植物组织培养复习

绪论第一节植物组织培养的一般概念植物细胞组织培养的概念（P1）植物细胞组织培养（PlantCellandTissueCulture）：是指在离体（invitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。主要有:原生质体（Protoplast）培养悬浮细胞培养组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培养器官（胚，花药，子房，根和茎）培养其中最常见的是愈伤组织培养。植物细胞组织培养范畴：（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。（狭义）组织培养：指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。愈伤组织（callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。外植体（explant）：在植物细胞组织培养中，由活体（invivo）植物体上取下来的，接种在培养基上无菌细胞、组织器官等用于离体培养的材料。植物组织培养的分类1、培养基：固体培养、液体培养2、组织培养按培养对象可分为（外植体）植株培养、器官培养、组织培养、细胞培养、原生质体培养A植株培养(plantculture)：对完整植株材料的培养。扦插苗培养、种子苗培养B器官培养(organculture)：即离体器官的培养。根据作用和需要的不同，可以包括分离茎尖、茎段、根尖、叶片、叶原基、子叶、花瓣、雄蕊、雌蕊、胚珠、胚、子房、果实等外植体的培养。根系培养、茎段培养、叶片培养、花器培养、果实培养、种子培养C组织或愈伤组织培养(tissue，callusculture)：是对植物体的各部分组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株。分生组织培养、薄壁组织培养、输导组织培养D细胞培养(cellculture)：是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养。看护培养、平板培养、悬浮培养、微室培养E原生质体培养(proplastculture)：是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。非融合培养、融合培养植物组织培养的生理依据细胞全能性(celltotipotency)：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。植物细胞的再生性：指在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株的特性。植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等。生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6-BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。植物组织培养的原理植物细胞全能性（Cellulartotipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。细胞全能性证实？1958年，Steward和Shantz用胡萝卜根韧皮部细胞做悬浮培养，形成的体细胞胚诱导得到完整小植株，证实了全能性。1.分化（differentiation）：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在个体发育中形成各类组织和器官完成整个生活周期。2.脱分化(dedifferentiation)：在细胞组织培养中，一个成熟细胞或分化细胞转变恢复分生能力成为分生状态的过程，即形成愈伤组织的过程。3.再分化(redifferentiation)：植物的成熟细胞经历了脱分化后，即形成愈伤组织能再形成完整的植株，这一过程叫做脱分化。4.植物组织培养一般过程：初代培养→继代培养→生根培养→驯化移栽A初代培养：芽、茎段、叶片、花、器官等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程B继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织、芽）。C生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程。D驯化移栽：组培苗经人工炼苗后移栽到驯化苗床上使之适应露地或保护地条件的过程。第二节植物细胞组织培养发展简史组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。19世纪30年代，德国植物学家施莱登(M.J.Schleiden，1804—1881)和德国动物学家施旺(T.Schwann,1810—1882)创立了细胞学说：①细胞是有机体，一切动植物都是由单细胞发育而来，即生物是由细胞和细胞的产物所组成；

②所有细胞在结构和组成上基本相似；

③新细胞是由已存在的细胞分裂而来；

④生物的疾病是因为其细胞机能失常。根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。这对组织培养技术的诞生起到了极大的推动作用。植物组织培养发展简史可划分为三个阶段：探索阶段、奠基阶段、迅速发展阶段探索阶段（上世纪初至上世纪30年代中）1902年德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特（Haberlandt）在Schleiden和Schwann的细胞学说的推动下，提出了高等植物细胞全能性理论。它是植物组织培养的理论依据，对植物组织培养的发展起了先导作用。植物细胞全能性的理论：即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。1904年，Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功；1912年，Haberlandt的学生科特（Kotte）和美国的罗布林（Robins）在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.45-3.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根。Laibach（1925,1929）亚麻种间杂种胚培养成功，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用；奠基阶段（30年代中至50年代末）1934年美国的怀特（White）由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，高特里特（Gautheret）(1934)在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，诺比考特（Nobecourt）由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们现在所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。他们三人的贡献在于：一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。后来，White于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。40年代斯库克（Skoog）和崔澂在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即细胞分裂素与生长素比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化，形成愈伤组织。（器官分化的植物激素控制理论）50年代开始以后，组织培养研究日趋繁荣，10年当中引人注目的进展主要有7项：1952年，莫雷尔（Morel）和马丁（Martin）通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株；1953-1954年缪尔（Muir）把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1955年米勒（Miller）等人发现了激动素（kinetin）。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展。1958年，美国植物学家斯图尔德（Steward）等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，首次证实了Haberlandt在五十多年前关于细胞全能性的预言；1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素CTK可促成在顶芽存在的情况下打破腋芽的休眠；后来，Murashige利用这一方法发展了快繁技术，广泛的应用于植物的快速繁殖。综上所述，在这一发展阶段中，通过对培养条件和培养基成分的广泛研究，特别是对B族维生素、生长素和细胞分裂素在组织培养中作用的研究，已经实现了对离体细胞生长和分化的控制，从而初步确立了组织培养的技术体系，为以后的发展奠定了基础。迅速发展阶段1960年，科金（Cocking）——开创植物原生质体培养和体细胞杂交研究工作。（用真菌纤维素酶从番茄幼根分离得到活性原生质体）；同年，Kanta——植物试管受精首次成功。1960年，Morel——提出了一个茎尖离体无性繁殖兰花的方法——迅速建立起兰花工业；1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成——MS培养基；1964年印度固哈（Guha）和马海舒瓦瑞（Maheshwari）成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究；以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株。概括起来，这一阶段的成就体现在：（1）微繁技术广泛应用（2）花药培养取得显著成绩（3）原生质体培养取得重大突破（4）基础研究在整个植物组织培养发展的历史中，我国学者做出多方面的贡献，除了前述的崔徵的研究成效以外，还有1993年李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳的提取物加入培养基，获得成功；1993年李继侗等关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，以及罗士韦关于幼胚和茎尖培养，李正理关于离体胚的研究培养、王伏雄等关于幼胚的研究培养工作。第三节植物组织培养的应用植物组织培养成为生物科学的一个广阔领域，除了在基础理论的研究上占有重要地位以外，还在农业生产中也得到越来越广泛的应用。一、农业上的应用1.

快速繁殖种苗(rapidpropagation)用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉观赏植物、蔬菜、果树、大田作物及其他经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。微（快）繁步骤（micropropagation）母株（完整）→外植体（母株的一小部分，种子亦可）→接种到培养基上→长芽（继代增殖）→长根（试管外生根亦可）→练苗，驯化→完整植株快速繁殖可用下列手段进行：（1）通过茎尖、茎段、鳞茎盘等产生大量腋芽；（2）通过根、叶等器官直接诱导产生不定芽；（3）通过愈伤组织培养诱导产生不定芽。试管快速繁殖应用在下列生产或研究中：(1)繁殖杂交育种中得到的少量杂交种，以及保存自交系、不育系等。(2)繁殖脱毒培养得到的少量无病毒苗。(3)繁殖生产上急需的或种源较少的种苗。由于组织培养周期短，增殖率高及能全年生产等特点，加上培养材料和试管苗的小型化，这就可使有限的空间培养出大量的植物，在短期内培养出大量的幼苗。无病毒苗(virusfree)的培养植物在生长过程中几乎都要遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重，甚至会造成极严重的后果。自从Morell952年发现采用微茎尖培养方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。组织培养无病毒苗的方法已在很多作物的常规生产上得到应用。如马铃薯，甘薯，草莓，苹果，香石竹，菊花等。而且已有不少地区建立了无病毒苗的生产中心，这对于无病毒苗的培养、鉴定、繁殖、保存、利用和研究，形成了一个规范的系统程序，从而达到了保持园艺植物的优良种性和经济性状的目的。

在育种上的应用(breeding)植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。（1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显。（2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）（3）保存种质例如：用花药培养单倍体植株；用原生质体进行个体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精，以及种质资源的保存等等。工厂化育苗(industrializingpropagation)近年来，组织培养育苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。（1）工厂化育苗含义：是指以植物组织培养为基础，将外植体接种在人工配制的培养基上，通过控制环境条件，使细胞脱分化、再分化成新的组织、器官，进而培育出与母株一样的批量幼苗的方法。例如：非洲紫罗兰组织培养育苗的工厂化生产。（2）特点：繁殖快，整齐、一致，无病虫害，周期短，周年生产，性状稳定。（3）作用：有利于繁殖系数低、杂合材料的快速繁殖；有利于有性繁殖优良性状易分离材料的繁殖；有利于保持从杂合的遗传群体中筛选出的表现型优异植株的优良遗传性；组织培养育苗的无毒化生产，还可减少病害传播；可以减少气候条件对幼苗繁殖的影响，缓和淡、旺季的供需矛盾。（4）现状：世界上一些先进国家园艺植物组织培养技术的迅速发展从60年代就已经开始，并随着生长、分化规律性探索的逐步深化，到了70年代仅花卉业就已在兰花、百合、非洲菊、大岩桐、菊花、香石竹、矮牵牛等二十几种花卉幼苗生产上建立起大规模试管苗商品化生产。到1984年世界花卉幼苗产业的生产总值已达20亿美元，其中美国花卉幼苗市场总值为6亿多美元，日本三友种苗公司有60％的幼苗靠组织培养技术繁殖。1985年仅兰花一项，在美国注册的公司就有100余家，年销售额在1亿美元以上。我国采用快速繁殖技术，也使优良品种达到迅速的推广和应用。如广东切花菊"黄秀风"的应用，使菊花变大，长势加强，花色鲜艳，抗病力增强，打开了进入香港市场的渠道，使30多种观叶植物的推广很快遍及全国，丰富了人们的生活，并将自然界的几百个野生金钱莲品种繁种驯化，培养了一批园林垂直绿化的材料，促进了园林业的发展。（5）制约：植物组织培养也存在一定的困难。首先是繁殖效率与商品需要量的矛盾，有些作物由于繁殖方法尚未解决，因而无法满足生产的需要。其次是在培养过程中如何减少变异株的发生。更重要的是应降低组培苗工厂化生产的成本，只有降低成本，才能更好的投产应用。总之，随着组织培养这一技术的发展及各种培养方法的广泛应用，使这一技术在遗传育种、品种繁育等方面表现出了巨大的潜力，特别是生物工程和工厂化育苗实施以后，它将以新兴产业的面目在技术革命中发挥重大作用。在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用要揭开生命活动的秘密，需要多科学、多技术的相互配合，其中植物组织培养技术是不可缺少的，它为遗传学、分子生物学、细胞生物学、生物工程等提供了一种有效、快速的方法。因为要揭示生命的奥秘，首先要研究单个基因的作用，研究它在细胞内是如何组装的，如何与其它基因发生联系，如何表达和调控等。分离单个基因，对它DNA进行测序，再对其中的某些碱基实行突变，然后还需要将基因送到受体细胞当中，看表达情况，以确定其功能。接受基因的受体细胞要产生再生植株，就需要通过组织培养的方法才能实现。利用组织培养的材料作为植物生物反应器中国的中草药是一份人类宝贵的财富，但很多种中草药资源匮乏，产量不足，甚至濒于灭绝。如果能利用组织和细胞培养的方法在实验室内生产，不再依附于自然环境，不仅可以解决现有困难，而且可以通过筛选高产有效成分的细胞系，来提高其药用价值。比如用培养的人参悬浮细胞，来生产人参皂苷，已在日本等国家形成规模。利用培养的植物细胞和组织细胞作为生物反应器，也可以生产某些蛋白质、氨基酸、抗生素、疫苗等，如用生食蔬菜生产乙肝疫苗正在实验中。本章小结植物组织培养是指在离体（invitro）条件下利用人工培养基（medium）对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。按照外植体的不同，组织培养可分为植株培养、组织培养、器官培养、细胞培养和原生质体培养5种类型。组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。复习思考题(1)什么是广义的植物组织培养?什么是狭义的植物组织培养?(2)什么是"外植体"?(3)按照外植体的不同，植物组织培养可以分成几类?比较常用的是哪些?(4)你认为植物组织培养技术在当前的农业生产上有什么价值?为什么?第2章愈伤组织培养本章主要内容：愈伤组织的诱导与分化愈伤组织的继代培养愈伤组织的形态发生不定芽和根的发生体细胞胚的发生愈伤组织培养的应用本章教学目的与要求：1、了解愈伤组织细胞分化的各时期的特点2、掌握植物激素控制理论3、掌握愈伤组织的形态发生4、区别胚状体发生途径与器官发生途径形成植株5、愈伤组织培养在园艺植物育种中的应用愈伤组织培养(callusculture)：是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。第一节愈伤组织的诱导和分化一．愈伤组织的诱导诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。二．愈伤组织的分化从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期、分化期。Stage1.Induction（诱导期）：细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成起点。诱导期细胞内发生的变化：气体交换增加，如氧气的吸收增加RNA含量增加（增加到300%）蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）酶活性增强Stage2.Celldivision（分裂期）：指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂期细胞的主要表现：1.细胞的数目迅速增加。2.每个细胞平均鲜重下降。3.细胞体积小，内无液泡。4．细胞的核和核仁增大到最大。5.细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变。6.随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。分裂期愈伤组织的共同特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。Stage3.Differentiation（分化期）：指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化,形成一些不同形态和功能的细胞的时期。分化期细胞特点：A细胞分裂部位和方向发生改变。B形成瘤状或片状的分生组织结节。或维管组织结节。C细胞的体积相对稳定，不再减少。D出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。E生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。根据愈伤质地划分为：生根的愈伤、渗出粘性多糖的愈伤、易碎第二节愈伤组织的继代培养1、继代培养定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养的过程。2、愈伤组织培养的调控因素：外植体、培养环境、培养基（一）材料本身外植体：遗传型、年龄、器官和部位（二）培养基1．无机营养培养基中的N，大多数都用硝态氮，对细胞分化起重要作用。2．植物生长调节物质一般使用的浓度为0.1-10mg／L。使用植物生长调节剂时，要注意种类和浓度，特别是生长素和细胞分裂素的比值。器官分化的植物激素控制理论(激素配比模式)生长素与细胞分裂素的比值是根和芽形成的控制条件，决定着发育的方向：是愈伤组织、长根还是长芽。→高，利于根的形成生长素/细胞分裂素→适中，利于愈伤组织的形成→低，利于芽的形成3．有机成分（1）培养基中加入糖、各类B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可满足愈伤组织生长和分化的要求。（2）各种氨基酸和嘌呤、嘧啶类物质，可促进器官分化。（3）水解酪蛋白中含有多种氨基酸，助于器官分化。（4）酰胺类往往有促进器官形成的作用。4.培养方式：固体培养、液体培养（三）培养条件光照：光强、光照时间、光质温度：24-28℃第三节愈伤组织的形态发生形态建成：外植体细胞在适宜的培养条件下发生脱分化、再分化，产生芽和根，或者形成胚状体，发育成苗或完整植株。愈伤组织的形态发生方式：不定芽方式、胚状体方式愈伤组织类型及特征结构致密型：表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或白色，易于再生芽结构松散型：多为白色，可以用于悬浮系建立胚性愈伤组织：具有产生胚状体能力。一、不定芽方式（adventitiousbud）愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：（1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即无根的芽或无芽的根；（2）先长芽，后长根，多数情况；（3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物；（4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植株。小麦的形态发生：愈伤组织→芽分化→试管苗二、胚状体方式（somaticembryo）胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成具有双极性的胚状结构。注意：体细胞胚1、不同于合子胚2、不同于孤雌/雄胚3、不同于器官发生方式形成的幼苗胚状体与合子胚的比较：合子胚：萌发率高，质量好；来源于受精卵；有明显胚柄；形态固定，体积相对较小；变异率低。胚状体：萌发率低，质量差；来源于体细胞；即使有胚柄也不明显；形态复杂，常有两个以上的子叶，体积较大；变异率高。由外植体经胚状体形成完整植株的过程：→愈伤组织外植体脱分化↓→胚状体→再生植株胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别:①胚状体具有两极性，即有茎端和根端。②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系。③胚状体维管组织的分布是独立的“Y”字形。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点：胚状体产生的数量比不定芽多；胚状体可以制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。第四节愈伤组织培养的应用1、加快了园艺植物新品种和良种繁育速度；2、培育无病毒苗木；3、获得倍性不同的植株；4、克服远缘杂交困难；5、利于种质资源长期保存和远距离运输；6、提供育种中间材料；7、诱发和离体筛选突变体；8、制造人工种子。本章小结：1、愈伤组织培养含义。2、愈伤组织形成分三个时期：诱导期、分裂期、分化期。3、诱导期、分裂期、分化期细胞的特点。4、分裂期愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。5、继代培养的含义。6、培养方式分为固体和液体培养两大类。7、形态建成含义。8、器官发生形成小苗的方式。9、胚状体发生途径与器官发生途径形成植株的区别。第3章器官培养本章主要内容根的培养茎尖的培养叶的培养本章教学目的与要求(1)一般掌握离体根培养的取材部位和培养基的选择；(2)掌握茎尖培养的种类和操作步骤；(3)掌握茎段培养中材料的选择、处理及培养基的调整；(4)掌握离体叶片的培养步骤；(5)一般掌握胚胎培养的类型与各自的注意事项。器官培养：指植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等。培养目的：研究器官的功能、分化、形态建成；快速繁殖；获得脱毒苗；种质保藏等。第一节根的培养根培养的意义:（1)是进行根系生理研究的最优良实验体系;（2)是研究器官分化、形态建成的良好体系；（3）可建立快速生长的根无性系。一、离体根的培养方法：1、培养无菌苗2、切取1.0cm的根尖3、接种在White培养基或1/2MS培养基中暗培养4、一周后，取侧根扩大培养，可得到离体根的无性系（培养条件为暗光和25-27℃）植株再生根段的离体培养也可以用来再生植株。第一步诱导形成愈伤组织。第二步在再分化培养基上诱导芽的分化、在愈伤组织上分化成小植株。二、培养基：无机离子较低的White培养基或者2/3或1/2的MS、B5培养基三、影响离体根生长的因素：基因型培养基生长物质PH环境条件第二节茎尖的培养一、含义及意义1、类型茎尖分生组织培养：对长度0.1mm左右，含1-2个叶原基的茎尖进行培养，目的是获得无病毒植株。普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养，目的是快速繁殖。2、茎尖培养的意义：无性系快速繁殖；培养无病毒苗，品种改良；理论基础研究。二、茎尖培养的一般方法1、茎尖培养步骤取材挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。木本植物可在取材前对茎尖喷几次灭菌药剂。以保证材料不带或少带菌。用于普通茎尖培养，可先从植物的茎、藤或匍匐枝上切取2cra以上的顶梢。消毒接种将采集到的茎尖切成0.5-1.0cm长，并将其大叶除去，休眠芽预先剥除鳞片。将茎尖置于流水冲洗2-4h，再在95％的酒精中处理30s，然后在稀释20倍的次氯酸钠中浸5-8min，最后用无菌水冲洗数次，准备接种。接种为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为0．5cm左右大小。这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。有些植物的茎尖由于多酚氧化酶的氧化作用而变褐。所以在接种时，不能用生锈的解剖刀，动作要敏捷，随切随接，减少伤口在空气中暴露的时间，也可配制1％-5％Vc液，将切下的茎尖材料浸入处理一下。2、一般方法(一)制备外植体

取1-2cm的枝条顶梢，去小叶---消毒---解剖镜下用解剖刀除去幼叶和叶原基，露出生长点，切下0.1-0.2mm长的茎尖(含1-2个叶原基)。(二)培养基多数采用MS，培养基中生长素是必须的，如2,4-D，IAA，NAA等，但浓度不能太高，一般用0．1mg／L左右，高于此浓度，往往产生畸变芽或形成愈伤组织，不同植物对生长素的反应是不同的。(三)培养方法1、固体培养法：试管培养2、纸桥培养法：用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，与液体培养基接触，将离体茎尖置于滤纸上方进行培养。优点：培养基是液体培养基，营养物质能通过滤纸均衡而持久地供给外植体，有利于外植体的健康成长。缺点：操作工艺复杂。三、茎尖分生组织培养与脱毒四、普通茎尖培养与繁殖技术快速繁殖(微繁殖)：用组织培养的方法，使植物的部分器官、组织迅速扩大培养，并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。特点：繁殖速度快；使用材料少，生产效率高，省时省工；节约空间有利于植物的工厂化生产；在无菌条件下进行，不受病虫害侵害。（一）茎尖微繁技术的过程：分5个阶段1、无菌培养体系的建立外植体的制备、培养基、培养条件初代培养建立的无性繁殖系包括：茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。芽的增殖顶芽和腋芽的发育顶芽、侧芽生长，形成一个微型的小灌木丛状的丛生苗结构。丛生苗的每个枝条转接继代，可迅速获得多数的嫩茎。这种繁殖方式称作微型扦插或无菌短枝扦插。优点：不经愈伤组织，所以最能使无性系后代保持原品种的特性。（2）不定芽的发育不定芽产生的途径：外植体上直接产生、由外植体诱导的愈伤组织上产生。中间繁殖体的增殖中间繁殖体：由第二阶段芽的增殖产生的数量有限的芽、苗、原球茎。将之转接到新鲜的相同培养基上进行继代培养，3-4周转接一次，扩大培养。茎的培养发育方向：腋芽萌发脱分化后产生胚状体（原球茎）脱分化后直接产生不定器官脱分化后形成愈伤组织诱导生根壮苗目的：使增殖的嫩枝生根产生小植株，以便移栽。试管苗生根的措施：用White、1/2或1/3MS、B5等生根培养基；降低N，P，K盐的量；适当加大生长素（如NAA），不用或少用细胞分裂素，或在无激素的培养基上生根；蔗糖降低到1.0-1.5%，以增强植株自养能力；加入1%左右的活性炭；增加光强度，以提高小植株的光合能力。5、试管苗的移植生根培养1个月左右。移植时可根据生根情况来进行。若发现新梢基部生有较浓密的不定根，长度在lcm以内，就可移栽人土。移栽时通过几天的炼苗过程，栽入塑料营养钵或育苗盘中，营养钵盛经烧烤或常压灭菌的培养土(1分腐殖土：1分沙)。栽后给予较高的空气湿度条件。培养土要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减少水分的蒸腾，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。当发现小苗有生长趋势，可逐渐减少湿度，将拱棚两端打开通风，并且减少喷水次数。使小苗适应湿度较小的条件。以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，少浇水或不浇水，促进小苗长得粗壮。温度管理上要掌握适宜的生根温度，最适宜的温度是16-20℃。光照管理上初期可用较弱的光照，在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用，后期可直接利用自然光照。可用育苗盘进行驯化生根、孔径选择2cm左右即可。孔穴装入蛭石：珍珠岩：草炭土为1：1：0．5的基质。当小苗长至5cm高左右再移人塑料营养钵中。(二)影响茎尖培养微繁殖的因素基因型；外植体的大小；供试植株的生理状态；芽在植株上的部位；供试植株的年龄；培养基；褐变；玻璃化（三）茎段的培养茎段培养：指不带芽和带1个以上定芽或不定芽的，包括块茎、球茎在内的幼茎切段的无菌培养。培养茎段的主要目的是快繁。优点：培养技术简单易行，繁殖速度较快；芽生芽方式增殖的苗木质量好，且无病，性状均一；解决不能用种子繁殖的无性繁殖植物的快速繁殖问题等。茎段培养过程：健康植株上选健壮的枝梢→去叶片用水冲洗茎段→75%酒精1分钟→0.1%升汞→1%次氯酸钠→培养→植株再生(1)材料的选择和处理取生长健壮无病虫的幼嫩枝条或鳞茎盘，若是木本，取当年生嫩枝或一年生枝条，剪去叶片，剪成3-4cm的小段。取材时注意茎的基部比顶部切段，侧芽比顶芽的成活率低，所以应优先利用顶部的外植体，但由于每个新梢仅一个顶芽，也可利用腋芽，茎上部的腋芽培养效果较好。还应注意尽量在生长期取芽，在休眠期取外植体，成活率降低。如苹果在3-6月取材的成活率为60％，7-11月下降到10％，12-2月都下降10％以下。(2)培养最常用的基本培养基为MS培养基，加入3％蔗糖，用0．7％的琼脂固化。培养条件保持25℃左右。经培养后茎段的切口特别是基部切口上会长出愈伤组织，呈现稍许增大，而芽开始生长，有时会出现丛生芽，从而得到无菌苗。在茎段培养中，促进腋芽增殖用6-BA是最为有效的，依次为Kt和Zt等。生长素虽不能促进腋芽增殖，但可改善苗的生长。GA对芽伸长有促进作用。继代两种途径：一是促进腋芽的快速生长，二是诱导形成大量不定芽。第一种途径的好处是不会产生变异，能保持品种优良特性。且方法简便，可在各种植物上使用，每年从一个芽可增殖10万株以上。第二种途径会产生变异。继代增殖过程注意选用培养基和生长调节剂。（4）生根降低或除去细胞分裂素而加人生长素。由于在苗增殖时施用了较高浓度的细胞分裂素，并促使苗中保持着一定的量，因此，在生根培养中不需要加细胞分裂素。生长素的浓度，NAA一般0．1-1．0mg／L，IBA和IAA可稍高。MS，B5White等培养基，都可用于诱导生根，但是其含盐浓度要适当加以稀释。前面的几种培养基中，除White外，都富含N，P，K盐，它们都抑制根的发生。因此，应将它们降低到1／2，1／3或1／4，甚至更低的水平。生根培养时增强光照有利于发根，且对成功地移栽到盆钵中有良好作用。故在生根培养时应增加光照时间和光照强度，但强光直接照射根部，含抑制根的生长，所以在生根培养时最好在培养基中加0．3％活性炭，以促进生根。(5)移植在驯化时要进行炼苗。然后洗净琼脂，小心移栽，初期湿度要大，基质通气湿润，保湿保温，更要精心管理等。第三节叶的培养一、定义叶培养：离体叶的培养是指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。叶培养的意义：1、是研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成的好方法；2、通过叶组织的脱分化与再分化以证实叶细胞的全能性；3、通过叶组织培养，探索离体叶组织培养的条件和影响因素；4、建立体细胞快速无性繁殖体系；5、叶细胞培养物经诱变筛选突变体。二、叶组织培养的方法1、制备外植体：幼嫩叶片---水洗---消毒---无菌水洗。2、影响培养因素：（1）6-BA和KT利于芽的形成；2,4-D利于愈伤组织形成。（2）极性：叶片腹面向上放置利于芽的分化。（3）损伤：常从叶柄、叶脉的切口处形成愈伤组织和芽。三、离体叶组织中再生植株发生途径1、直接产生不定芽2、离体叶→愈伤组织→不定芽3、离体叶→愈伤组织→胚状体→不定芽→愈伤组织→4、离体叶→小鳞茎或球状体本章小结：(1)植物器官培养的含义。(2)离体根培养的方法、培养基、影响离体根生长的因素。(3)茎尖培养的含义；茎尖培养包括普通茎尖培养和茎尖分生组织培养。(4)纸桥培养的含义。(5)茎尖微繁一般的过程。(6)离体叶组织脱分化和再分化中，茎和芽分化主的4个途径。(7)试管苗诱导生根方法。第4章胚胎培养胚胎培养：是指将植物的胚胎与母体分离，培养在人工的培养基上形成幼苗的过程，包括幼胚培养、成熟胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。本章内容胚培养胚乳培养胚珠和子房培养1904年的Haning最早成功地培养了萝卜和辣椒的胚，并萌发形成小苗；30年代成功地把兰科植物的胚培养成小植株；40年代在苹果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、马铃薯、甘蓝与大白菜的种间杂种的胚胎培养、胚乳培养及子房与胚珠培养均取得了不同程度的进展。本章教学目的与要求(1)掌握胚培养和胚乳培养的操作步骤；(2)了解胚珠培养和子房培养的操作步骤。胚胎培养的意义：①克服远缘杂种的不育性，②使胚胎发育不完全的植株获得后代(兰天麻)；③缩短育种年限，提高育种效率。第一节胚培养胚培养：采用人工的方法将胚从种子、子房或胚珠中分离出来，再放在无菌的条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。一、培养类型1、幼胚培养幼胚：是指子叶期以前的幼小胚。远缘杂交育种现在可使心形期胚或更早期的长度仅0.1～0.2mm的胚生长发育成植株。由于胚越小就越难培养，所以，尽可能采用较大的胚进行胚养。现在幼胚培养成功的有大麦、荠莱、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。2、成熟胚培养成熟胚：一般指子叶期后至发育完全的胚,培养较易成功。将成熟或未成熟种子用70％酒精进行几秒钟的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。二、培养过程：1、幼胚培养过程：取子房→常规表面消毒→解剖镜下，取胚珠、去珠被、取出完整幼胚→固体培养幼胚的发育方式：胚性发育；早熟发育；产生愈伤组织。2、成熟胚培养过程---以玉米成熟胚培养为例（1）玉米种子消毒；（2）在黑暗条件下，将种子放在无菌湿润的含滤纸的培养皿中培育6hr；（3）将吸涨的种子在无菌培养皿内将胚分离出来；（4）无菌水冲洗3次；（5）在MS培养基中暗培养；（6）观察：2d出现胚根，3-4d出现胚芽，10d长成幼苗。三、培养基与培养条件1、培养基常用的培养基有Tukey，MS，B5，Nitsch培养基，其中前者适于成熟胚培养，其他适于未成熟胚和幼胚培养。培养条件：糖类：幼胚需求较多附加成分：椰乳光照：光照可以促进某些植物胚的转绿，利于胚芽生长，而黑暗则利于胚根生长。因此以光暗交替培养较为有利。培养方式：幼胚培养适于液体培养，成熟胚适于固体培养。四、胚培养的应用1)在远缘杂交育种中：克服杂种胚不能正常发育2)克服珠心胚的干扰，提高育种效率3)缩短育种周期4)测定休眠种子的萌发率5)理论研究中的应用第二节胚乳培养胚乳培养：是指将胚乳从母体上分离出来，在无菌的环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。一、胚乳培养过程胚乳外植体制备：种子消毒→取出胚乳培养：White或MS诱导培养基→25~27℃→暗或弱光发育：诱导形成愈伤组织→再分化形成胚状体或不定芽→生根培养→植株胚乳培养过程：胚乳→愈伤组织→形态发生→胚状体发育成苗或不定芽苗胚乳植株染色体数目的检查取根尖、幼叶或愈伤组织→0.2%-0.5%秋水仙素碱溶液在25℃浸泡4-8hr→流水冲洗5-10min→卡诺氏液或FAA液固定→1mol/L盐酸，60℃水浴8-10min→染色、压片、镜检、计数二、培养基与培养条件可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5～2.0mg/L，BA0.1～1.0mg／L。在25～27℃和黑暗条件或散射光下培养，约6～l0d胚乳开始膨大，再培养形成愈伤组织．这时应转到分化培养基上培养，分化培养基可加入0.5～3.0mg／L的BA及少量的NAA。待愈伤组织长出芽后，切下不定芽，插人生根培养基中，光下培养10～15d，切口处可长出白色的不定根。三、胚乳再生植株的染色体倍数稳定型：三倍体畸变型：除少数是三倍体，多数是由多种倍性细胞组成的嵌合体四、胚乳培养的应用1、胚乳培养可得到三倍体植株，产生无籽果实。或加倍形成六倍体植株进行育种。2、胚乳培养可得到倍性不同的愈伤组织，可分离和筛选各种类型的非整倍体植株。第三节胚珠和子房培养一、胚珠培养胚珠培养：是指将胚珠从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。胚珠培养类型：1、受精胚珠的培养2、未受精胚珠的培养（一）、胚珠培养的基本过程：（二）、培养基：White,Nitsch,MS（三）、胚珠的发育：A受精胚珠：一是形成种子；二是形成愈伤组织。B未受精胚珠：形成单倍体植株。二、子房培养子房培养：子房培养是指将子房从母体上分离出来，在无菌的人工环境条件下培养，使其生长发育形成幼苗的过程。类型：授粉子房的培养；未授粉子房的培养。（一）子房培养的培养过程1、制备外植体：在开花前后适宜时期取子房或幼花，消毒2、子房培养：固体或液体培养均可（二）培养基：N6,MS（三）培养子房的发育：性细胞（卵细胞、助细胞、极核、反足细胞）→胚状体或愈伤组织→单倍体植株；体细胞（珠被、子房壁）→胚状体或愈伤组织→二倍体植株。三、胚珠和子房培养的应用（一）胚珠培养的应用1、受精胚珠培养目的：打破种子的休眠；挽救胚的发育，以获得杂交种。2、未受精胚珠培养目的：获得单倍体植株。（二）子房培养的应用1、授粉子房培养目的：挽救杂种胚。2、未授粉子房培养目的：获得单倍体植株。本章小结：(1)胚胎培养包括：幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。(2)胚胎培养的意义。(3)离体胚培养方法：成熟胚和幼胚培养。(4)未成熟胚培养，三种不同的生长方式，胚性发育；早熟萌发；形成愈伤组织。(5)胚培养的作用。(6)检查胚珠植株的染色体数目的方法。(7)分析胚珠培养和子房培养的发育途径。第5章花药和花粉培养本章主要内容：花粉和花药培养技术花粉和花药培养应用本章教学目的与要求(1)掌握花药培养和花粉培养的区别；(2)了解花药最佳接种时期；(3)掌握花药培养的大致过程；(4)掌握花粉发育的四种途径；(5)掌握花粉培养的大致过程。花粉和花药的培养(pollenandantherculture)：是指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术。单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。第一节花药和花粉培养技术花药培养：是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行培养，以形成花粉胚或愈伤组织进而分化成植株的技术。花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。一、花药和花粉的培养方法（一）花粉发育时期1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期)花粉粒形态：花粉粒即雄配子体。2、花粉发育时期的检测：外部形态观察：在水稻中，一般叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2时，可能为单核靠边期的花粉。压片染色法：是检测花粉发育时期的简便有效方法，常用染色剂为醋酸洋红。（二）培养过程1、花药培养过程1）预处理：低温冷藏是最常用的方法在冰箱4-5℃下保持3-4d2）表面消毒3）接种4）培养形成花粉植株花粉→愈伤组织→苗花粉→胚状体→苗水稻花药培养过程：旗叶鞘用70％酒精擦洗一遍→剥去旗叶鞘，取出稻穗→10％漂白粉10min→无菌水洗3次→左手持穗，右手用镊子取花药，放无菌培养皿中→用接种环接种到培养基上→培养5天，花药变褐，20天后花药裂开，长出淡黄色的花粉愈伤组织，先长芽，后长根，形成幼苗花药培养脱毒1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基：MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖分化培养基：MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基：1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L2、花粉培养花粉培养成苗途径与花药培养比较相同点：胚状体成苗途径、愈伤组织再分化成苗途径。不同点：花粉培养需进行花粉的分离，特殊的花粉诱导培养。花粉培养过程：取花蕾（镜检）→消毒→取花药→预培养数天→分离花粉→接种→培养→愈伤组织发生二、培养基（一）基本培养基：MS和H培养基：适合双子叶植物花药培养；B5培养基：适合豆科和十字花科花药培养；N6培养基：适合禾谷类作物的花药培养。（二）激素种类和浓度细胞分裂素可促进胚状体形成；生长素可诱导愈伤组织形成；细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗。（三）蔗糖浓度较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织；较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗。三、单倍体植株染色体加倍的方法单倍体植物天然发生的途径：孤雌生殖；无配子生殖；孤雄生殖单倍体植株染色体加倍的方法1、自然加倍2、人工加倍：用秋水仙素溶液浸苗、处理愈伤组织和用含0.4%秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽、腋芽，可得到能结实的二倍体植株3、愈伤组织反复继代培养，可得到二倍体植株第二节花药和花粉培养的应用（单倍体植株育种）1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率;3、有利于隐性基因控制性状的选择；4、快速获得自交系的超雄株。本章小结：(1)花药培养是器官培养，花粉培养属细胞培养。(2)花药培养一般选择花粉的单核期进行接种。(3)花药培养包括：选择材料-消毒-接种培养-愈合组织生成-分化出单倍体植株。(4)花粉的发育途径包括：营养细胞发育、生殖细胞发育、营养和生殖细胞同时发育及花粉均等分裂发育。(5)花粉培养包括花粉的分离-预处理-培养过程。(6)胚胎培养包括：幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养和胚乳培养等。(7)胚胎的培养的意义。第二章细胞组织培养的基本技术本章教学目的与要求(1)掌握组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；(6)掌握无菌接种的步骤；(7)掌握外植体的培养方法和步骤；(8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；(9)掌握试管苗驯化的基本程序；本章主要内容商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备培养基及其配制外植体的选择与培养试管苗的驯化与移载第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备培养皿的清洗；培养基的配制、分装和高压灭菌；无菌操作——材料的表面灭菌和接种；将培养物放到培养室培养；试管苗的驯化、移栽和初期管理。一、设计组成：准备室、缓冲室、驯化室、温室、无菌操作室、培养室(一)、洗涤室(cleaningroom)洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内配备：大型水槽，最好是白瓷水槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺垫橡胶。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。(二)、准备室(repairingroom)完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。准备室要求明亮、通风。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。(三)、缓冲室进入无菌室前要在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。应当在此室内安装灭菌用的紫外灯。控制无菌室及培养室的配电板等。(四)、无菌操作室(transferingroom)接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。配置：在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般7-8m2，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装1-2盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可控，这样可使门窗紧闭，减少与外界空气对流。(五)、培养室(culturingroom)培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。设计原则：充分利用空间和节省能源；高度比培养架略高为宜；周围墙壁要求有绝热防火的性能。培养架大多由金属制成。规格：一般设5层，最低一层离地高约10cm，其他每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30W的长1m，宽度一般为60cm。培养室最重要的因子是温度，一般保持在20-27℃左右，具备产热装置，并安装窗式或立式空调机。由于热带植物和寒带植物等不同种类要求不同温度，最好不同种类有不同的培养室。室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70％-80％为好，可安装加湿器。控制日光照时间可安装定时开关钟，一般需要每天光照10-16h也有的需要连续照明。现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为主要能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗接受太阳光生长良好，驯化易成活。(六)、驯化室驯化室要求清洁无菌，配有空调机、加湿器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通风口以及必要的杀菌剂。、温室应配有空调机、通风口、加湿器、恒温恒湿控制装置、喷雾装置、光照调节装置以及必要的杀菌杀虫装置及相应药剂。二、仪器设备和器皿用具（一）常见仪器设备超净台优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。无菌箱在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。工作原理：超净台功率在145-260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于0．3um的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分钟24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。根据风幕形成的方式，超净台可分为水平式和垂直式二种型号。3、空调机4、除湿机5、恒温箱6、烘箱7、高压灭菌锅8、冰箱9、电子分析天平和托盘天平10、显微镜及解剖镜11、水浴锅12、摇床与转床13、磁力搅拌器14、电蒸馏水器15、酸度计16、离心机（二）各类玻璃器皿1、培养器皿培养器皿：在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿。其中以试管、三角瓶、培养皿等使用较多。最常使用的是：三角瓶培养皿（9、12cm直径）用于：游离细胞、原生质体、花粉等的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。试管（18mmXl80mm或20mmX200mm）用于：培养较高的试管苗。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺点是易引起污染。2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器用于除去不能采用湿热灭菌法的液体中的细菌。一般采用0.22um微孔滤膜进行抽滤灭菌。包括滤头，注射器或采用抽滤装置：真空泵、吸滤瓶、滤气玻璃管等。6、实验器皿在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括：100ml、250ml、500ml、1000ml烧杯；l0ml、l00ml、1000ml量筒；l00ml、1000ml试剂瓶(棕色)等等。瓶口封塞瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前封口常用棉塞。但这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基的湿度。现在多采用聚丙烯塑料薄膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样经济方便，且通气好。也可采用专用的封口膜。、器械用具（P13）1．镊子类：尖头和枪形2．剪刀类3．解剖刀4．解剖针5、接种工具：接种针、接种钩及接种铲（由白金丝或镍丝制成）6、钻孔器7、其它：酒精灯，电炉，试管架，搪瓷盘等第二节培养基及其配置目的要求：(1)一般掌握培养基的种类、特点；(2)掌握基本培养基的配方；(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法和步骤；(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)一般掌握培养基的筛选办法。一、培养基及其配制培养基的种类按成分分类:MS,B5,White,NT,KM-8P,N6等。按状态：液体，固体。固体培养基的特点（与液体培养基相比）优点：操作简便，通气问题易解决，便于观察研究缺点：培养物与培养基的接触（即吸收）面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。2、培养基配制（1）MS培养基（MurashigeandSkoogMedium）植物组织培养中常用的一种培养基。离子浓度较高，硝酸盐含量较其他培养基高。器官，花药，细胞，原生质体培养。（2）B5培养基（B5Medium）铵含量较低木本植物，十字花科植物（3）White培养基（WhiteMedium）无机盐含量低生根培养（4）NT培养基（NTMedium）1970烟草叶肉原生质体培养（5）KM-8培养基（KM-8Medium）1974有机成分复杂，包括所有单糖和维生素，呼吸代谢主要有机酸原生质体和融合体培养（6）N6培养基（N6Medium）1974，朱至清等。成分简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高小麦，水稻及其他植物花药培养和组织培养3、培养基的成分（1）水培养基的主要组分，水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。无机营养组分作用：满足植物对各矿质元素的需求。大量元素，6种微量元素，7种非必须元素，6种铁采用螯合铁，FeSO4加EDTA有机营养成分碳源：蔗糖维生素类：硫胺素（B1），烟酸（B3），吡哆醇（B6），泛酸钙（B5），肌醇。氨基酸：蛋白质组成成分，促进细胞生长。其他有机附加物椰子汁，酵母提取物，马铃薯，水解酪蛋白等。可以促进组织生长。椰子汁：椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%-20%。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。马铃薯：去掉皮和芽后，加水煮30分钟，再经过过滤，取其滤液使用。对PH值缓冲作用大。添加后可得到健壮的植株。酵母提取物，香蕉，水解酪蛋白等。植物生长调节物质植物激素“五兄弟”：生长素﹑赤霉素﹑细胞分裂素﹑脱落酸﹑乙烯生长素（auxin）的发现向光性：在单侧光的照射下，植物朝向光源方向生长的现象。1、19世纪末达尔文(C.R.Darwin)实验实验材料：胚芽鞘总结上述三个实验，达尔文提出：胚芽鞘尖端受单侧光刺激后,就向下面的伸长区传递影响，造成伸长区背光面比向光面生长快,因而使胚芽鞘出现向光弯曲。2.1910年詹森（B.Jensen）的实验结论：胚芽鞘的尖端产生的某种刺激可以透过琼脂片传递给下面一段。3.1914年拜尔（Paal）的实验去尖端，把尖端放于胚芽鞘切面的左侧，胚芽鞘向右侧弯曲生长。去尖端，把尖端放于胚芽鞘切面的右侧，胚芽鞘向左侧弯曲生长。结论：胚芽鞘的弯曲生长，是因为尖端产生的影响在其下部分布不均匀造成的。4、1928年（F.W.Went）温特的实验结论：胚芽鞘的弯曲生长确实是一种化学物质引起的，并命名为生长素。1934年从人尿分离出具有生长素效应的物质——吲哚乙酸。1942年从高等植物中分离出生长素，并确认是IAA。在植物体内，具有促进植物生长的功能，除了吲哚乙酸（IAA）外，还有苯乙酸（PAA）和吲哚丁酸（IBA）。生长素生理作用的应用顶端优势：植物的顶芽优先生长，而侧芽生长受抑制的现象。形成原因：顶芽产生的生长素向下运输，大量地积累在侧芽部位，侧芽对生长素浓度又比较敏感，使侧芽的生长受到抑制。植物向光性：在单侧光线照射下，背光侧>向光侧，背光侧细胞生长快，结果使茎朝向光源一侧弯曲。根的向重力性（向地性）茎的背重力性（背地性）生长素类似物的应用促进扦插的枝条生根用一定浓度的生长素类似物溶液浸泡插枝的下端后栽插。促进果实发育（培育无籽果实）传粉受精后，胚珠发育成种子的过程中产生大量生长素，促进子房发育成果实。如何培育无籽果实？在没有接受花粉的雌蕊柱头上涂上一定浓度的生长素类似物，使子房正常发育为果实，因为没有受精，果实内没有种子。防止落花落果，疏花疏果农业生产上常用一定浓度的生长素类似物溶液喷洒棉株，可以达到保蕾保铃的效果。（4）用作除草剂如(2，4-D)，适用于麦田、稻田，双子叶植物比单子叶植物对生长素更敏感，用高浓度的除草剂能抑制双子叶植物（杂草）的生长。生长素（auxin）吲哚乙酸（IAA，天然），奈乙酸（NAA），二氯苯氧乙酸（2,4-D），吲哚丁酸（IBA），2,4,5-三氯苯氧乙酸（2,4,5-T）。促进细胞分裂与根分化，2,4-D有强烈的愈伤组织诱导能力，但抑制器官分化。细胞分裂素（cytokinin）激动素（KT），6-苄基腺嘌呤（6-BA），玉米素（ZT），异戊烯氨基嘌呤（2IP）刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。细胞分裂素常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。主要作用；促进细胞分裂。细胞分裂素与生长素相互作用生长素与细胞分裂素的比例被称为“激素杠杆”，决定着发育的方向。当生长素含量高于细胞分裂素时，主要诱导植物组织脱分化和根原基的形成。当细胞分裂素的效应高于生长素时，主要诱导植物组织再分化和芽原基的形成。赤霉素（gibberelinacid）GA3，促进细胞生长，刺激不定胚发育成正常小植株。1926年，水稻感染了赤霉菌→植物疯长→恶苗病。将赤霉菌培养基的滤液喷洒稻健康水稻幼苗上，不感染赤霉菌，却有恶苗病的症状。1935年科学家从培养基滤液中分离出赤霉素（GA）。GA3诱导甘蓝茎的伸长，产生超长茎。主要作用：促进细胞伸长；促进种子萌发；果实发育。合成部位：幼叶、幼芽、幼根、未成熟的种子乙烯（ethylene）对芽的诱导具有一定作用，促进果实着色和成熟。在生理环境的温度和压力下，是一种气体，比空气轻，实验中很难掌握用量，所以一般不使用。培养的植物组织也会产生乙烯，如果封口用的是不透气的塑料膜，容器内就会逐渐积累乙烯，严重时可引起培养物的死亡。AgNO3可逆转乙烯的抑制作用。乙烯在常温下是气体。作为生长调节剂用的是乙烯利。（5）附加组分活性炭吸附有害物质；遮光作用：防止褐化和玻璃苗产生；促进根的生长副作用：琼脂不易凝固；降低培养基PH；吸附植物激素替代物：墨汁渗压剂保持培养基中的渗透压常用渗压剂蔗糖，聚乙二醇（PEG），山梨醇，甘露醇硝酸银Ag＋与乙烯受体结合，抑制乙烯的作用促进愈伤组织的生长、器官与胚胎分化，减轻培养物玻璃化和衰老副作用：使再生植株畸形抗生素杀灭细菌和真菌，防止污染常用的有：青霉素、链霉素、四环素、氯霉素、利福平、卡拉霉素一般不耐高温，使用时单独过滤灭菌副作用：对培养物生长有抑制作用；抗生素污染凝固剂制备固体培养基，使培养物能够处于表面，既能吸收必需的养分、水分，又可不致因缺氧而死亡。材料必须无毒害作用，且不被培养的植物组织所吸收，不与培养液成分发生化学反应。常用凝固剂：琼脂，淀粉，滤纸等琼脂：来源于石花菜等海藻。高温下融化，温度降低凝固。不会被植物和菌类吸收利用。常用浓度：0.7-1％质量差的琼脂要求的凝固浓度更高。4、培养基配制（1）母液的配制P33参考修改母液的定义优点：减少操作步骤；增加称量的准确性。MS培养基大量元素母液（10X）NH4NO3

16.5gKH2PO4

1.7gKNO3

19gCaCl2·2H2O

4.4gMgSO4·7H2O

3.7g

溶于1000mL水，放置4℃冰箱保存。常用10X或20X。配制大量元素母液时残留不溶物各种化合物必须充分溶解后才能混合，混合时注意先后顺序,要注意把钙离子和硫酸根离子和磷酸氢根离子错开。微量元素母液（1000X）KI

0.83gNa2MoO4·2H2O

0.25gH3BO3

6.2gCuSO4·5H2O

0.025gMnSO4·H2O

16.9g

CoCl2·6H2O

0.025gZnSO4·7H2O

8.6g配成1000mL母液，存放于冰箱中。铁盐母液200XNa·EDTA

7.46g

FeSO4·7H2O

5.56g配成1000mL母液，存放于冰箱中。刚配制的铁盐溶液放人冰箱后出现结晶，原因是铁离子和EDTA没有螯合彻底，室温放置过夜后再移入冰箱中保存。有机元素母液（1000X）盐酸硫胺素（VB1）

0.1g烟酸

0.5g

甘氨酸

2g盐酸吡哆醇（VB6）

0.5g

配成1000mL母液，存放于冰箱中。肌醇母液10X肌醇

1g

配成1000mL母液，存放于冰箱中。常用10X或100X。植物激素母液各激素单独配置，通常浓度为1mg·mL-1生长素类：少量NaOH溶解后，加水定容。细胞分裂素类：少量盐酸或NaOH溶解后，加水定容。GA3：乙醇溶解。或少量乙醇溶解后加水定容。（2）培养基配制先在烧杯中放入一些蒸馏水；分别取各种母液；称取蔗糖倒入，搅拌溶解；按设计好的方案添加各种激素；用精密试纸或酸度计调整PH；加蒸馏水用量筒定溶至1L；称取5-10g左右琼脂粉,倒入上面配好的溶液中，加热至沸腾，直到琼脂粉熔化稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧；灭菌；灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。PH值常用PH5.8检测：试制或PH计高压蒸汽灭菌会造成PH值下降0.2-0.5PH值过低，琼脂培养基难以凝固；PH值过高，无极盐沉淀。（3）培养基灭菌组织培养常见的灭菌方法消毒：是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。灭菌：是指用物理或化学的方法，杀死物体的表面和空隙内的一切微生物或生物体，即把所有有生命的物质全部杀死。常用的灭菌方法物理方法：干热灭菌（烘烤或灼烧）湿热灭菌（常压或高压蒸煮）射线处理（紫外线、超声波、微波）过滤除菌大量无菌水冲洗化学方法：甲醛（福尔马林）过氧化氢高锰酸钾来苏儿漂白粉次氯酸钠升汞（氯化汞）酒精培养基的灭菌（湿热灭菌法）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在108KPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽胞。灭菌方法：打开锅盖，加水至水位线。把已装好培养基的三角瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出。然后盖上锅盖，对角旋紧螺丝。接通电源加热，当升至0．05MPa时，打开放气阀放气，回“0‘，后关闭放气阀。当气压上升到0.10MPa时，保压灭菌20min，到时停止加热。当气压回“0”后打开锅盖，取出培养基，放于平台上冷凝。灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过1周。过滤灭菌赤霉素、玉米素、脱落酸等是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米(常用0.22微米)以下，当溶液通过滤液后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻。抽滤装置：包括滤器，接收瓶，泵，导管。针头滤器：灭菌包装，配合一次性注射器一次性使用。空间及物体表面灭菌紫外线灭菌熏蒸灭菌（熏蒸剂：甲醛及高锰酸钾）污染真菌污染污染来源：培养基灭菌不彻底；细菌污染污染来源：操作不严格；外植体灭菌不彻底。固体培养基灭菌后，不能凝固，可能的原因是什么？PH值偏酸；活性炭添加较多；琼脂条或琼脂粉浓度不够；琼脂质量差；反复灭菌。培养基灭菌后，出现沉淀，是什么原因？PH值偏碱。外植体的接种与培养胚状体（embryoid）：离体培养条件