷，雨天时更为活跃。在夏秋两季当早晨雾水多时或雨后也极为活跃，靠近中午或下午太阳暴晒时以及干旱季节里则极少出来活动。在5–9月的雨季里山蛭进行繁殖孳生，7月初可见到幼蛭，特别是8月初最多。每下一场雨即孵化出一批幼蛭，长约5–9毫米，呈圆柱形，生长迅速。在10月至次年3月的旱季里极少见到日本山蛭，通常从11月起在靠近积水的潮湿土里或石缝里蛰伏，次年4–5月才出蛰活动。

天目山蛭HaemadipsatianmushanaSong,1977（图9-5）身体中等大小，呈圆锥形，背面隆起，腹面平坦。体长11–36毫米；最大体宽2.5–6毫米；尾吸盘直径2–6毫米。活体时背面棕色或灰褐色，有许多不规则的灰黑色或黑色斑点。背中有一条较宽的浅色的带状区，其两侧共有6条3对粗而直的黑色纵纹。背侧区色深，多黑褐色斑点。腹面有咖啡色的斑点或由斑点聚集成的斑块，腹侧有两对平行的棕色纵纹，腹中为一条狭窄的银白色区带。贮精囊在远离射精球的地方螺旋盘绕。阴道囊粗而短，前部有一狭窄的颈部。本种仅见于我国，广泛分布在华东、华中、华南以及西南一些潮湿的山地丛林里。先后在浙江天目山、湖北神农架、河南太行山和大别山的南麓、四川峨眉山和盐边县、广东高州县以及海南岛发现。栖息于海拔600–2200米山地温暖、潮湿、阴暗的原始森林、灌木丛、冷竹林、溪边草丛和草坡上，尤其以小道旁边和枯枝落叶中较多。活动季节一般在每年4月下旬够至9月中、下旬，但以6月下旬至8月中、下旬小雨、雨后或者晨露未干之前时数量最多，也极为活跃。夏季至秋初在石块下、枯枝落叶中、草丛和松土内以及地表丛生的苔藓中产茧。冬季仅偶而见与青苔和草被的下面。

图9-4

日本山蛭HaemadipsajaponicaWhitman,1886

a.背面观全形图χ7；b.头部背面观ⅹ10;c.雌性和雄性生殖系统ⅹ10an.肛门；au.耳状突；cs.尾吸盘；cod.总输卵管；de.射精管；ds.背感器；eb.射精球；ep.贮精囊；eyes

眼；o.卵巢；od.输卵管；pr.前列腺；ps.阴茎囊；st.条纹；te.精巢；va.阴道囊；vad.

阴道管；vd.输精管。

（a，c笔者图；b自宋大祥等，1978）

图9-5天目山蛭HaemadipsatianmushanaSong,1977a.背面观全形图χ4.5；b.雌性和雄性生殖系统ⅹ10an.肛门；au.耳状突；cs.尾吸盘；cod.总输卵管；ds.背感器；ep.贮精囊；eyes

眼；o.卵巢；od.输卵管；pr.前列腺；ps.阴茎囊；sp.斑点；st.条纹；te.精巢；va.阴道囊；vad.阴道管；vd.输精管。（笔者图，1996）

9.3

医学蛭类的唾液腺分泌物及其活性成分蛭类动物的消化系统都是由口、口腔、唾液腺、食道、嗉囊、肠、直肠和肛门等部分组成的，而所有吸血蛭类的口都开口在前吸盘的腹中，口内是一完全围绕咽的口腔部分，在口腔内通常有3个（或2个）呈三角形排列的肌肉性颚，在颚的脊缘上有几丁质或部分是钙质的单列齿，通常唾液腺开口在颚脊上的齿之间，但在牛蛭属中则开口在颚两侧分散着的乳突上。由辐射肌和横肌构成的颚能牢固地贴在哺乳动物或人的皮肤上，借助三条或两条环形锯一样的齿列往复地动作即可将皮肤割成“Y”形切口。当口腔后的肌肉形咽鼓动时，由于负压的作用血液可以自由地流入消化道内。与此同时，咽头和食道两侧的唾液腺分泌包含有水蛭素（hirudin）在内的抗凝剂（anticoagulant）、血管舒张剂或叫类组织胺（histamine）以及麻醉剂的分泌物。将其注入伤口并与血液混合，从而使伤口血流量大增，流进嗉囊储藏的血液不会凝固，来自内共生细菌的抗菌素则保护血液使之不致在消化之前就变质（见图9-6）。医学蛭类在医疗临床上的许多新用途，无疑是以对其唾液腺分泌物中生物活性成分的深入了解为基础的。随着对医学蛭类唾液腺分泌物中生物活性成分认识的不断深化，它们在医疗临床以及其它生命科学中必将发挥更重要的作用。图9-6

日本医蛭Hirudonipponia消化系统解剖图a.

消化系统；b.和c.

颚及其附属器官an.肛门；cr.嗉囊;

cs.尾吸盘；int.肠；ja.颚；mth.口；oe.食道；rt.直肠；salg.唾液腺；wr.

纵褶。

（笔者图，1996）

(一)水蛭素（Hirudin）

关于天然水蛭素的研究、报道和专利，决大部分是利用欧洲医蛭（Hirudomedicinalis）的头部和整个身体做材料的，经乙醇脱水，然后加丙酮沉淀等一系列的步骤而得到水蛭素粗制品的。1970年德国马克沃德特（F.Markwardt）采用乙醇分级沉淀、阳离子交换、凝胶过滤以及阴离子交换等步骤获得了水蛭素纯品。1985年沃尔斯曼（P.Walsmann）和马克沃德特改进了纯化方法，采用离子交换与亲合色谱相结合而获得了高纯度的水蛭素。1986年约翰尼斯（Johannes）等人报道了一种五步纯化法，其中使用了高效液相色谱新技术。根据前人的研究得知水蛭素是由65个氨基酸组成的低分子量多肽，其中谷氨酸和天门冬酰胺的含量较高，分子量为7000左右，含有三个二硫键。已分离鉴定出7种异构体。二硫键是决定其分子构型稳定性，保持高抗凝活性的关键。当二硫键被氧化或还原，或者分子发生了蛋白降解，则失去其抗凝活性。若水蛭素的羧基被酯化，或失去酸性的C-端氨基酸，也会失去与凝血酶结合的能力。水蛭素的等电点较低，在3.8–4.0之间。在室温下能长期稳定，而在70℃以下可以保持活性，干样也可以保存一年，在水中加入百里酚结晶亦能保存6个月，其热稳定性随pH值的减小而增加。水蛭素能被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶破坏，却不受血纤维蛋白溶酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶A的影响。水蛭素通过阻塞凝血酶的底物结合基团致使凝血酶失去活性，处在特异空间部位的水蛭素自由羟基与凝血酶自由氨基通过静电引力而结合，产生的络合物在凝血酶保持活性的整个PH范围内不会解离。1970年德国马克沃德特首先报道了一种测定水蛭素含量的方法-凝血酶滴定法，即根据水蛭素与凝血酶反映速度快，在化学计量学上呈正相关关系，可以用抗凝血酶单位来表示水蛭素的含量，一个抗凝血酶单位(AT-U)是指在37℃下使1个国际单位的凝血酶失活所需的水蛭素量。一个抗凝血酶单位对应于0.1微克的纯水蛭素，一条成熟的吸血水蛭约含有285个抗凝血酶单位的水蛭素。由于水蛭素具有活性高、结构稳定、不易失活以及后期纯化成本低的优点，是开发抗凝、溶栓新药的理想原料。

（二）水蛭透明质酸酶（Hyaluronidase,HAse）

克劳德（Claude,1937）首先报道了在医蛭提取液中有一种“扩散因子”，后来林克尔等人（Linkeretal.,1960）证明这是一种透明质酸酶。由于能够专一水解透明质酸的内葡萄糖苷酸键，因此是一种内切–β–葡糖苷酸酶(endoglycuronidase)，只降解透明质酸而不降解其它粘多糖，活性能被10ˉ5mol/LHg++完全抑制，但不被肝素抑制。不同于从哺乳动物和其它动物组织中提取出来的内切–β–N乙酰氨基葡糖苷酸酶和从微生物体内提取出来的内切己糖胺酶。它是分子量为28500的单体蛋白质，在50℃以下稳定，催化作用的最适pH是5.5，最适温度是38℃，可溶于50%的硫酸铵溶液，在70%饱和度硫酸铵溶液中的溶解度最小，冻干制剂能保持活力许多个月。水蛭透明质酸酶的活力单位被定义为：在pH5.5和38℃的最适条件下，一小时内从透明质酸中释放1微克葡萄糖还原当量的还原糖所需的酶量。一个这样的单位大约相当于对从哺乳动物来源的透明质酸酶规定的国际单位的20倍，比活力规定为每毫克蛋白含有的单位数。赫斯特（Hirst,1941）证实了水蛭透明质酸酶强有力的抗菌性能在于能溶解体内和体外细菌的多糖被膜并形成抗体。水蛭透明质酸酶能促进药物迅速穿透皮肤并在皮内扩散，在治疗血栓性疾病时不被肝素抑制，因而具有比哺乳动物来源的透明质酸酶更大的应用价值。芭格达萨萝娃（Bagdasarova,1969）首先发现水蛭透明质酸酶在治疗青光眼（白内障）方面有很好的效果。英国人用其治疗心血管病，也取得了良好的效果。由于水蛭透明质酸酶能降解在细胞间起联系作用的粘多糖–透明质酸，如果将它与水蛭胶原酶一起使用则可以分散动物组织的细胞，便于挑取单个细胞进行分代培养或细胞克隆，这在生物工程中特别是细胞工程中应用很广泛并已成为眼科和整形医学中的有力工具。不像哺乳动物来源的透明质酸酶，水蛭透明质酸酶不能降解软骨素或硫酸软骨素，故可以在生物化学上用来原位鉴定透明质酸，研究滑液、HA–纤维蛋白以及其它含HA分子的细胞间基质。

（三）前列腺素(Prostglandins)

俄罗斯国立莫斯科大学巴斯柯娃等人(Baskovaetal.,1987)应用放射免疫方法从欧洲医蛭的头部和整个身体中检测出前列腺素并且是以6–Keto–PGF(简称6–KF)的前体形式出现，这是一种前列腺素转化成的产物，具有明显的抑制血小板聚集和抗动脉硬化的功能特性，副作用也小，而血小板聚集是引起动脉粥样硬化和心肌梗塞的主要起因。6–KF前体多为一个具有五碳环和两个双键侧链的二十碳脂肪酸（PGI2）,它能迅速转化为性能稳定的最终产物6–KF，利用检测6–KF的含量变化可以判断PGI2的含量以及消长变化。研究表明前列腺素是人体内分布最广，作用极大的一类生物活性物质,它通过对某些激素的调节来控制人体平滑肌的收缩、血液供应（血压）、神经传递、发炎反应、电解质出钠以及血液凝固等生理过程。在实际应用中可以作为消散血栓和抗动脉脉粥样硬化的药物，是制造一系列具有良好性能药物的原料。

（四）安逖斯塔辛（Antistasin）

美国费城宾夕法尼亚医院的生物化学家加西克等人（Gasicetal.,1983-1986）从一种墨西哥水蛭（Haementeriaofficinalis）的唾液腺中分离出来一种含有119个氨基酸的多肽，取名安逖斯塔辛（Antistasin，ATS）。无数动物的和离体的，用水蛭的以及重组体的安逖斯塔辛（rATS）做的实验证明ATS能通过抑制含有fxα因子的血清酶来阻止血液凝固以及动脉和静脉血栓形成，抑制培养的主动脉光滑肌增生，也能减少实验动物肿瘤细胞的扩散，使肿瘤细胞保持运动状态而无法聚集在一处。这样十分有利于肿瘤患者体内的免疫系统将肿瘤细胞各个击破。ATS还在免疫组织化学实验中常常用来发现含有fxα因子的恶性细胞一小细胞癌，是一种具有巨大治疗优势的fxα因子抑制剂。fxα因子是一种培养光滑肌细胞的促细胞分裂剂并且能造成从内皮细胞来的促细胞分裂剂的释放。在体内，这些影响可能是对内膜过度增生促成的主要因素，因此ATS有抑制从内膜细胞来的以及在培养中来的fxα因子的作用。在动物模型中已证明ATS的体内治疗半寿期在30小时以上，它是一种稳定的多肽抗凝剂。常用的抗凝剂肝素有较低的治疗学指数以及较高的出血危险，有可能危及血小板功能的安全并且对抗凝血酶Ⅲ缺乏症病人的治疗是无效的。重组体的安逖斯塔辛（rATS）在体内有长的治疗半寿期，不会因治疗剂量产生出血或影响出血时间。因此rATS是一种对正常止血有最小影响的有效血栓抑制剂。概括地说安逖斯塔辛（ATS）是一种有效的，实用的，具有出血性并发症最小危险的抗凝剂，至少有等于促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）一样的商业价值。

9.4医学蛭类化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集蛭类动物为了取食、生殖和自身的防御必须不断地通过光、水波、化学物质及物理刺激来接受周围环境的信息，对每种信息又有相应的感觉结构。在水蛭身体中部体节上有由两极细胞构成的皮肤感器（sensillae），这种感器对微弱的水扰动和光刺激都非常敏感，可以发现和传导这些微弱刺激。水蛭对包括食物在内的种种化学刺激，特别是吸血种类对血液刺激的反应都局限于头部背唇及口部皮肤上的化学感受器(chemoreceptors)。所有的皮肤感受器都是通过神经系统的传导，使身体作出相关行为反应的。美国埃利奥特博士（Elliott,1987）发表了她用扫描和透射电子显微镜观察排列在欧洲医蛭头部及口部皮肤上化学感受器的结果。发现头部背唇皮肤上有大小不同的两类纽扣状的纤毛墩（mound），较大的一类直径约35微米，较小的一类直径约10微米，它们由具有均匀长度的多纤毛细胞组成，这与具有长鞭状纤毛和短硬纤毛的皮肤体节感器在形态和功能上都不相同。除了背唇皮肤上的纤毛墩以外，在口的内侧皮肤上还发现了一类由3一4根短棍棒状突起构成的结构，也起到化学感受器的作用。同时她发现了吸血水蛭对氯化钠和精氨酸的简单混合液有如对全血一样的作用，通过头部背唇及口部皮肤上的化学感受器引起取食反应。

图9-7吸血水蛭化学感受器的扫描电子显微镜观察1日本医蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；2

日本医蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；3湖北牛蛭头部背唇化学感受器扫描电镜图；4湖北牛蛭纤毛感觉墩上的纤毛扫描电镜图；5日本医蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图；6湖北牛蛭口部内侧皮肤上的短棍棒状突起扫描电镜图（笔者图，2001）

(一)扫描电子显微镜观察

为了弄清我国两属吸血水蛭化学感受器的特异性，笔者与武汉大学电子显微镜室的同事合作做了日本医蛭和湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤的扫描电镜观察以及取食行为实验。扫描电镜观察结果证明我国两种吸血水蛭头部背唇皮肤上也有两类大小不等的纤毛感觉墩，呈带状排列，约150个左右，每个墩的中央是由长度均一的纤毛状突起构成的纽扣状结构，前者的纤毛较稠密，后者的纤毛较稀疏。较大的一类纤毛感觉墩在光学显微镜下不具色素斑点，而在扫描电镜下日本医蛭每纤毛感觉墩约有30根等长的纤毛，湖北牛蛭每纤毛感觉墩约有25根等长的纤毛，前者呈稠密的丛状，后者呈稀疏的环状（见照片图组I:1,2和3，4）。在口部内侧皮肤上也有由3–4根短棍棒状突起构成的结构，日本医蛭的突起呈密集丛生状，湖北牛蛭的突起呈稀疏丛生状（见照片图9-7:5和6）。

（二）取食行为实验

为了验证以上两种吸血水蛭化学感受器的分布位置与取食反应的关系，笔者特用两组小玻璃杯分别盛以新鲜的猪血和牛血，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现日本医蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜猪血的小玻璃杯非常敏感并喜食猪血，湖北牛蛭头部背唇及口部皮肤对盛以新鲜牛血的小玻璃杯非常敏感并喜食牛血。同时又用经过手术切除头部背唇和口部皮肤以及只部分切开而不摘除头部背唇和口部皮肤的两种饥饿吸血水蛭做了以上实验，重复多次之后发现切除头部背唇和口部皮肤的个体对盛有新鲜猪血和牛血的小玻璃杯均无任何取食反应发生，然而部分切开又不摘除头部背唇和口部皮肤的个体对以上的小玻璃杯有与不切除头部背唇和口部皮肤的个体同样的取食反应发生。这进一步证明了两种吸血水蛭的化学感受器均分布在头部背唇和口部皮肤上。（三）吸血水蛭化学感受器的特异性以及唾液腺分泌物的采集

为了验证猪血和牛血中何种成分可以通过两种吸血水蛭化学感受器引起取食反应。笔者用三组小玻璃杯分别盛以哺乳动物血液中均含有的150mM氯化钠，1mML精氨酸以及150mM氯化钠和1mML精氨酸，杯口蒙上肠系膜并将其投入内有两种饥饿吸血水蛭的缸中。重复多次之后发现两种饥饿的吸血水蛭均对盛有150mM氯化钠和1mML精氨酸的小玻璃杯非常感兴趣，有如取食血液一样地取食这种混合液。这种对哺乳动物血液中固有成分（氯化钠和精氨酸）必须浓度的选择性识别是专一的，这在引起起取食反应的过程中起决定作用。由于氯化钠和精氨酸都是以很高的浓度存在于哺乳动物血液和汗液中的，我们可以利用哺乳动物的血液和汗液在野外诱扑各种吸血水蛭，也可以利用必须浓度的氯化钠和精氨酸在室内从饥饿的活体吸血水蛭体内大量提取重要的心血管药物原料一医学蛭类唾液腺分泌物。一条饥饿的活体吸血水蛭可以反复使用6–7次，这比用头部或整个身体匀浆后做生化提取、分离和纯化要节省大量的试剂、时间和金钱。吸血水蛭唾液腺分泌物大量提取技术的解决，将大大促进医学蛭类的药物开发和利用。

9.5

医学蛭类唾液腺分泌物活性成分的分离、纯化与活力测定(一)水蛭素的分离、纯化与活力测定

此段以我国产的日本医蛭为对象，先将其充分饥饿再采用以上唾液腺分泌物的采集方法大量提取唾液腺分泌物，置冰箱中冷冻保存待用。解冻后取250–300ml加进4倍置冰箱中4℃下预冷的含15%水的冷丙酮，搅拌后置冰箱中4℃下让其沉淀过夜，次日吸出上清丙酮并离心，在所得沉淀中加入预冷的三氯乙酸（约25ml）使其溶解，离心除去残渣，待上样进行柱层析。

阴离子交换柱层析

取适量二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52）加蒸馏水使其膨胀，按常规方法依次用0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液、0.5mol/L的HCl及0.5mol/L的NaOH-NaCl混合液各浸泡300分钟后用蒸馏水洗涤至中性。装柱（2cmx60cm）至所需高度，用pH4.6的0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液平衡；用5ml的唾液腺分泌物浓缩液或上述三氯乙酸溶液上样进行梯度洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为30ml/小时。经检测将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩，再用双缩脲法测总蛋白质含量，继续以下凝胶过滤柱层析。双缩脲法测总蛋白质含量

取一系列试管分别加进0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0的标准牛血清白蛋白溶液（6mg/ml）,用水补足至2ml，然后分别加进4ml的双缩脲试剂（每升溶液中含1.50gCuSO4•5H2O和6.0gNaKC4H4O6•4H2O,30gNaOH)，在室温下放置30分钟，用721分光光度计在540nm处比色，光密度分别为0，0.066，0.135，0.210，0.285，0.340。以光密度为纵坐标，牛血清白蛋白（BSA）含量为横坐标绘出标准曲线。取2.0ml于透析袋中用甘油浓缩后的样品按上述方法测540nm处的比色，便可以在标准曲线上查到对应的蛋白质含量的微克数。用测得的蛋白质含量结合用凝血酶滴定测得的数据，便可以求算出样品中水蛭素的比活力。日本医蛭唾液腺分泌物提取液纯化总得率为15%；纯化后的产物的比活力为6708AT-U/mg蛋白。凝胶过滤柱层析

取适量的交联葡聚糖离子交换剂（SephadexG25）加蒸馏水浸泡4小时，按常规方法用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl混合液浸泡半小时，抽滤除去硷液并用蒸馏水洗涤至中性，加热煮沸除去气泡。装柱（1.5cmx50cm）至所需高度，用pH7.4的0.1mol/LTris-HCl-NaCl缓冲液平衡，将上述有活力洗脱液的透析袋甘油浓缩液上样，洗脱并用核酸蛋白检测仪记录绘制出洗脱曲线，分段收集洗脱液，流速为90ml/小时。分别检测活力，将有活力部分集中于透析袋中用甘油浓缩。再检测活力后，待用DU-70贝克曼分光光度计在200nm至400nm波长范围内扫描，便能确定所得产物的纯度。凝血酶滴定法检测水蛭素的含量

这是德国马克沃德特（Markwardt，1970）首先报道的一种测定水蛭素含量的方法，这种测定方法用得十分广泛，至今仍然被美国Sigma生化试剂公司和英国水蛭生物药物公司作为标准测定方法而列入水蛭素的规格和价目表中。具体步骤是用微量进样器将50微升未知水蛭素含量的被测日本医蛭唾液腺分泌物提取液加至溶有0.5%牛血纤维蛋白原的200微升pH7.4的0.1mol/LTris-HCl-NaCl缓冲液中，混合均匀后在室温下以每分钟1微升的速度递次加入100抗凝单位/毫升标准凝血酶稀释液并及时搅拌，让其与牛血纤维蛋白原和未知水蛭素含量的被测溶液充分混合均匀，当在1分钟内出现胶冻状凝块时即为滴定终点。从滴定的凝血酶量，可以推算出被测溶液中水蛭素的活力单位。研究表明水蛭素与凝血酶之间相互作用的部位主要处于水蛭素分子的C端。测定结果表明日本医蛭唾液腺分泌物提取液中水蛭素的含量为4抗凝单位/毫升（AT-U/ml）。凝血酶滴定法是一种简易、省时、准确、稳定的水蛭素活力测定方法，然而测定结果受到环境温度和凝血酶活力的影响很大，也受到操作人员对方法掌握的熟练程度的影响。气温太高或太低、凝血酶活力丧失以及试剂稀释不恰当均能造成测定结果的较大偏差，其最适温度范围应在25-37℃之间。除此之外，还有分光光度法、光散射法和血纤维蛋白肽A放射免疫法等几种方法可以采用，这里不加多写。（二）蛭透明质酸酶的分离、纯化与活力测定通过硫酸铵分级沉淀进行酶的分离与纯化

分别取一定体积的日本医蛭和湖北牛蛭唾液腺分泌物提取液，缓慢加固体硫酸铵至40%饱和度，在冰浴中搅拌10分钟，并在700转/分钟下离心20分钟，取上清液调硫酸铵饱和度至80%，同上离心取沉淀，将此沉淀悬浮于10mlpH7.0的70%饱和度硫酸铵溶液中，充分搅拌并同上离心取沉淀，溶于5mlpH7.0的50%饱和度硫酸铵溶液中，同上离心取上清液，装入透析袋中对无离子水透析，直至用10%BaCl2检测无沉淀时终止，量取透析后液体体积，留适量用作测酶活及测蛋白质含量。整个过程采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法监测酶活。通过二乙基氨基纤维素阴离子交换剂（DEAE-C52）柱层析进一步分离与纯化酶

将预处理的DEAE-C52装柱（1.5cmx50cm），用pH7.1的0.05mol/L

Tris-HCl缓冲液平衡过夜。上样后，待记录仪基线平稳后再依次用pH6.0的0.1mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.6的0.1mol/L乙酸缓冲液（含0.1mol/LNaCl）,pH4.0的0.1mol/L乙酸缓冲液（含0.2mol/LNaCl）洗脱，流速为40ml/小时。测定结果表明pH5.6下的洗脱峰水蛭透明质酸酶（HAse）酶活力最高。将该峰的洗脱液装入透析袋中对无离子水透析，然后加入3倍体积的冷丙酮沉淀，最后将沉淀抽干置-20℃下保存。制定葡萄糖标准曲线

用15℃下烘干到衡重的葡萄糖配制250微克/毫升的标准液，在成梯度容量的各标准液中加3毫升3，5-二硝基水杨酸(DNS),在沸水浴中5分钟显色后用自来水冷却至室温并加蒸馏水稀释。用72型分光光度计在550nm处测定光密度OD值,用OD550对葡萄糖微克数做标准曲线。样品中酶活力的测定

在0.8mlpH5.5的0.02mol/L柠檬酸缓冲液中加0.2ml

的5mg/ml透明质酸溶液和0.2ml待测样品于38℃水浴中精确保温30分钟，然后将试管浸入沸水中终止反应。取0.1ml以上降解液加3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂显色，同时用0.2ml煮沸的酶液作对照测A550（吸光率），根据光密度OD550从标准曲线上查出还原糖的微克数。每毫升样品中酶活力单位数（I.U./ml）=还原糖在标准曲线上的微克数X12。结果表明用常规糖定量3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测水蛭透明质酸酶（HAse）较传统浊度法更简单和可靠，灵敏性和专一性都较好。日本医蛭的产率为17.8%，湖北牛蛭的产率为14.3%。用福林(Folin)-酚试剂法测蛋白质含量

首先按照常规方法测定吸光率A540，制定出牛血清蛋白(BSA)标准曲线。蛋白质含量(mg/ml)=A540x3.91,取1.0ml样品按上法测A540便可以在标准曲线上查到对应的微克数。用测得的蛋白质含量可以推算出样品的比活力。结果表明日本医蛭的比活力为3529u/mg,湖北牛蛭的的比活力为2352u/mg。从以上结果看出，两者在分离和纯化之后比活力都提高很多，且比活力之比在纯化之后下降了。从理论上看，经过纯化之后两者的比活力应该很接近，但其比活力之比仍大于1，这说明湖北牛蛭纯化的结果不如日本医蛭理想。

9.6

我国对医学蛭类及其天然水蛭素的应用现状与前景

近年来，我国各相关部门对医学蛭类及其天然水蛭素的开发与应用开始重视，做了不少的工作。根据中文科技期刊全文数据库的统计，从1994年至2002年底全国各科技期刊发表了与水蛭医药应用有关的文章多达1000篇以上，然而明确注明以吸哺乳动物血液的医学蛭类为对象并指明蛭类种名的文章不多，其中大多数文章以及中药市场销售的水蛭中成药实际上用的是不吸哺乳动物血液，只取食螺类体液的宽体金线蛭做原料的。由于宽体金线蛭不含医学蛭类体内含有的水蛭素等生物活性物质，其体内所含有的成分及其作用机理都没有搞清楚，因此笔者未将这部分文章和水蛭中成药产品包括在本章的内容中。以下介绍一些应用效果明显和具有很好应用前景的例子。湖北省中医药研究院通过药理、药效、毒性和临床试验，研制并经国家医药局批准的医学蛭类国家级新药–脉血康胶囊（肠溶），系用日本医蛭经冷冻、匀浆、干燥、研磨和钴60照射灭菌等步骤制成。该药富含水蛭素、透明质酸酶、血管扩张剂、纤维蛋白酶抑制剂、抗血栓素等成分，具有极强的活血化瘀、破血散结作用。通过对日本医蛭唾液腺分泌物提取液及整体匀浆液的生化和药理实验表明它们均有较强的抗凝血酶活性，对家兔血浆的复钙时间、凝血酶原时间均有显著延长作用，具有较强的纤溶活性，随着剂量的增加而加强活性呈量效关系。能有效地抑制血栓形成和血小板黏附，明显缩短红细胞电泳时间，降低血清胆固醇TC及血清甘油三酯TG，对微循环有明显的改善作用。通过安全性动物实验证明日本医蛭无毒无副作用，对肝、肾无损害。临床试验治疗脑中风有效率达86%，是用于治疗与血栓形成有关的心脑血管疾病的有效制剂。可用于治疗脑血栓、颅内血肿、缺血性中风、动脉粥样硬化、冠心病、心绞痛、高血脂症、高血压引起的头痛和胸闷等。此药已在重庆多泰药业有限公司万盛制药厂投产并上市销售。中国科学院水生生物研究所由笔者负责的医学蛭类应用研究课题组于1987年8月至10月与湖北医学院附属第二医院骨科彭建强等医生合作，开展了将医蛭吸血法用于治疗断指再植术后瘀血的研究。这是我国首次应用饥饿的吸血种日本医蛭对五例经过高难度末节显微外科再植手术的断指进行的治疗处理，取得了明显的治疗效果，使原来没有把握接活的断指都存活了下来。通常断指再植手术之后，静脉血管回流往往发生障碍，从而减少了动脉血液的供应，引起组织的坏死。外科医生曾尝试过用各种机械和化学的方法来预防组织坏死都没有成功，然而利用饥饿的吸血水蛭却可以清除闭塞组织中淤积的血液，使静脉血管变得通畅，防止了坏死发生，从而为毛细血管长入组织赢得了时间，这是一种理想的治疗方法，其细菌感染的危险性也极小，可以说比机械和化学的方法都要安全、经济和简便。第一例断指病人系被汽车发电机切断左手食指和中指后13个小时做的显微外科再植手术，食指仅接通动脉而没有找到静脉；第二例断指病人系冲床夹断右手食指后4个半小时做的显微外科再植手术，食指仅接通动脉而没有找到静脉；第三例断指病人系右手5指和左手3指被切纸机切断后4个小时做的显微外科再植手术，其中右手中指没有找到静脉，环指虽然吻合了静脉，但回流不通畅。所有的断指显微外科再植手术之后，立即用经100毫升生理盐水加4万单位庆大霉素浸泡15分钟的饥饿日本医蛭对以上再植的断指进行吸血治疗，每日2–3次。吸血治疗之前先在再植的断指末端切一小口，并用生理盐水搽洗伤口，然后用2–4条处理好的日本医蛭在切口上吸血。在治疗期间，同时用青霉素、氨苄青霉素给病人注射，以提高抗感染能力。五例再植断指病人的断指经过4–5天的吸血治之后，继续注射以上抗生素15–30天，肿胀渐渐消失，青紫或发白的断指逐渐变得红润，血液循环也恢复正常。再植的断指生长良好，均未出现细菌感染（见照片图9-8）。这项工作的成功也为在我国开展耳朵、鼻子、脚趾、皮瓣静脉瘀血和脉管炎等显微外科手术，使用医蛭吸血法治疗术后瘀血提供了方法和经验。1985年一个5岁的美国男孩和他被狗咬掉了的耳朵一起被急送到波士顿儿童医院进行再植手术。因为耳朵的血管非常细，几乎肉眼都难以看清，极易产生药物难以奏效的并发症，通常很难再植成功。经过12小时的再植手术才将断了的静脉和动脉接了起来，血液开始在接上的血管里流动了。但是，由于在静脉里形成的血块阻碍了血液流回心脏，手术后3天再植的耳朵就因为血管充血而呈现紫黑色，尽管使用了肝素和小切口放血，情况仍然危急。在不得已的情况下，医生从英国水蛭生物药物公司得到一批处于饥饿状态下的医用水蛭并被空运至美国波士顿。经过一星期使用医蛭吸血法治疗术后瘀血，共用去24条医用水蛭，男孩再植缝合的耳朵重新竖了起来并显示出了血气，血液循环恢复了正常，两周后男孩出了医院，这真是一个医疗的奇迹。湖北医学院附属第二医院骨科彭建强、陈振光等（1988）在湖北医学院学报第9卷第4期上报道了医蛭吸血法用于用于处理皮瓣静脉淤血的实验研究，他们在大白鼠下腹部岛状皮瓣上制成淤血皮瓣模型，尔后用日本医蛭吸血，取得较好的效果。吸血组皮瓣总存活率为93.9%（46/49），未吸血组仅为14.3%（5/49），小切口放血加肝素生理盐水冲洗组为25%（8/32）。实验结果表明医蛭吸血法能有效地解除组织静脉淤血，故可将此法用于吻合血管皮瓣移至或者断指再植术后静脉淤血不宜手术探查的病人。

图9-8应用医蛭吸血法治疗断指再植术后瘀血

a.左手食指和中指再植手术后用医蛭吸血治疗；

b.吸血治疗结束后的左手食指和中指；

c.右手5指再植手术后用医蛭吸血治疗；

d.吸血治疗结束后的右手5指（杨潼，彭建强等，1988）

中国中医研究院廖福龙、李文等人使用我国产的日本医蛭、菲牛蛭、湖北牛蛭、尖细金线蛭、宽体金线蛭和光润金线蛭干粉提取制备成0.12克/毫升原液，用其做的抗血小板聚集实验和抗凝全血与血浆复钙实验，完成了七种水蛭抗血小板聚集与抗凝血研究。他们选用健康的新西兰种家兔为供血动物，用光密度法测定血小板聚集的百分率，用常规枸橼酸钠抗凝血。结果显示日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现出抗血小板聚集作用，其中日本医蛭在3.08毫克/毫升浓度下抑制ADP诱导作用；菲牛蛭在9.23毫克/毫升浓度时对血小板最大聚集百分率（PAm）和一分钟时血小板聚集百分率（PAr）都有显著的抑制；湖北牛蛭则需要较高浓度才抑制腺苷二磷酸（ADP）诱导血小板聚集作用；几种金线蛭超声提取物则表现了不同程度的促血小板聚集作用，前两种金线蛭的水煎提取物则表现了显著的抑制血小板聚集作用。日本医蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表现了强大的抗凝血作用；三种金线蛭的抗凝血作用相对较弱。又据该院欧兴长、张秋海等人（1996）在天然产物研究与开发第8卷第2期上报道了四种水蛭抗凝血酶作用的研究。结果表明日本医蛭和菲牛蛭两个吸血种具有很强的抗凝血酶活性，宽体金线蛭和光润金线蛭两个非吸血种则只有很弱的抗凝血酶活性。上海中医药大学吴大正、韩志芬等人（2002）在上海中医药杂志第8期上报道了水蛭素对凝血酶造成的血管内皮细胞单层通透性增高的抑制作用。他们将新生牛主动脉分离获得的单个内皮细胞培养于微孔滤膜上，直至形成致密的单层细胞。通过灌流Hanks液或含5克L1白蛋白的Hanks液后，测定经10单位/毫升凝血酶溶液或经10单位/毫升凝血酶溶液加10单位/毫升水蛭素处理的液体滤过系数（Kf）、液体滤过流量（JV）和蛋白质渗透压反射系数（Q）。结果证明水蛭素能够抑制因凝血酶造成的Kf和JV降低，以及Q的升高。凝血酶能够引起血管内皮细胞单层通透性的增高，而水蛭素则能减轻凝血酶的作用。成都中医药大学附属医院眼科袁晓辉、王万杰等人（2000）在眼科新进展第4期上报道了水蛭素预防眼内增生性病变的初步观察。他们为了探讨用水蛭素预防眼内增生性病变的效果，采用建立实验性眼外伤动物模型，随机分为实验组和对照组。在实验组玻璃体腔内注入小剂量的水蛭素（每只眼10抗凝单位），对照组采用空白对照，分别观察2组1、3、5、7、14d玻璃体混浊及眼底增殖膜形成情况。结果是实验组1、3、5d玻璃体混浊及眼底增殖膜形成明显低于对照组（p<0.05）。结论是水蛭素对眼内增生性病变形成有早期的预防作用。该院眼科郑燕林与重庆医科大学蒋纪恺（2001）在中国眼科杂志第1期上报道了水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变细胞外基质的影响。他们为了探讨水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变(PVR)细胞外基质形成的影响。制造穿孔性眼外伤的动物模型，将水蛭素0.1ml(10单位)注入兔玻璃体腔内，对照组注入0.1ml的生理盐水，用放射免疫法测定玻璃体腔内粘连蛋白(Laminin,LN)IV型胶原(IVcollagen,IVC)的含量。结果在外伤后1周水蛭素组与对照组比较LN和IVC含量下降（p<0.05）。结论：水蛭素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变（PVR）细胞外基质的形成具有一定的抑制作用。

福建中医学院祁明信、黄秀榕等人（2001）在眼科研究第3期上报道了水蛭滴眼液防治半乳糖白内障的实验研究。他们用SD大鼠复制半乳糖白内障模型，配制水蛭滴眼液并以白内障滴眼液作为阳性对照，动态观察并比较两组滴眼液对半乳糖白内障的影响。在实验第10天测定两组晶状体的超氧化物歧酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-PX）、谷胱甘肽（GSH）和可溶性蛋白（SP）的含量。结果表明水蛭滴眼液组较对照组晶状体浑浊速度慢，程度也轻。水蛭滴眼液组SOD，GSH-PX,GSH的含量均显著高于对照组。同时也证明水蛭滴眼液具有较好的延缓和减轻半乳糖白内障的作用。第四军医大学第二附属医院实验动物中心杨文清、施新猷等人（1999）在上海实验动物科学第4期上报道了光化学法致大鼠脑血栓及水蛭提取物的治疗作用。他们根据光化学原理以自制的冷光源（LG105B）诱导大鼠大脑中动脉血栓形成并观察其后动物行为学改变、脑水肿程度、脑梗塞面积以及尿激酶和水蛭提取物的治疗作用。结果为诱导后4、12、24小时出现的行为学改变，以24小时最显著；脑水肿也以24小时最为严重；脑梗塞灶约占脑（嗅球、小脑和低位脑干除外）切片面积的10.51%；尿激酶和水蛭提取物处理后以上改变均有明显的改善。以水蛭提取物（2克/公斤）处理可使脑水肿程度下降29%，脑梗塞面积缩小45%。结果还表明用冷光源（LG105B）可成功建立大鼠大脑中动脉脑血栓模型，水蛭提取物可减轻其脑梗塞程度。他们还在该校学报（2001年第2期）上报道了水蛭提取物对大鼠脑血栓后脑组织MDA、SOD和NO含量的影响。为了探讨光化学法诱导大鼠脑血栓形成中丙二醛(MCA)，NO和SOD含量的变化及水蛭提取物(EFH)对脑组织保护作用的机理，采用光化学法诱导大鼠大脑中动脉（MCA）脑血栓形成模型；观察脑缺血后以及药物作用后4小时、24小时脑组织匀浆中MDA、SOD和NO的含量变化。结果表明大鼠脑缺血后4小时脑组织匀浆中MDA的含量增高，24小时明显增高；24小时EFH治疗组的MDA明显降低，由4.77±0.24

mol·L-l降为2.51±0.44

mol·L-l（P<0.05）,与模型组相比24小时SOD的活性明显增高（P<0.05），NO的含量在脑缺血后2小时降低。24小时与假手术组相比明显升高。安徽医科大学附属第一医院陈贵海、李孟峰等人（1998）在中国危重病急救医学第5期上报道了水蛭对脑出血大鼠血三碘甲状腺素T3、甲状腺素T4、PRL、生长激素GH、CS的影响。他们用不同剂量的水蛭粗提液喂饲脑出血大鼠，第7天取血以RIA法测激素浓度，结果证明水蛭对脑出血大鼠血中T3、T4、PRL、GH、CS浓度异常有缓解作用并呈量效关系,水蛭可改善出血后下丘脑-垂体-靶腺轴的功能紊乱。在国外，英国新科学家杂志曾报道印度医学专家用水蛭治疗静脉曲张，取得了很好的效果。静脉曲张一般由腿部静脉中控制血液单向流动的瓣膜功能失常引起，其症状主要表现为因血液过分淤积而造成患者腿部肿胀，甚至发生溃疡。通常用腿部打绷带的办法来对静脉曲张患者进行治疗，但这一过程往往比较痛苦，而且还容易引发皮肤过敏。印度孟买KEM医院等单位利用水蛭有效地去除了静脉曲张患者腿部的淤血，最终消除了患者的溃疡或肿胀症状。研究人员发现相对于含氧量较多的动脉血，吸血水蛭更“钟情”于静脉血，他们利用吸血水蛭对20名患者进行了试验，结果所有患者的溃疡都得到治愈，18名患者腿部的肿胀大幅度地减轻。国外研究人员还发现吸血水蛭的唾液腺分泌物提取液能明显阻碍转移性肺肿瘤的生长，能抑制肿瘤细胞胶原酶活性，两种吸血水蛭唾液天门冬酸酶能抑制血小板分泌三磷酸腺苷，从而阻止了血小板的聚集。近代研究证明凝血酶是调节多种细胞功能的活化剂，如对成纤维细胞和脾细胞的增殖；血小板和内皮细胞的分泌；血小板、内皮细胞、成纤维细胞和神经细胞的前列腺素合成；对单核细胞的趋向性以及平滑肌的收缩性都有影响。凝血酶通过与细胞表面结合点的作用，影响细胞的功能。当凝血酶与水蛭素结合后，则失去了与这些细胞表面结合点作用的能力。又据雅虎新闻网转载2003年11月4日路透通讯社健康新闻报道医学蛭类有助于减缓关节炎的疼痛。现今医学蛭类的应用仅限于外科手术后血液凝固问题的治疗，KlinikenEssen-Mitte的GustavJ.Dobos博士及其同事最近断言医学蛭类唾液含有能减轻关节炎症状的抗炎症物质和其他化学物质。在一项膝关节炎病人的研究中，Dobos博士的小组将用4至6条吸血水蛭做的单一治疗与用一种对关节炎常见的治疗作了比较。吸血水蛭被用于24个病人患病的膝关节疼痛点并让其在上吸血大约70分钟，直至离去。该新发现已在内科学年刊中报道。七天之后，疼痛伤痕在吸血水蛭组中比在用常见的治疗方法组中有了较大程度的改善。而且，在功能、僵硬和总的关节炎症状方面的受益能维持直到治疗后的91天，该治疗安全而且容易被接受。据路透社2004年6月28日华盛顿讯，美国食品及药品管理局（FDA）批准了用吸血水蛭作为愈合皮肤、移植和恢复循环的工具，还批准了法国RicarimpexSAS公司的吸血水蛭可以用于医疗上市。

9.7医学蛭类的生殖生物学与饲养繁殖

(一)

医学蛭类的生殖和发育蛭类动物是雌雄同体动物，雄性生殖器官先成熟，行异体受精并且借助在前端滑出头部的茧（cocoon）繁殖后代。医学蛭类包括的医蛭科和山蛭科种类的雄性生殖器官除10对精巢和输精管外，精管膨腔较为复杂，由一包有单细胞前列腺层的球状基部和包有阴茎的阴茎鞘组成。阴茎鞘是一甚粗大的肌肉性管，其内是一盘曲的管状阴茎，可以翻出体外。交配时两个个体的头部方向相反地腹面紧贴，一个个体的阴茎插入另一个体雌性生殖孔内的阴道内传递精子。事实上大多数的交配都是单方面输送精子到对方，而不是同时互相交换精子。雌性生殖器官由一对或多或少伸长的卵巢囊及其包含的卵巢组成，它们在前面伸出输卵管并汇合成一条肌肉性的总输卵管，再经由阴道和雌生殖孔开口向外（见前面生殖系统图）。卵从卵巢囊中产生并与从另一个体来的精子结合，最后被输卵管中的蛋白包上。一旦受精完成，受精卵就会通过雌孔迅速地产到由身体前部少数生殖体节的腺体或称环带腺分泌成的茧内。通常从交配到产茧要经过数十天至一个月的时间，这大概是精子经过组织进行迁移所需的时间。环带区的体壁有两类为形成茧提供物质的腺体：一类是分泌茧外壁物质的腺体；另一类是分泌蛋白液的腺体，受精卵在茧内悬浮于此蛋白液之中。在医蛭科和山蛭科种类中，茧在形成过程中不是被压扁而是保持圆形。整个身体的前段由于肌肉的收缩而变得长而细，往身体和茧壁之间的空隙里注入蛋白营养液和一些受精卵。然后缓缓地向后移动身体并从茧内脱出，当头部通过茧的前、后孔时借助前吸盘腺体产生的填塞物将这两个孔封闭起来。在这个阶段茧是无色的和半透明的松软囊状物，几天之后变成暗棕色而且几乎不透明的坚硬囊（见图9-9）。此外，茧壁通常分化成一蜂窝状或海绵状的外层和一光滑的内层。由于医蛭科和山蛭科种类的茧产在陆地上，海绵层的作用之一是减少水分的损耗。海绵层是环带腺分泌物夹杂空气形成的泡沫经过干燥之后形成的。蛭类动物受精卵的分裂是以螺旋型为基础的，首先在垂直面上分裂，以便将受精卵分裂成4个大裂球。每个大裂球然后在动物极一端分割出一个小裂球，由于在分割时卵裂轴的倾斜而使小裂球稍偏向一侧。当首一层以顺时针方向移位时，第二层则以反时针方向移位，反过来也是一样，每一层都是从前一层相反的方向来弥补。较早几层小裂球同时继续按照倾斜的轴分割，最后形成一个在大裂球顶上具有小裂球盖的中空囊胚并通过反转或外包法形成原肠胚。我国云南西南部的日本山蛭在每年5–9月的雨季里进行繁殖，7月初可以见到幼蛭，到8月初时特别多。每下一场雨即

图9-9

两种医学蛭类茧的外形和卵裂a.海南山蛭的茧；b.日本医蛭的茧c.螺旋卵裂的图解（a,b自宋大祥，1978；c自Waddington,1956）孵出一批幼蛭。通常长约5–9厘米，呈圆柱形，背面的斑纹不太明显，生长迅速。我国海南岛东部和中部山区的海南山蛭在每年8–9月及11–12月有两次产茧期，每隔5–7天产下一个茧，可以接连产4–10个茧。茧的大小为12–14毫米ⅹ11–12毫米，外层呈蜂窝状，为五角形或六角形的一个个碗状窝。(二)医学蛭类的饲养和繁殖

医学蛭类的饲养和繁殖在欧洲已经有了100多年的历史，1990年于以色列耶路撒冷召开的第三届国际水蛭科学家会议上，从事了40多年水蛭饲养和繁殖的法国水蛭养殖家J.Desbarax提出了一篇“水蛭养殖100余年以及我本人40余年的历史回顾”，值得我们借鉴，现将其摘要如下。1845年2月在法国Bordeaux港船坞附近，一个叫Bechade的人开了一间批发水蛭的商号，这已不是一个新兴的行业。在那段时间里，许多马和牛的主人养大水蛭，然后按重量卖给商人并赚得一些利润。Bechade的任务是收购、养殖和出售水蛭，他并没有成为富翁而于1867年将这一业务传给了他的女婿DeBest。随着营业、储藏和生产基地的扩大，这家商号便改名为DeBest–Bechade，在1870年至1880年间平均每年用柳条筐和运货马车运输并批发掉25万至40万条医用水蛭。1881年Ricard接收了该商号的业务并将其更名为Ricard–DeBest–Bechade，他开始通过邮局出售水蛭，首先使业务扩大到法国各大城市，而后至西欧各国，在1900年代销售量增加至每年80万条。1911年一位采矿工程师LucienDesbarax,也就是文章作者的父亲继承了Ricard的事业，他试图改善原有的营销方式和养殖方法，但是随着第一次世界大战的到来使这项事业不得不搁置下来。战后的1930年至1938年间业务扩大到每年营销4吨重的医用水蛭，LucienDesbarax只好组织了有60多人的渔民在春、秋季节去沼泽和湖泊里扑捉。在第二次世界大战期间这项事业更加困难了，1943年L