大学课程干细胞与组织工程课件

第七章.干细胞与组织工程StemCell&TissueEngineering第七章.干细胞与组织工程StemCell&Tissu1有关干细胞领域的研究成果多次获得世界十大科技进展2006年干细胞培育器官获重要进展

2007年人的诱导多能干细胞（iPS细胞）诞生

2008年美、英干细胞研究获一系列新进展

2009年无病毒转染获得iPS细胞

2012年癌症干细胞研究获新证据；日本科学家首次用“人造”卵子产下小鼠；德国首次从皮肤细胞中培养出成体干细胞

2013年人类克隆来源的胚胎干细胞有关干细胞领域的研究成果多次获得世界十大科技进展2006年干2Definingthemodeoftumourgrowthbyclonalanalysis.Nature,2012Arestrictedcellpopulationpropagatesglioblastomagrowthafterchemotherapy.Nature,2012LineageTracingRevealsLgr5+

StemCellActivityinMouseIntestinalAdenomas.Science,2012癌症干细胞驱动肿瘤的发生，并逃避放化疗引起复发Definingthemodeoftumourgr3OffspringfromOocytesDerivedfrominVitroPrimordialGermCell–LikeCellsinMice.Science,2012OffspringfromOocytesDerived4干细胞（stemcell）是具有自我更新和分化潜能的细胞，可以分化产生一种以上的“专业”细胞。干细胞基本特性：self-renewal;differentiation干细胞按来源的分类：

胚胎干细胞（含iPS）

成体干细胞（含肿瘤干细胞）干细胞按分化潜能的分类：

全能干细胞（totipotentstemcell）

多能干细胞（pluripotentstemcell）

专能/定向干细胞（unipotent/committedstemcell）干细胞（stemcell）是具有自我更新和分化潜能的细胞，5干细胞的自我更新干细胞的对称分裂symmetrydivision不对称分裂asymmetrydivision干细胞的自我更新干细胞的对称分裂symmetrydivis6造血干细胞造血干细胞7骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞8存在于小肠上皮组织基底层的单能干细胞存在于小肠上皮组织基底层的单能干细胞9干细胞研究的意义临床疾病的细胞移植疗法结合组织工程技术构建人工器官用于器官移植为早期胚胎发育机制研究提供模型为研究发育相关基因的功能提供模型提供更便捷的转基因动物方案发现新基因和基因功能分析新药开发、药效与药物毒性评估的细胞模型干细胞研究的意义临床疾病的细胞移植疗法10干细胞生物学的发展历史20世纪初认识到干细胞是组织细胞自我更新的起源1961年发现骨髓移植治疗白血病的秘密在于骨髓中存在造血干细胞1964年Pierce等发现取自小鼠畸胎瘤的细胞具有多能性1970年Evans从小鼠胚胎中分离并体外培养了胚胎干细胞1981年Evans首次成功建立了小鼠ES细胞系1998年Thomson成功建立了人ES细胞系，点燃了干细胞研究的热情，也引起了广泛的伦理争议1998-99年多种干细胞的跨谱系分化或转分化的突破证明了干细胞的可塑性2000年底英国通过了克隆人类早期胚胎用于分离ES细胞进行医学研究的决议，并率先建立人类干细胞库；日本这年启动的“千年世纪工程”中，干细胞作为四大重点之一干细胞生物学的发展历史20世纪初认识到干细胞是组织细胞自我更112007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、英国科学家马丁-埃文斯，以表彰他们在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现，这些发现使“基因打靶”技术成为可能。MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇12第一节.胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）是指主要来自囊胚内细胞团的多能性干细胞，具有分化为三胚层所有细胞的能力。第一节.胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstem13

形态特征：细胞呈集落生长，集落边缘光滑清晰，细胞间紧密堆积，无明显细胞界限，细胞体积小，核质比大，具有正常二倍体核型。生化特征：表达SSEA、OCT-4、AKP等，端粒酶活性高一、ESC的生物学特性形态特征：一、ESC的生物学特性14ES细胞的多能性ESC具有分化为三胚层来源的各种类型细胞的潜能自发分化：维持未分化状态的条件不存在时，自发分化为各种类型细胞；定向诱导分化：在不同的诱导条件下，可定向分化为特定类型的细胞。ES细胞的自我更新能在体外无限增殖，且保持正常的核型和未分化状态ES细胞的多能性15大学课程干细胞与组织工程课件16ES细胞分化的调控内源性调控：细胞内结构蛋白对分裂的调控转录因子的调控（如OCT4，NANOG，SOX2等）外源性调控：间质细胞分泌的因子（如TGFβ家族，Wnt/β-catenin信号通路）膜蛋白介导的细胞间相互作用（Notch信号通路）整合素（integrin）与ECMES细胞分化的调控17ESC多能性的体现（验证方法）形成畸胎瘤（teratoma）形成类胚体（embryoidbody）直系分化（directdifferentiation）形成嵌合体（chimera）四倍体补偿（tetraploidcomplementation）ESC多能性的体现（验证方法）18畸胎瘤实验ESC注射到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，其中三胚层来源的各类组织杂乱聚集。体内鉴定ESC多能性的指标拟胚体实验拟胚体是ESC悬浮培养后自发分化形成的球状细胞群，能进一步分化为三胚层各类型的细胞。也常在这阶段以不同的诱导物起始定向诱导分化直系分化实验通过控制ESC生长环境或遗传操纵特定基因表达，可诱导其直接分化为特定种系细胞畸胎瘤实验19胚胎嵌合实验将ESC显微注射到囊胚腔中，使ESC能整合到宿主囊胚的内细胞团，嵌合的胚胎移入母体后出生的后代各器官都呈两类细胞的嵌合，表明ESC参与嵌合体各器官的发育，甚至发生生殖系嵌合。四倍体补偿实验2-细胞期诱导2个卵裂球融合形成四倍体，继续发育形成的四倍体囊胚没有ICM，只有滋养层。将ESC显微注射到这种空囊胚中，移植后出生的后代完全来自ESC。被称为验证ESC多能性的金标。胚胎嵌合实验20二、ES细胞的建系培养ES细胞的来源ICM的分离ESC的培养体系二、ES细胞的建系培养ES细胞的来源21ES细胞的来源通常来自囊胚内细胞团或早期的卵裂球也包括原生殖细胞来源的EG细胞或畸胎瘤来源的EC细胞ES细胞的来源22用于ESC建系的囊胚可以来自体内/体外受精或核移植用于ESC建系的囊胚可以来自体内/体外受精或核移植23囊胚内细胞团（ICM）的分离选择高质量囊胚：囊胚腔充分扩张；滋养层完整，细胞单层连续排列；ICM明显，细胞数较多，排列致密。囊胚内细胞团（ICM）的分离选择高质量囊胚：24囊胚内细胞团（ICM）的分离透明带的去除：酸性Tyrode’s液(pH2.5)或链霉蛋白酶(pronase，0.5%)分离ICM：机械分离法免疫外科法组织培养法显微外科法囊胚内细胞团（ICM）的分离透明带的去除：25ES细胞体外培养的关键是应用饲养层细胞（feedercells）和分化抑制因子（常用LIF）ESC的培养体系ES细胞体外培养的关键是应用饲养层细胞（feedercel26ESC的培养体系饲养层细胞（feedercells）指在共培养体系中用于支持ES细胞生长的成纤维细胞，经丝裂霉素C（终浓度0.01mg/ml）处理2-3h失去分裂能力饲养层细胞通过各种分泌细胞因子和提供粘附面支持ESC生长饲养层细胞常用小鼠成纤维细胞系（如STO）、小鼠原代成纤维细胞（PMEF）或同源的成纤维细胞

ESC集落转移1-2次后，生长加快，需1-2天换液，2-3天传代ESC的培养体系饲养层细胞（feedercells）指在共27ESC的培养体系常用的基础培养液为高糖DMEM培养液，添加谷氨酰胺、β-巯基乙醇等常用的细胞因子：

分化抑制因子LIF等

干细胞生长因子（SCF）、bFGF等生长因子hESC临床应用需采用无饲养层细胞培养体系（可用条件培养基或提高bFGF等因子）；也不能使用FBS，可用血清替代品（KSG）ESC的培养体系常用的基础培养液为高糖DMEM培养液，添加谷28hES

cellline,H9hEScellline,H929三、ES细胞的鉴定形态学鉴定碱性磷酸酶（AKP）活性的检测特异转录因子检测（OCT-4,NANOG,SOX2等）特异检测标记（小鼠表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1，灵长类表达SSEA-3/4、肿瘤排斥抗原TRA-1-60和Tra-1-81）核型分析体内分化实验（畸胎瘤）体外分化实验（拟胚体自发分化）三、ES细胞的鉴定形态学鉴定30人ES细胞特异性分子标记的免疫荧光检测人ES细胞特异性分子标记的免疫荧光检测31人ES细胞系的体内分化（注入小鼠体内形成畸胎瘤）A神经上皮细胞丛B骨骼C软骨D横纹肌E肾小球管F表皮样结构人ES细胞系的体内分化（注入小鼠体内形成畸胎瘤）32Isolationofpluripotentembryonicstemcellsfromreprogrammedadultmousesomaticcellnuclei.

CurrentBiology,

2000Isolationofpluripotentembry33InvitrodifferentiationofhumanEScellunderavarietyofconditions人ES细胞的体外分化检测Invitrodifferentiationofhu34四、ES细胞的定向诱导分化

撤去饲养层细胞和分化抑制因子，悬浮培养时，ES细胞形成类胚体（embryoidbody,EB），补充不同的细胞因子，EB将朝不同方向继续分化。四、ES细胞的定向诱导分化撤去饲养层细胞和分化抑制因35ES细胞向神经细胞的定向诱导去除分化抑制因子培养4天成类胚体（EB），加

视黄酸（RA），分化为神经细胞前体，植入凝胶基质，进一步分化为神经元和神经胶质细胞。ES细胞向神经细胞的定向诱导去除分化抑制因子培养4天成类胚体36RA诱导人ES细胞系分化前后的SSEA等标记分子的表达RA诱导人ES细胞系分化前后的SSEA等标记分子的表达37

人ES细胞诱导形成生血细胞集落

人ES细胞与小鼠骨髓间质细胞或卵黄囊内皮细胞共培养，培养液：DMEM＋20％FBS＋2mMglutamine+0.1mMmercaptoethanol+1%NEAA人ES细胞诱导形成生血细胞集落38

HematopoieticcolonyderivedfromEScell(A,B6天，C10天)Hematopoieticcolonyderiv39猴ES细胞诱导形成胚胎血岛样结构BMP-4,EPO,TPO，G-CSF,VEGF等细胞因子促进ES细胞向造血细胞的分化猴ES细胞诱导形成胚胎血岛样结构40五、ES细胞的应用前景发育的细胞和分子机制研究作为外源基因导入的受体细胞生产转基因动物细胞移植疗法和治疗性克隆结合组织工程构建人工器官疾病的动物模型和药物筛选的细胞模型临床应用存在的困难：伦理学等社会因素导致材料来源的限制；材料处理的操作难度高；建系困难；定向诱导分化的效率较低；细胞移植有形成畸胎瘤的风险。五、ES细胞的应用前景发育的细胞和分子机制研究临床应用存在的41细胞移植之路细胞移植之路42大学课程干细胞与组织工程课件43《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》

2004年中国第四条：

禁止进行生殖性克隆人的任何研究。第五条：用于研究的人胚胎干细胞只能通过下列方式获得：

（一）体外受精时多余的配子或囊胚；（二）自然或自愿选择流产的胎儿细胞；

（三）体细胞核移植技术所获得的囊胚和单性分裂囊胚；

（四）自愿捐献的生殖细胞。第六条：进行人胚胎干细胞研究，必须遵守以下行为规范：

（一）利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14天。

（二）不得将前款中获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其它动物的生殖系统。

（三）不得将人的生殖细胞与其他物种的生殖细胞结合。第七条：禁止买卖人类配子、受精卵、胚胎或胎儿组织。第八条：进行人胚胎干细胞研究，必须认真贯彻知情同意与知情选择原则，签署知情同意书，保护爱试者的隐私。《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》2004年中国第四条44JamesThomsonJunyingYuShinyaYamanaka

Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science2007Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell2006Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell2007NobelPrizeinPhysiologyorMedicine

2012六、诱导的多能干细胞JamesThomsonJunyingYuSh45Inducedpluripotentstemcell（iPS

cell）：分化的体细胞通过转染一些关键的转录因子后被重编程，成为具有自我更新和多向分化潜能的类ES细胞Inducedpluripotentstemcell（46iPS细胞的诱导与鉴定诱导基因的选择：Oct4,Sox2,c-myc,Klf4.或Oct4,Sox2,Nanog,Lin28诱导基因的导入方法：反转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒等载体转染iPS的鉴定：作为ES-likecell，鉴定方法同ESC，但应另外鉴定外源性诱导基因的沉默和内源性ESC特异转录因子的启动iPS细胞的诱导与鉴定47大学课程干细胞与组织工程课件48Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science2008Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science2008（山中伸弥）Virus-freeinductionofpluripotencyandsubsequentexcisionofreprogrammingfactors.Nature2009piggyBac

transposition

reprograms

fibroblasts

to

induced

pluri-potent

stem

cells.

Nature2009Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.CellStemCell2009iPS细胞诱导基因导入方法的改进Inducedpluripotentstemcells49iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature2009iPScellsproduceviablemice50iPSC≠ESCiPS细胞是研究细胞重编程机制的重要模型，该技术在改进药物筛选、疾病建模和干细胞治疗等方面具有巨大潜力，且避免伦理学争议，但临床应用还要更慎重。Nature杂志同期发表了三篇论文分别针对iPS细胞的点突变、拷贝数变异及DNA甲基化特征进行了研究，发现iPSC与ESC相比存在明显的遗传缺陷。Somaticcodingmutationsinhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)Copynumbervariationandselectionduringreprogrammingtopluripotency.Nature(2011)Hotspotsofaberrantepigenomicreprogramminginhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)iPSC≠ESCiPS细胞是研究细胞重编程机制的重要51DirectConversionofFibroblastsintoStablyExpandableNeuralStemCells.Cellstemcell,2012体细胞成体干细胞DirectConversionofFibroblas52体细胞不经iPS直接诱导为成体干细胞有什么意义？体细胞不经iPS直接诱导为成体干细胞有什么意义？53iPS技术诞生后，干细胞临床治疗的希望几乎完全被寄托在iPSC上，治疗性克隆研究步入低谷。随着iPSC安全性问题的存在和体细胞核移植来源的人ESC的成功构建，治疗性克隆研究又重新被重视。iPS技术诞生后，干细胞临床治疗的希望几乎完全被寄托在iPS54第二节.成体干细胞第二节.成体干细胞55成体/组织干细胞（somatic/tissuestemcell）：存在于动物组织中的未分化细胞，可以自我更新，并具有定向分化为所在组织中的各种类型细胞的潜能。基本功能：更新、维持和修复所在组织器官，保持组织生长和衰退的动态平衡成体干细胞的可塑性（plasticity）：在特定条件下成体干细胞可能分化成其组织来源以外的细胞类型，实现跨系统甚至跨谱系的分化。也称为干细胞的横向分化成体/组织干细胞（somatic/tissuestemc56大学课程干细胞与组织工程课件57一、造血干细胞造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）：存在于骨髓、外周血和脐带血中，体内分化为各种血细胞一、造血干细胞造血干细胞（hematopoieticste58DevelopmentofhaematopoieticstemcellsDevelopmentofhaematopoietic59造血干细胞的特征HSC呈圆形，直径8微米，骨髓中数量占有核细胞总数的1%分为长期HSC、短期HSC（保持8个月的自我更新能力）和多功能祖细胞（失去自我更新能力，进入分化通道）细胞表面标志：hHSC上发现最早也是最常用的标志分子是CD34，大部分CD34阳性细胞也表达CD133和CDCP1，其它表面标志随着个体发育阶段的不同有变化，但这些标志并非HSC特异的。造血干细胞的特征HSC呈圆形，直径8微米，骨髓中数量占有核细60造血干细胞的分离非抗体介导分离法利用密度梯度离心将造血干细胞与密度较大的细胞（红细胞和有粒白细胞）分开，结合药物如氟尿嘧啶（5-FU），杀死分裂期的淋巴细胞，留下纯度较高的HSC。抗体介导分离法借助抗体将特定细胞吸附在烧瓶、柱子或磁珠等基质上，从而将阳性细胞与其它细胞分开。分为阳性选择法和阴性选择法。人HSC阳性筛选时最常用的是针对CD34的抗体。造血干细胞的分离非抗体介导分离法61造血干细胞移植骨髓动员：以细胞因子刺激骨髓HSC迁移到外周血，常用的动员剂是重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等HSC归巢：HSC经静脉输入人体，与基质细胞、髓窦内皮细胞和骨髓基质内各种粘附分子相互作用，并受细胞因子调节而植入骨髓干细胞龛（niche）内，重建造血功能造血干细胞移植骨髓动员：以细胞因子刺激骨髓HSC迁移到外周血62对归巢起作用的最重要分子是趋化因子SDF-1，骨髓内皮细胞等表达的SDF-1与CD34+细胞表面的受体CXCR4结合，从而捕获造血干/祖细胞对归巢起作用的最重要分子是趋化因子SDF-1，骨髓内皮细胞等63脐带血储备的意义造血干/祖细胞丰富其中淋巴细胞大多为幼稚型T细胞，免疫反应弱进入细胞周期的干细胞较多，可作为遗传病治疗的靶细胞干细胞可长期贮备采集脐带血对供者无影响脐带血储备的意义造血干/祖细胞丰富64二、间充质干细胞间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）是存在于骨髓及骨髓外多个组织的多能干细胞，可分化为各种间充质细胞。二、间充质干细胞间充质干细胞（mesenchymalste65MSC的生物学特征体外形态：先贴壁呈成纤维细胞样，之后部分形成集落，处于相对静息期和活跃期的细胞形态结构明显不同体内作用：参与组织细胞的更新和受损组织的修复。支持HSC的增殖和分化；自身可分化为造血实质细胞和基质细胞，还可分化为造血系统以外的细胞表面标志：来源于不同组织的MSC在形态、分化能力和基因表达上不同，但表达相似的标志物：CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR等MSC的生物学特征体外形态：先贴壁呈成纤维细胞样，之后部分形66MSC的分离密度梯度离心法差异贴壁筛选法流式细胞仪分选法免疫磁珠分选法MSC的分离密度梯度离心法67大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5min。剥离股骨和胫骨，置于75%酒精的烧杯中，移入超净台。将胫骨、股骨置于培养皿中加入10mlPBS，进一步剥离附着组织，少量PBS冲洗，加入12mlDMEM完全培养基。在培养基中剪断骨干两端，注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打制成细胞悬液。离心管中加入10mlPercoll分离液，将细胞悬液倾斜缓缓加入（不能冲破Percoll分离液面），用8ml培养液冲洗培养皿，再加入离心管。2500-3000rpm离心30min，先吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出移至另一离心管。加20mlPBS反复吹打混匀，1800rpm离心10min，弃上清。重复离心一次，弃上清。加入5ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。BMSC的分离培养大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5min。68MSC的研究意义和应用MSC是研究干细胞可塑性的最好模型取材方便，容易体外培养，是临床细胞治疗和基因治疗较理想的载体具有多向分化潜能，在很多组织修复方面有巨大的潜力：如心肌修复、骨骼重建、皮肤修复及神经退行性疾病的治疗等具有免疫调节功能，表现为免疫抑制和抑制炎症反应，临床上可移植MSC以终止破坏性的炎症反应具有肿瘤细胞趋向性，可利用其作为靶向治疗的载体细胞，转基因的MSC在肿瘤部位表达特定物质调节肿瘤微环境，以定向杀死肿瘤细胞MSC的研究意义和应用MSC是研究干细胞可塑性的最好模型69三、神经干细胞神经干细胞（neuralstemcell，NSC）是指可以分化为神经系统各类细胞的专能干细胞。成年动物NSC主要集中在室管膜下区（SVZ）和海马齿状回颗粒下区（SGZ）。三、神经干细胞神经干细胞（neuralstemcell，70NSC的生物学特征体外形态：圆形，聚集成团，称为神经球（neurophere），其中含有神经干/祖细胞、各类神经前体细胞（NPC）及分化的神经元和神经胶质细胞等NSC多处于静息状态，不表达成熟的表面抗原，因此免疫原性较弱，移植后的免疫排斥较轻分子标志：胞质nestin是目前最常用的神经干/祖细胞标志物，也可用表面标志LeX和CD133NSC分化伴随了NPC的迁移：发育阶段迁移到特定部位才能分化出具特殊功能的神经元；NSC移植存活后也可迁移出移植区，与宿主组织建立突触联系NSC的生物学特征体外形态：圆形，聚集成团，称为神经球（ne71NSC的分离培养和建系从胚胎神经组织或成体脑组织分离，方法：机械分离、酶消化、流式细胞仪分选、免疫磁珠法等体外培养通常采用无血清培养，避免血清成分刺激分化。基础培养液DMEM/F12，添加B27或N2作能源，添加EGF和bFGF促进增殖可以贴壁培养或悬浮培养（即神经球法，球直径100-200微米时传代）NSC体外增殖活性低，容易分化，通过导入原癌基因的方法可使其永生化，建立细胞系（如C17.2）NSC的分离培养和建系从胚胎神经组织或成体脑组织分离，方法：72NSC的临床应用干细胞移植治疗神经退行性疾病（PD，HD，AD）NSC对脑胶质瘤细胞具趋向性，可跟踪转移的胶质瘤细胞，实现靶向治疗也可作为转基因治疗的载体细胞NSC的临床应用干细胞移植治疗神经退行性疾病（PD，HD，A73四、表皮干细胞表皮干细胞（Epidermal

stem

cell）位于表皮基底层和毛囊根部的专能干细胞，能分化为表皮中各种类型细胞，终生维持表皮组织的自我更新四、表皮干细胞表皮干细胞（Epidermal

stem

ce74表皮干细胞的生物学特性标志分子：干细胞：角蛋白（keratin）K8、K15、K18、K19，α6和β1整合素（integrin）祖细胞：K5、K14、β1分化的表皮细胞：K1、K10ESC通过表达整合素实现对基底膜的粘附作用ESC常处于G0期，细胞大小是形成克隆的决定因素表皮干细胞的生物学特性标志分子：75表皮干细胞的分离培养表皮干细胞的分离培养76表皮干细胞的应用皮肤损伤修复皮肤组织工程（人工皮肤）基因治疗载体表皮干细胞的应用皮肤损伤修复77五、肿瘤干细胞肿瘤干细胞（tumorstemcell，TSC）是存在于肿瘤组织中的极少数具有干细胞性质的肿瘤细胞群体五、肿瘤干细胞肿瘤干细胞（tumorstemcell，T78肿瘤干细胞学说肿瘤组织中存在的极少量充当干细胞角色的肿瘤细胞（即肿瘤干细胞）在启动肿瘤形成和生长中具有决定性作用。理论依据：干细胞与肿瘤细胞的相似性形态上幼稚；无限增殖能力；调节自我更新的机制和信号转导途径；迁移或转移能力；异质性；端粒酶活性；分化和转分化能力。因此肿瘤可能起源于干细胞。有大量实验研究和临床观察证实TSC的存在，但至今没有分离到TSC的报道。ReyaT.etal.Stemcells,cancer,andcancerstemcells.Nature,2001肿瘤干细胞学说肿瘤组织中存在的极少量充当干细胞角色的肿瘤细胞79

Signallingpathwaysthatregulateself-renewalmechanismsduringnormalstemcelldevelopmentandduringtransformation.

Signallingpathwaysthatregu80肿瘤干细胞存在的临床意义Conventionaltherapiesmayshrinktumoursbykillingmainlycellswithlimitedproliferativepotential.肿瘤干细胞存在的临床意义Conventionalthera81第三节.组织工程第三节.组织工程821980年Burke和Yannas将皮肤成纤维细胞和角质细胞接种在蛋白支架上，第一次得到具有真皮层的人工皮肤1995年CharlesVacanti将人软骨细胞-支架一起植入裸鼠背部，长出人耳的小鼠引起广泛争议1980年Burke和Yannas将皮肤成纤维细胞和角质细胞83组织工程（tissueengineering）是利用工程学和生命科学的基本原理、方法和技术在体外构建有活性的组织器官，以达到修复缺损组织的目的。基本原理：将自体或异体的细胞体外扩增，作为种子细胞接种到构建好的生物活性支架上，这种支架良好的生物相容性和添加的基质成分支持细胞迁移、铺展、生长和分化，形成具有特定形态和功能活性的细胞-材料复合物。移植到受损组织器官内，生物材料可降解吸收，细胞不断增殖，与受体器官形成一个有机整体。一、组织工程的原理组织工程（tissueengineering）是利用工程学84组织工程的核心要素：种子细胞、三维支架组织工程的核心要素：种子细胞、三维支架85种子细胞：具有较强的增殖能力；能分化成工程化组织期望的细胞；能适应生物支架。可来源于自体、异体或异种各类干细胞是最理想的种子细胞生物支架（scaffold）：具有生物活性，支持细胞增殖分化；有合适的空隙率和强度；具有良好生物相容性和低免疫原性；可降解。包括天然材料、人工合成高分子聚合物、复合材料三类种子细胞：具有较强的增殖能力；能分化成工程化组织期望的细胞；86组织工程技术的关键步骤种子细胞的分离培养三维支架材料的构建细胞的接种和灌注培养意义人工组织器官移植再生医学（regenerativemedicine）组织工程技术的关键步骤意义人工组织器官移植87二、组织工程的临床应用构建人工组织器官，用于替代或修复因老化、手术、受伤、疾病或遗传因素等造成的器官功能缺损，属于再生医学（regenerativemedicine）二、组织工程的临床应用构建人工组织器官，用于替代或修复因老化88人工皮肤（artificialskin）组织工程中发展较快的领域，经历了三代产品的发展：表皮替代物、真皮替代物、全皮替代物人工皮肤（artificialskin）组织工程中发展较快89SkintissueengineeringstrategiesandapproachesSkintissueengineeringstrate90Histologicalstainingofinvivoskinandinvitro-engineeredepidermal/dermalskinsubstituteDermalhydrogelforstemcell-mediatedwoundhealingHistologicalstainingofinvi91Schematicofaninvitro-engineeredepidermal/dermalskintumormodelwithmelanomacellsSchematicofaninvitro-engin92ArtificialbladderArtificialbladder93CombiningtherapeuticcloningandtissueengineeringtoproducekidneytissueCombiningtherapeuticcloning94Regenerativemedicinestrategies.JournalofPediatricSurgery,2012Stemcellsandliverengineering.BiotechnologyAdvances,2013Celltherapy,3Dculturesystemsandtissueengineeringforcardiacregeneration.AdvancedDrugDeliveryReviews,2014Progressincell-basedtherapiesfortendonrepair.AdvancedDrugDeliveryReviews,2015Design,Materials,andMechanobiologyofBiodegradableScaffoldsforBoneTissueEngineering.BioMedResearchInternational,2015Stemcelltechnologyforboneregeneration-currentstatusandpotentialapplications.StemCellsandCloning,

2015Regenerativemedicinestrategi95思考题干细胞的概念、基本特性和分类ES细胞的形态和生化特征ESC多能性的理解，如何验证？ESC培养的要点ESC鉴定常用的方法ESC有哪些应用？iPSC的概念及与ESC的优劣成体干细胞的概念、功能与可塑性造血干细胞的特征，什么是骨髓动员和HSC归巢？间充质干细胞的特征和研究意义神经干细胞的特征和临床应用肿瘤干细胞学说、理论依据和临床意义组织工程的基本原理，种子细胞和生物支架的特点思考题96第七章.干细胞与组织工程StemCell&TissueEngineering第七章.干细胞与组织工程StemCell&Tissu97有关干细胞领域的研究成果多次获得世界十大科技进展2006年干细胞培育器官获重要进展

2007年人的诱导多能干细胞（iPS细胞）诞生

2008年美、英干细胞研究获一系列新进展

2009年无病毒转染获得iPS细胞

2012年癌症干细胞研究获新证据；日本科学家首次用“人造”卵子产下小鼠；德国首次从皮肤细胞中培养出成体干细胞

2013年人类克隆来源的胚胎干细胞有关干细胞领域的研究成果多次获得世界十大科技进展2006年干98Definingthemodeoftumourgrowthbyclonalanalysis.Nature,2012Arestrictedcellpopulationpropagatesglioblastomagrowthafterchemotherapy.Nature,2012LineageTracingRevealsLgr5+

StemCellActivityinMouseIntestinalAdenomas.Science,2012癌症干细胞驱动肿瘤的发生，并逃避放化疗引起复发Definingthemodeoftumourgr99OffspringfromOocytesDerivedfrominVitroPrimordialGermCell–LikeCellsinMice.Science,2012OffspringfromOocytesDerived100干细胞（stemcell）是具有自我更新和分化潜能的细胞，可以分化产生一种以上的“专业”细胞。干细胞基本特性：self-renewal;differentiation干细胞按来源的分类：

胚胎干细胞（含iPS）

成体干细胞（含肿瘤干细胞）干细胞按分化潜能的分类：

全能干细胞（totipotentstemcell）

多能干细胞（pluripotentstemcell）

专能/定向干细胞（unipotent/committedstemcell）干细胞（stemcell）是具有自我更新和分化潜能的细胞，101干细胞的自我更新干细胞的对称分裂symmetrydivision不对称分裂asymmetrydivision干细胞的自我更新干细胞的对称分裂symmetrydivis102造血干细胞造血干细胞103骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞104存在于小肠上皮组织基底层的单能干细胞存在于小肠上皮组织基底层的单能干细胞105干细胞研究的意义临床疾病的细胞移植疗法结合组织工程技术构建人工器官用于器官移植为早期胚胎发育机制研究提供模型为研究发育相关基因的功能提供模型提供更便捷的转基因动物方案发现新基因和基因功能分析新药开发、药效与药物毒性评估的细胞模型干细胞研究的意义临床疾病的细胞移植疗法106干细胞生物学的发展历史20世纪初认识到干细胞是组织细胞自我更新的起源1961年发现骨髓移植治疗白血病的秘密在于骨髓中存在造血干细胞1964年Pierce等发现取自小鼠畸胎瘤的细胞具有多能性1970年Evans从小鼠胚胎中分离并体外培养了胚胎干细胞1981年Evans首次成功建立了小鼠ES细胞系1998年Thomson成功建立了人ES细胞系，点燃了干细胞研究的热情，也引起了广泛的伦理争议1998-99年多种干细胞的跨谱系分化或转分化的突破证明了干细胞的可塑性2000年底英国通过了克隆人类早期胚胎用于分离ES细胞进行医学研究的决议，并率先建立人类干细胞库；日本这年启动的“千年世纪工程”中，干细胞作为四大重点之一干细胞生物学的发展历史20世纪初认识到干细胞是组织细胞自我更1072007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇和奥利弗-史密西斯、英国科学家马丁-埃文斯，以表彰他们在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现，这些发现使“基因打靶”技术成为可能。MarioR.CapecchiSirMartinJ.EvansOliverSmithies2007年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家马里奥-卡佩奇108第一节.胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstemcell，ESC）是指主要来自囊胚内细胞团的多能性干细胞，具有分化为三胚层所有细胞的能力。第一节.胚胎干细胞胚胎干细胞（embryonicstem109

形态特征：细胞呈集落生长，集落边缘光滑清晰，细胞间紧密堆积，无明显细胞界限，细胞体积小，核质比大，具有正常二倍体核型。生化特征：表达SSEA、OCT-4、AKP等，端粒酶活性高一、ESC的生物学特性形态特征：一、ESC的生物学特性110ES细胞的多能性ESC具有分化为三胚层来源的各种类型细胞的潜能自发分化：维持未分化状态的条件不存在时，自发分化为各种类型细胞；定向诱导分化：在不同的诱导条件下，可定向分化为特定类型的细胞。ES细胞的自我更新能在体外无限增殖，且保持正常的核型和未分化状态ES细胞的多能性111大学课程干细胞与组织工程课件112ES细胞分化的调控内源性调控：细胞内结构蛋白对分裂的调控转录因子的调控（如OCT4，NANOG，SOX2等）外源性调控：间质细胞分泌的因子（如TGFβ家族，Wnt/β-catenin信号通路）膜蛋白介导的细胞间相互作用（Notch信号通路）整合素（integrin）与ECMES细胞分化的调控113ESC多能性的体现（验证方法）形成畸胎瘤（teratoma）形成类胚体（embryoidbody）直系分化（directdifferentiation）形成嵌合体（chimera）四倍体补偿（tetraploidcomplementation）ESC多能性的体现（验证方法）114畸胎瘤实验ESC注射到裸鼠皮下，形成畸胎瘤，其中三胚层来源的各类组织杂乱聚集。体内鉴定ESC多能性的指标拟胚体实验拟胚体是ESC悬浮培养后自发分化形成的球状细胞群，能进一步分化为三胚层各类型的细胞。也常在这阶段以不同的诱导物起始定向诱导分化直系分化实验通过控制ESC生长环境或遗传操纵特定基因表达，可诱导其直接分化为特定种系细胞畸胎瘤实验115胚胎嵌合实验将ESC显微注射到囊胚腔中，使ESC能整合到宿主囊胚的内细胞团，嵌合的胚胎移入母体后出生的后代各器官都呈两类细胞的嵌合，表明ESC参与嵌合体各器官的发育，甚至发生生殖系嵌合。四倍体补偿实验2-细胞期诱导2个卵裂球融合形成四倍体，继续发育形成的四倍体囊胚没有ICM，只有滋养层。将ESC显微注射到这种空囊胚中，移植后出生的后代完全来自ESC。被称为验证ESC多能性的金标。胚胎嵌合实验116二、ES细胞的建系培养ES细胞的来源ICM的分离ESC的培养体系二、ES细胞的建系培养ES细胞的来源117ES细胞的来源通常来自囊胚内细胞团或早期的卵裂球也包括原生殖细胞来源的EG细胞或畸胎瘤来源的EC细胞ES细胞的来源118用于ESC建系的囊胚可以来自体内/体外受精或核移植用于ESC建系的囊胚可以来自体内/体外受精或核移植119囊胚内细胞团（ICM）的分离选择高质量囊胚：囊胚腔充分扩张；滋养层完整，细胞单层连续排列；ICM明显，细胞数较多，排列致密。囊胚内细胞团（ICM）的分离选择高质量囊胚：120囊胚内细胞团（ICM）的分离透明带的去除：酸性Tyrode’s液(pH2.5)或链霉蛋白酶(pronase，0.5%)分离ICM：机械分离法免疫外科法组织培养法显微外科法囊胚内细胞团（ICM）的分离透明带的去除：121ES细胞体外培养的关键是应用饲养层细胞（feedercells）和分化抑制因子（常用LIF）ESC的培养体系ES细胞体外培养的关键是应用饲养层细胞（feedercel122ESC的培养体系饲养层细胞（feedercells）指在共培养体系中用于支持ES细胞生长的成纤维细胞，经丝裂霉素C（终浓度0.01mg/ml）处理2-3h失去分裂能力饲养层细胞通过各种分泌细胞因子和提供粘附面支持ESC生长饲养层细胞常用小鼠成纤维细胞系（如STO）、小鼠原代成纤维细胞（PMEF）或同源的成纤维细胞

ESC集落转移1-2次后，生长加快，需1-2天换液，2-3天传代ESC的培养体系饲养层细胞（feedercells）指在共123ESC的培养体系常用的基础培养液为高糖DMEM培养液，添加谷氨酰胺、β-巯基乙醇等常用的细胞因子：

分化抑制因子LIF等

干细胞生长因子（SCF）、bFGF等生长因子hESC临床应用需采用无饲养层细胞培养体系（可用条件培养基或提高bFGF等因子）；也不能使用FBS，可用血清替代品（KSG）ESC的培养体系常用的基础培养液为高糖DMEM培养液，添加谷124hES

cellline,H9hEScellline,H9125三、ES细胞的鉴定形态学鉴定碱性磷酸酶（AKP）活性的检测特异转录因子检测（OCT-4,NANOG,SOX2等）特异检测标记（小鼠表达阶段特异性胚胎抗原SSEA-1，灵长类表达SSEA-3/4、肿瘤排斥抗原TRA-1-60和Tra-1-81）核型分析体内分化实验（畸胎瘤）体外分化实验（拟胚体自发分化）三、ES细胞的鉴定形态学鉴定126人ES细胞特异性分子标记的免疫荧光检测人ES细胞特异性分子标记的免疫荧光检测127人ES细胞系的体内分化（注入小鼠体内形成畸胎瘤）A神经上皮细胞丛B骨骼C软骨D横纹肌E肾小球管F表皮样结构人ES细胞系的体内分化（注入小鼠体内形成畸胎瘤）128Isolationofpluripotentembryonicstemcellsfromreprogrammedadultmousesomaticcellnuclei.

CurrentBiology,

2000Isolationofpluripotentembry129InvitrodifferentiationofhumanEScellunderavarietyofconditions人ES细胞的体外分化检测Invitrodifferentiationofhu130四、ES细胞的定向诱导分化

撤去饲养层细胞和分化抑制因子，悬浮培养时，ES细胞形成类胚体（embryoidbody,EB），补充不同的细胞因子，EB将朝不同方向继续分化。四、ES细胞的定向诱导分化撤去饲养层细胞和分化抑制因131ES细胞向神经细胞的定向诱导去除分化抑制因子培养4天成类胚体（EB），加

视黄酸（RA），分化为神经细胞前体，植入凝胶基质，进一步分化为神经元和神经胶质细胞。ES细胞向神经细胞的定向诱导去除分化抑制因子培养4天成类胚体132RA诱导人ES细胞系分化前后的SSEA等标记分子的表达RA诱导人ES细胞系分化前后的SSEA等标记分子的表达133

人ES细胞诱导形成生血细胞集落

人ES细胞与小鼠骨髓间质细胞或卵黄囊内皮细胞共培养，培养液：DMEM＋20％FBS＋2mMglutamine+0.1mMmercaptoethanol+1%NEAA人ES细胞诱导形成生血细胞集落134

HematopoieticcolonyderivedfromEScell(A,B6天，C10天)Hematopoieticcolonyderiv135猴ES细胞诱导形成胚胎血岛样结构BMP-4,EPO,TPO，G-CSF,VEGF等细胞因子促进ES细胞向造血细胞的分化猴ES细胞诱导形成胚胎血岛样结构136五、ES细胞的应用前景发育的细胞和分子机制研究作为外源基因导入的受体细胞生产转基因动物细胞移植疗法和治疗性克隆结合组织工程构建人工器官疾病的动物模型和药物筛选的细胞模型临床应用存在的困难：伦理学等社会因素导致材料来源的限制；材料处理的操作难度高；建系困难；定向诱导分化的效率较低；细胞移植有形成畸胎瘤的风险。五、ES细胞的应用前景发育的细胞和分子机制研究临床应用存在的137细胞移植之路细胞移植之路138大学课程干细胞与组织工程课件139《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》

2004年中国第四条：

禁止进行生殖性克隆人的任何研究。第五条：用于研究的人胚胎干细胞只能通过下列方式获得：

（一）体外受精时多余的配子或囊胚；（二）自然或自愿选择流产的胎儿细胞；

（三）体细胞核移植技术所获得的囊胚和单性分裂囊胚；

（四）自愿捐献的生殖细胞。第六条：进行人胚胎干细胞研究，必须遵守以下行为规范：

（一）利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14天。

（二）不得将前款中获得的已用于研究的人囊胚植入人或任何其它动物的生殖系统。

（三）不得将人的生殖细胞与其他物种的生殖细胞结合。第七条：禁止买卖人类配子、受精卵、胚胎或胎儿组织。第八条：进行人胚胎干细胞研究，必须认真贯彻知情同意与知情选择原则，签署知情同意书，保护爱试者的隐私。《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》2004年中国第四条140JamesThomsonJunyingYuShinyaYamanaka

Inducedpluripotentstemcelllinesderivedfromhumansomaticcells.Science2007Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.Cell2006Inductionofpluripotentstemcellsfromadulthumanfibroblastsbydefinedfactors.Cell2007NobelPrizeinPhysiologyorMedicine

2012六、诱导的多能干细胞JamesThomsonJunyingYuSh141Inducedpluripotentstemcell（iPS

cell）：分化的体细胞通过转染一些关键的转录因子后被重编程，成为具有自我更新和多向分化潜能的类ES细胞Inducedpluripotentstemcell（142iPS细胞的诱导与鉴定诱导基因的选择：Oct4,Sox2,c-myc,Klf4.或Oct4,Sox2,Nanog,Lin28诱导基因的导入方法：反转录病毒、慢病毒、腺病毒、质粒等载体转染iPS的鉴定：作为ES-likecell，鉴定方法同ESC，但应另外鉴定外源性诱导基因的沉默和内源性ESC特异转录因子的启动iPS细胞的诱导与鉴定143大学课程干细胞与组织工程课件144Inducedpluripotentstemcellsgeneratedwithoutviralintegration.Science2008Generationofmouseinducedpluripotentstemcellswithoutviralvectors.Science2008（山中伸弥）Virus-freeinductionofpluripotencyandsubsequentexcisionofreprogrammingfactors.Nature2009piggyBac

transposition

reprograms

fibroblasts

to

induced

pluri-potent

stem

cells.

Nature2009Generationofinducedpluripotentstemcellsusingrecombinantproteins.CellStemCell2009iPS细胞诱导基因导入方法的改进Inducedpluripotentstemcells145iPScellsproduceviablemicethroughtetraploidcomplementation.Nature2009iPScellsproduceviablemice146iPSC≠ESCiPS细胞是研究细胞重编程机制的重要模型，该技术在改进药物筛选、疾病建模和干细胞治疗等方面具有巨大潜力，且避免伦理学争议，但临床应用还要更慎重。Nature杂志同期发表了三篇论文分别针对iPS细胞的点突变、拷贝数变异及DNA甲基化特征进行了研究，发现iPSC与ESC相比存在明显的遗传缺陷。Somaticcodingmutationsinhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)Copynumbervariationandselectionduringreprogrammingtopluripotency.Nature(2011)Hotspotsofaberrantepigenomicreprogramminginhumaninducedpluripotentstemcells.Nature(2011)iPSC≠ESCiPS细胞是研究细胞重编程机制的重要147DirectConversionofFibroblastsintoStablyExpandableNeuralStemCells.Cellstemcell,2012体细胞成体干细胞DirectConversionofFibroblas148体细胞不经iPS直接诱导为成体干细胞有什么意义？体细胞不经iPS直接诱导为成体干细胞有什么意义？149iPS技术诞生后，干细胞临床治疗的希望几乎完全被寄托在iPSC上，治疗性克隆研究步入低谷。随着iPSC安全性问题的存在和体细胞核移植来源的人ESC的成功构建，治疗性克隆研究又重新被重视。iPS技术诞生后，干细胞临床治疗的希望几乎完全被寄托在iPS150第二节.成体干细胞第二节.成体干细胞151成体/组织干细胞（somatic/tissuestemcell）：存在于动物组织中的未分化细胞，可以自我更新，并具有定向分化为所在组织中的各种类型细胞的潜能。基本功能：更新、维持和修复所在组织器官，保持组织生长和衰退的动态平衡成体干细胞的可塑性（plasticity）：在特定条件下成体干细胞可能分化成其组织来源以外的细胞类型，实现跨系统甚至跨谱系的分化。也称为干细胞的横向分化成体/组织干细胞（somatic/tissuestemc152大学课程干细胞与组织工程课件153一、造血干细胞造血干细胞（hematopoieticstemcell，HSC）：存在于骨髓、外周血和脐带血中，体内分化为各种血细胞一、造血干细胞造血干细胞（hematopoieticste154DevelopmentofhaematopoieticstemcellsDevelopmentofhaematopoietic155造血干细胞的特征HSC呈圆形，直径8微米，骨髓中数量占有核细胞总数的1%分为长期HSC、短期HSC（保持8个月的自我更新能力）和多功能祖细胞（失去自我更新能力，进入分化通道）细胞表面标志：hHSC上发现最早也是最常用的标志分子是CD34，大部分CD34阳性细胞也表达CD133和CDCP1，其它表面标志随着个体发育阶段的不同有变化，但这些标志并非HSC特异的。造血干细胞的特征HSC呈圆形，直径8微米，骨髓中数量占有核细156造血干细胞的分离非抗体介导分离法利用密度梯度离心将造血干细胞与密度较大的细胞（红细胞和有粒白细胞）分开，结合药物如氟尿嘧啶（5-FU），杀死分裂期的淋巴细胞，留下纯度较高的HSC。抗体介导分离法借助抗体将特定细胞吸附在烧瓶、柱子或磁珠等基质上，从而将阳性细胞与其它细胞分开。分为阳性选择法和阴性选择法。人HSC阳性筛选时最常用的是针对CD34的抗体。造血干细胞的分离非抗体介导分离法157造血干细胞移植骨髓动员：以细胞因子刺激骨髓HSC迁移到外周血，常用的动员剂是重组人粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等HSC归巢：HSC经静脉输入人体，与基质细胞、髓窦内皮细胞和骨髓基质内各种粘附分子相互作用，并受细胞因子调节而植入骨髓干细胞龛（niche）内，重建造血功能造血干细胞移植骨髓动员：以细胞因子刺激骨髓HSC迁移到外周血158对归巢起作用的最重要分子是趋化因子SDF-1，骨髓内皮细胞等表达的SDF-1与CD34+细胞表面的受体CXCR4结合，从而捕获造血干/祖细胞对归巢起作用的最重要分子是趋化因子SDF-1，骨髓内皮细胞等159脐带血储备的意义造血干/祖细胞丰富其中淋巴细胞大多为幼稚型T细胞，免疫反应弱进入细胞周期的干细胞较多，可作为遗传病治疗的靶细胞干细胞可长期贮备采集脐带血对供者无影响脐带血储备的意义造血干/祖细胞丰富160二、间充质干细胞间充质干细胞（mesenchymalstemcell，MSC）是存在于骨髓及骨髓外多个组织的多能干细胞，可分化为各种间充质细胞。二、间充质干细胞间充质干细胞（mesenchymalste161MSC的生物学特征体外形态：先贴壁呈成纤维细胞样，之后部分形成集落，处于相对静息期和活跃期的细胞形态结构明显不同体内作用：参与组织细胞的更新和受损组织的修复。支持HSC的增殖和分化；自身可分化为造血实质细胞和基质细胞，还可分化为造血系统以外的细胞表面标志：来源于不同组织的MSC在形态、分化能力和基因表达上不同，但表达相似的标志物：CD73、CD90和CD105，不表达CD34、CD45、CD14、HLA-DR等MSC的生物学特征体外形态：先贴壁呈成纤维细胞样，之后部分形162MSC的分离密度梯度离心法差异贴壁筛选法流式细胞仪分选法免疫磁珠分选法MSC的分离密度梯度离心法163大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5min。剥离股骨和胫骨，置于75%酒精的烧杯中，移入超净台。将胫骨、股骨置于培养皿中加入10mlPBS，进一步剥离附着组织，少量PBS冲洗，加入12mlDMEM完全培养基。在培养基中剪断骨干两端，注射器吸取培养基插入一头断端将骨髓从另一头冲出，反复吹打制成细胞悬液。离心管中加入10mlPercoll分离液，将细胞悬液倾斜缓缓加入（不能冲破Percoll分离液面），用8ml培养液冲洗培养皿，再加入离心管。2500-3000rpm离心30min，先吸去上层红色培养基层，将吸管伸至中间白色絮状层将其缓慢吸出移至另一离心管。加20mlPBS反复吹打混匀，1800rpm离心10min，弃上清。重复离心一次，弃上清。加入5ml完全培养基，吹打混匀，接种于培养瓶中。BMSC的分离培养大鼠，乙醚麻醉，颈椎脱臼处死，75%酒精浸泡消毒5min。164MSC的研究意义和应用MSC是研究干细胞可塑性的最好模型取材方便，容易体外培养，是临床细胞治疗和基因治疗较理想的载体具有多向分化潜能，在很多组织修复方面有巨大的潜力：如心肌修复、骨骼重建、皮肤修复及神经退行性疾病的治疗等具有免疫调节功能，表现为免疫抑制和抑制炎症反应，临床上可移植MSC以终止破坏性的炎症反应具有肿瘤细胞趋向性，可利用其作为靶向治疗的载体细胞，转基因的MSC在肿瘤部位表达特定物质调节肿瘤微环境，以定向杀死肿瘤细胞MSC的研究意义和应用MSC是研究干细胞可塑性的最好模型165三、神经干细胞神经干细胞（neuralstemcell，NSC）是指可以分化为神经系统各类细胞的专能干细胞。成年动物NSC主要集中在室管膜下区（SVZ）和海马齿状回颗粒下区（SGZ）。三、神经干细胞神经干细胞（neuralstemcell，166NSC的生物学特征体外形态：圆形，聚集成团，称为神经球（neurophere），其中含有神经干/祖细胞、各类神经前体细胞（NPC）及分化的神经元和神经胶质细胞等NSC多处于静息状态，不表达成熟的表面抗原，因此免疫原性较弱，移植后的免疫排斥较轻分子标志：胞质nestin是目前最常用的神经干/祖细胞标志物，也可用表面标志LeX和CD133NSC分化伴随了NPC的迁移：发育阶段迁移到特定部位才能分化出具特殊功能的神经元；NSC移植存活后也可迁移出移植区，与宿主组织建立突触联系NSC的生物学特征体外形态：圆形，聚集成团，称为神经球（ne167NSC的分离培养和建系从胚胎神经组织或成体脑组织分离，方法：机械分离、酶消化、流式细胞仪分选、免疫磁珠法等体外培养通常采用无血清培养，避免血清成分刺激分化。基础培养液DMEM/F12，添加B27或N2作能源，添加EGF和bFGF促进增殖可以贴壁培养或悬浮培养（即神经球法，球直径100-200微米