杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件

Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白蛋白组吴召慧211-5-10Bac-to-Bac杆状病毒1主要内容1.杆状病毒表达载体系统简介2.基本原理÷3.主要操作流程主要内容21:杆状病毒表达载体系统简介杆状病毒表达系统(Baculovirusexpressionvectorsystem,BEⅤS)是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体,在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统令杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展,现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之1:杆状病毒表达载体系统简介3杆状病毒表达載体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus,ACMNPV)表达系统和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)表达系统令杆状病毒科分为包含体病毒亚科(Eubaculovirinae)非包含体病毒亚科(Nudibaculovirinae),包含体病亚科分为核型多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)杆状病毒表达載体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角4松包毒粒子的构造废义,陈起津杆状病毒科:丫纹夜蛾核型多角体病毒点近店长中时多角体)中(叶昌筝松包毒粒子的构造5杆状病毒表达系统的优缺点优点令对外源基因容量大适合表达细胞毒性蛋白令安全性且表达产量高后加工过程完全令可以同时表达多个外源基因体内表达缺点肽花请单杆状病毒表达系统的优缺点62:基本原理1:目的基因插入转移载体令2:目的基因转移到病毒基因组靶位点,空斑纯化获得重组病毒。令3:重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫4:纯化目的蛋白2:基本原理7杆状病毒表达载体的构建令转移載体通常由三部分组成Ecoli质粒的复制原点和抗生素抗性基因(如Amp),保证转移载体能在大肠杆菌中扩增含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子,在该启动子下插入要表达的外源基因令启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列,用于与野生病毒DNA同源重组杆状病毒表达载体的构建8直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难,为纯化常采用下列方法:(1)在外源基因的前端插入6×His,表达的融合蛋白可通过Ni柱进行亲和层析纯化(2)将谷胱甘肽转移酶基因(GST)导入外源基因前端,利用GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达,该蛋白与生物素具有非常高的结合能力,可以对表达产物进行纯化直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困9Bac-t0-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达donorplasmid→(指+(a0AY55-7byPlaqueAs8圓图已5。。PartialBac-t0-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达10杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件11杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件12杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件13杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件14杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件15杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件16杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件17杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件18杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件19杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件20Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白蛋白组吴召慧211-5-10Bac-to-Bac杆状病毒21主要内容1.杆状病毒表达载体系统简介2.基本原理÷3.主要操作流程主要内容221:杆状病毒表达载体系统简介杆状病毒表达系统(Baculovirusexpressionvectorsystem,BEⅤS)是利用携带有外源目的基因的重组杆状病毒作载体,在昆虫体内或其培养细胞内进行表达的一个重组蛋白生产系统令杆状病毒表达载体系统的建立和发展,被誉为20世纪80年代真核表达研究领域的一个重大进展,现已成为基因工程四大表达系统(即杆状病毒、大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞表达系统)之1:杆状病毒表达载体系统简介23杆状病毒表达載体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamultiplenuclearpolyhedrosisvirus,ACMNPV)表达系统和家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)表达系统令杆状病毒科分为包含体病毒亚科(Eubaculovirinae)非包含体病毒亚科(Nudibaculovirinae),包含体病亚科分为核型多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)杆状病毒表达載体系统主要包括苜蓿银纹夜蛾核型多角24松包毒粒子的构造废义,陈起津杆状病毒科:丫纹夜蛾核型多角体病毒点近店长中时多角体)中(叶昌筝松包毒粒子的构造25杆状病毒表达系统的优缺点优点令对外源基因容量大适合表达细胞毒性蛋白令安全性且表达产量高后加工过程完全令可以同时表达多个外源基因体内表达缺点肽花请单杆状病毒表达系统的优缺点262:基本原理1:目的基因插入转移载体令2:目的基因转移到病毒基因组靶位点,空斑纯化获得重组病毒。令3:重组病毒感染宿主培养细胞或幼虫4:纯化目的蛋白2:基本原理27杆状病毒表达载体的构建令转移載体通常由三部分组成Ecoli质粒的复制原点和抗生素抗性基因(如Amp),保证转移载体能在大肠杆菌中扩增含有一个杆状病毒高效表达基因的启动子,在该启动子下插入要表达的外源基因令启动子上游和外源基因下游则分别含有一段杆状病毒DNA序列,用于与野生病毒DNA同源重组杆状病毒表达载体的构建28直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困难,为纯化常采用下列方法:(1)在外源基因的前端插入6×His,表达的融合蛋白可通过Ni柱进行亲和层析纯化(2)将谷胱甘肽转移酶基因(GST)导入外源基因前端,利用GST能和谷胱甘肽琼脂糖特异结合纯化蛋白(3)利用抗生物素蛋白与目的蛋白融合表达,该蛋白与生物素具有非常高的结合能力,可以对表达产物进行纯化直接从昆虫培养细胞和血淋巴中纯化目的蛋白比较困29Bac-t0-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达donorplasmid→(指+(a0AY55-7byPlaqueAs8圓图已5。。PartialBac-t0-Bac系统重组病毒的构建和基因的表达30杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件31杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课件32杆状病毒表达载体系统生产重组蛋白课