植物组织培养六

第七章细胞培养

植物细胞培养（plantcellculture）是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术

根据培养规模:小规模培养和大批量培养；

根据培养方式:悬浮培养、单细胞培养等；

根据要求产物:用于诱变的细胞培养和生产次生产物的细胞培养。

§1.单细胞分离§2.悬浮培养

§3.单细胞培养技术

§4.植物细胞大规模培养与次生产物生产

§1.单细胞分离

由完整的植物器官分离单细胞

由培养组织中分离单细胞

1、由完整的植物器官分离单细胞

叶片是分离单细胞的最好材料

机械法

酶解法

撕去下表皮露出叶肉细胞用解剖刀刮下细胞1-1、

机械法

第一种方法：用刀片刮叶片第二种方法：叶片研碎、离心研碎成粉加研磨介质过滤、离心只有薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。

1-2、

酶解法Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处理可以分离大量的叶肉细胞加果胶酶过滤、离心2、由培养组织分离单细胞

茎段步骤摇床用于振荡继代悬浮(3)（Suspensionculture)将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物15mlmedium/1g120rpmcultureTransfer1time/3d3weeks100-130目网过滤Centrifuge(离心）isolation注意：

选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

选择适宜的培养基：较高浓度激素浓度，特别是生长素，必要的附加物质，例如水解酪蛋白、Pro、Gln。

继代多次，以获得均匀一致疏松的愈伤组织。

§2.细胞胞悬浮培养养(cellsuspensionculture)一、细胞悬悬浮培养的的概念和意意义悬浮培养是是将单个游游离细胞或或小细胞团团悬浮在液液体培养基基中进行培培养增殖的的技术。Bioreactorforcontinuous

cellsuspensions

ShakerforsuspensioncultureCulturewheel1、细胞可可以不断增增殖，形成成高密度的的细胞胞群体，适适于大规模模培养；2、能够够提供大量量较为均匀匀的细胞，，为研究细细胞的生长长、分化创创造方法和和条件。CellsuspensionPlantsArtificialseedsSecondaryproductsIsolationprotoplastsMutationselect细胞悬浮培培养的应用用三.细胞悬悬浮培养的的方法1、培养基基对对于用用愈伤组织织制备的悬悬浮细胞培培养的培养养基以原愈愈伤组织继继代时的培培养基除去去琼脂为好好。为了提提高细胞的的分散度，，对于生长长素和细胞胞分裂素的的比例需要要进行一些些调节。2、培养细细胞的起始始密度及细细胞记数（1）最低低有效密度度的概念在悬浮细胞胞培养中，，使悬浮培培养细胞能能够增殖的的最少接种种量称为最最低有效密密度或者临临界的起始始密度。最最低有效效密度由于于培养材料料、原种培培养条件，，原种保存存时间长短短、培养基基的成分不不同而有差差异，一般般为104~105细胞/ml（2）细胞胞记数要保证细胞胞培养的最最低有效密密度，在细细胞游离后后要对分离离的单细胞胞进行记数数，可用血血球记数板板。（3）活细细胞测定除测定细胞胞密度外，，尚需要测测定活细胞胞率以作为为测定起始始密度的参参考

活细细胞率（%）=（5个视野中中的活细胞胞数/5个个视野中的的细胞总数数）×100%活细胞测定定的方法；；A、醋酸酯酯荧光素（（FDA））染色法FDA本身身无荧光，，无极性，，可自由通通过原生质质体膜进入入细胞内部部，进入后后由于受到活细胞胞内脂酶分分解，而产生有荧荧光的极性性物质荧光光素，不能能自由出入入原生质体体膜，在荧光显显微镜下观观察到的荧荧光是有活活力的，反反之无活力力。具体操操作：取取0.5ml细胞悬悬浮液放入入到小试管管中，加入入FDA溶溶液，使最最后浓度达达到0.01%，混混匀，室温温下作用5min，，荧光显微微镜观察。。B、酚藏红红花染色法法先配制0.1%酚藏藏红花溶液液，溶剂为为培养液。。检查时将将悬浮细胞胞取一滴放放在载玻片片上，滴一一滴0.1%酚藏红红花，盖上上盖玻片，，染成红色的的是死细胞胞，无色的的是活细胞胞。3、悬浮培培养细胞数数目的增殖殖变化细胞生长各各个时期的的特点：滞后期（延迟期））:细胞很很少分裂，，其长短与与接种量大大小和继继代时原种种细胞所处处的生长期期有关对对数生长期期:细胞分分裂活跃，，细胞数目目增加，增增长速率保保持不变直线生长期期:细胞生长长和发育最最明显的时时期缓慢期:生长逐渐渐缓慢,培培养液消耗耗将尽，有有毒代谢物物质质增多，氧氧气减少静止期:生长几乎乎处于停止止状态，细细胞数目增增加极少，，甚至开始始死亡。讨论:A、滞后期期的长短主主要取决于于在继代时时原种培养养细胞所处处的生长期期和转入细细胞数量的的多少。B、加入入条件培养养基可以缩缩短滞后期期。条条件培养基基：曾培养养过一段时时间组织或或细胞的培培养基。C、缩短两次继继代时间间间隔，则可使悬悬浮培养的的细胞一直直保持对数数生长期。。

D、如如果使处在在静止期的细细胞悬浮液液保持时间间太长，则会引起起细胞的大大量死亡和和解体。操作注意事事项：对悬浮培养养细胞继代代时，进液液口的孔径径要小，只只能通过单单细胞或小小细胞团（（2-4细胞），，使用吸管管或注射器器。继代前，培养容器器静置短时时间，大细细胞团沉降降，再吸上上层悬浮液液。

依此此，多次，，可建立良良好的细胞胞悬浮培养养物。4、细胞生生长的测定定对于任何一一个建立的的细胞悬浮浮系都应该该进行动态态的测定，，以掌握其其生长的基基本规律，，为继代培培养或其他他研究提供供依据。A、、细细胞胞记记数数注意意：：由由于于悬悬浮浮培培养养的的细细胞胞并并不不会会呈呈游游离离单单细细胞胞，，因因此此通通过过培培养养瓶瓶中中直直接接取取样样很很难难进进行行可可靠靠的的细细胞胞记记数数。。可可用用5%~8%铬铬酸酸或或0.25%的的果果胶胶酶酶对对细细胞胞团团进进行行处处理理生生长长速速率率pP=（（lnx-lnX0）/tX为为t时时间间的的细细胞胞密密度度，，X0为起起始始细细胞胞密密度度B、、细细胞胞大大小小的的测测定定技技术术（用用显显微微测测微微计计））C、、细细胞胞体体积积：将将一一定定量量的的细细胞胞悬悬浮浮液液放放入入放放入入15ml刻刻度度离离心心管管中中于于2000g离离心心5min。。以以每每毫毫升升培培养养液液中中细细胞胞体体积积的的毫毫升升数数来来表表示示。。D、、细细胞胞的的干干重重和和鲜鲜重重：将将一一定定量量的的细细胞胞悬悬浮浮液液加加到到预预先先称称重重的的尼尼龙龙布布上上，，用用水水冲冲洗洗并并抽抽滤滤除除去去细细胞胞粘粘着着的的多多余余水水滴滴，，然然后后称称重重，，两两者者差差就就是是细细胞胞的的鲜鲜重重。。干干重重一一般般是是将将离离心心收收集集的的细细胞胞转转移移到到预预先先称称重重的的滤滤纸纸片片上上，，然然后后在在60℃℃烘烘12h，，在在干干燥燥器器中中冷冷却却后后称称重重。。细细胞胞的的干干重重和和鲜鲜重重一一般般以以每每毫毫升升悬悬浮浮培培养养物物的的重重量量表表示示。。E、、有有丝丝分分裂裂指指数数在一一个个细细胞胞群群体体中中，，处处于于有有丝丝分分裂裂的的细细胞胞占占总总细细胞胞的的百百分分数数称称为为有丝丝分分裂裂指指数数，指指数数越越高高，，分分裂裂进进行行的的速速度度越越快快。。一一般般用用孚孚尔尔根根染染色色法法，，先先将将组组织织用用1molHCl在在60℃℃水水解解后后染染色色，，常常规规镜镜检检，，统统计计500个个细细胞胞，，计计算算。。5、、一一个个成成功功的的悬悬浮浮细细胞胞培培养养体体系系必必须须满足足三三个个条条件件：：悬浮浮培培养养物物分分散散性性良良好好，，细细胞胞团团较较小小，，一一般般在在30～～50个个细细胞胞以以下下，，在在实实际际培培养养中中很很少少有有完完全全由由单单细细胞胞组组成成的的植植物物细细胞胞悬悬浮浮系系。。均一一性性好好，，细细胞胞形形状状和和细细胞胞团团大大小小大大致致相相同同。。悬悬浮浮系系外外观观为为大大小小均均一一的的小小颗颗粒粒，，培培养养基基清清澈澈透透亮亮，，细细胞胞色色泽泽呈呈鲜鲜艳艳的的乳乳白白或或淡淡黄黄色色。。细胞胞生生长长迅迅速速，，悬悬浮浮细细胞胞的的生生长长量量一一般般2～～3天天甚甚至至更更短短时时间间便便可可增增加加一一倍倍。。6、、影影响响悬悬浮浮细细胞胞生生长长的的因因素素：起始始愈愈伤伤组组织织的的质质量量：松松散散性性好好、、增增殖殖快快、、再再生生能能力力强强。。其其外外观观一一般般是是色色泽泽呈呈鲜鲜艳艳的的乳乳白白或或淡淡黄黄色色，，呈呈细细小小颗颗粒粒状状，，疏疏松松易易碎碎。。接种种细细胞胞密密度度：接种初期的的细胞密度过过低往往使延延迟期加长，，悬浮细胞的的起始密度一一般在0.5～2.5××105个细胞/毫升升，低于这一一密度则会使使细胞生长延延迟。培养条件：方方式、温度、、继代周期四、悬浮细胞胞的同步化细胞同步化是是指同一悬浮浮培养体系的的所有细胞都都同时通过细细胞周期的某某一特定时期期。同同一培养养体系中，细细胞不同步使使悬浮细胞的的分裂、代谢谢以及生理、、生化状态等等更趋复杂化化，所以人们们一直希望通通过一定的技技术途径，使使同一培养体体系中的细胞胞能保持相对对一致的细胞胞学和生理学学状态，工作作中常用的处处理方法：1、物理方法法1）分选法通过细胞体积积大小分级，，直接将处于于相同周期的的细胞进行分分选，然后将将同一状态的的细胞继代培培养于同一培培养体系中。。悬浮液47μμm膜过滤滤液31μm膜膜过滤收集加入到10%~18%的的Ficoll加加入等体积积的培养基网网上细胞180g离心5min收集各细胞层层的细胞用培养基洗涤涤分分别别接种2）冷处理法法：低温处理可可以提高培养养体系中细胞胞同步化的程程度2、化学方法法

1）饥饿饿法悬浮培养细胞胞中，若断绝绝供应一种细细胞分裂所必必需的营养成成分或激素，，使细胞停滞滞在G1或G2期，经过过一段时间的的饥饿之后，，当在培养基基中重新加入入这种限制因因子时，静止止细胞就会同同步进入分裂裂。2）抑制剂法法通过一些DNA合成抑抑制剂处理细细胞，使细胞胞停留在DNA合成前前期，当解除除抑制后，即即可获得处于于同一细胞周周期的细胞。。常常用的抑制制剂有5-氟氟脱氧尿苷，，5-氨基尿尿嘧啶、羟基基尿等。3）有丝分裂裂阻抑用秋水仙素处处理指数生长长的悬浮培养养物，浓度一一般控制在0.2%，处处理时间以4-6小时为为宜无论何种细胞胞同步化处理理，对细胞本本身或多或少少都有一定的的伤害。如果果处理的细胞胞没有足够的的生活力，不不仅不能获得得理想的同步步化效果，还还可能造成细细胞的大量死死亡，因此在在进行同步化化处理之前，，细胞必须进行行充分的活化化培养。用于于处理的细胞胞系最好处于于对数生长期期。§3.单细胞胞培养技术一、植物单细细胞培养的意意义1、建立单细细胞无性系悬浮培养细胞胞间细胞间在在遗传、生理理和生化上存存在差异，这这些差异反映映在它们的产产量、品质、、抗病虫性和和抗逆性等方方面。如果能能将高抗、高高产、高品质质的细胞株筛筛选出来，无无疑会带来巨巨大的经济效效益。2、排除体细细胞的干扰3、利于对细细胞活动跟踪踪观察二、单细胞培培养的方法1、细胞平板板培养概念：将制备备好的单细胞胞悬浮液，按按照一定的细细胞密度，接接种在1mm左右的薄层层固体培养基基上进行培养养，称之为平平板培养主要技术要点点：单单细胞的分分离：一般采采用酶分离法法，小细胞团团不能超过6个细胞，因因此过滤时网网筛的网眼要要选择合适。。

单细胞胞悬浮液的制制备：分离的的单细胞经培培养基洗涤2次以后，调调整密度为5×105/ml植板：将1份已调整整好密度的单单细胞悬浮液液与4份35℃的固体培培养基充分混混合均匀，然然后均匀的平平铺与培养皿皿中，其厚度度为1-2mm。待植板板后的培养基基完全凝固后后，用石蜡或或parafilm封口口膜将培养皿皿封严以防污污染在25℃℃黑暗条件下下培养3周即即可长出肉眼眼可见的愈伤伤组织。植板率评估：它以能长出出细胞团的单单细胞在接种种单细胞中所所占的比例来来表示。植板率(％)＝(形形成的细胞团团数/接种的的细胞数)××100％计计算式中每每个平板新形形成的细胞团团数的计数方方法有两种：：一是直接计数数法，注意计量时时要掌握合适适的时间，即即细胞团肉眼眼已能分辨，，但尚未长合合到一起的时时候。二是感光法，在暗室的红红光下将一印印相纸放于欲欲计数的培养养皿下，其上上放一光源使使培养皿中细细胞团印到相相纸上，冲洗洗照片计数。。2、看护培养养概念：用一块愈伤伤组织或植物物离体组织看看护单细胞使使其生长增殖殖的一种单细细胞培养方法法。3、微室培养养

概念：人工制造一个个小室，将单单细胞培养在在小室中的少少量培养基上上，使其分裂裂增殖形成细细胞团的方法法，称微室培培养。特点：（1）能在显显微镜下追踪踪单细胞分裂裂增殖形成细细胞团的全过过程

（2））培养基少，，营养和水分分难以保持，，pH值变动动幅度大，培培养细胞仅能能短期分裂。。4、其它单细细胞培养技术术A饲养层培养养基技术将饲养细胞先先用射线辐射射处理，然后后将饲养细胞胞和培养细胞胞混合植板，，经过照射的的细胞对于培培养细胞起到到一个饲养作作用。B双层滤纸植植板培养方法法培养基饲养层细胞看护滤纸层转移碟滤纸培养细胞§4.植物细细胞大规模培培养与次生代代谢产产物生产一.概述二.培养系系统三.植物细细胞规模培养养技术要点四.提高细细胞次生代谢谢产物的途径径五.细胞规规模化培养中中的有关技术术问题一、概述植物次生代谢谢产物是指植植物中一大类类并非植物生生长发育所必必需的小分子子有机化合物物，其产生和和分布通常有有种属、器官官组织和生长长发育期的特特异性。次生产物在植植物中的合成成与分解过程程称为次生代代谢。所以把这一技技术认为是植植物细胞的““发酵工程””。A、有特殊的的类似发酵工工业反应器的的生产系统和和回收工艺。。B、与植物的的栽培不同，，而与发酵工工业相似，是独立众多的的外界环境因因素（包括天天气、地理、、季节、寄生生物等）的生生产过程。C、有较稳定定的产品的质质量和数量，，可节省耕地地，也可看作作是一个“农农作物”的储储存库。1.植物产产生代谢产物物的类型植物次生产物物种类繁多（（据保守估计计已超过2万万种），根据据分子结构不不同大致分为为：酚类化合物－－黄酮类单酚类醌类（苯醌醌、萘醌、蒽蒽醌）萜类化合物－－三萜皂甙甾体皂甙单萜、倍半萜萜、二萜含氮化合物－－生物碱（真真生物碱、伪伪生物碱、原原生物碱）胺类（伯、仲仲、叔、季胺胺）非蛋白质氨基基酸多炔类、有机机酸等2．植物次生代谢谢产物在医药药、食品、轻轻化工业等领领域具有重要要意义。李时珍（1593）在《《本草纲目》》中所开列的的1892种种药物绝大多多数是植物药药物，目前仍仍有约25％％的法定药品品来自植物。。其药物的有有效成分均为为次生产物。。产品成分

用途

年销售额（亿美元）长春花碱（长春花）治疗白血病

18～20（美国）阿吗灵

循环系统障碍药

5～25（全世界）奎宁（金鸡纳树）

治疗疟疾

5～10（美国）致热素

杀虫剂20（全世界）毛地黄

心脏病药

20～55（美国）

许多植物次生生代谢产物是是优良的食品品添加剂和名名贵化妆品原原料。有些是是生物毒素的的主要来源，，可以用于杀杀虫、杀菌，，而对环境和和人畜无害，，是理想的环环保产品。例例如：从胡萝卜、万万寿菊提取色色素

从黄菊菊提取芳香油油

栀子提取取果酸：果酸含有大大量的维生素素，如维生素素C、柠檬酸酸等。主要用用作食品的调调味剂，化妆妆行业用于制制作护肤品和和洗发香波等等，美容院用用作换肤液。。3．规模化细细胞培养是生生产植物次生生产物的理想想途径保保护生态环境境提提高生产效效率发发展新型型生物技术产产业生产方式

生产周期

紫草宁含量（％干重）

完整植株

2～3年

1～2

植物细胞培养3周14

来自于植物体体和细胞培养养的紫草宁含含量比较4、植物细胞胞培养的特性性1）植物细胞胞较微生物细细胞大得多，，有纤维素细细胞壁．细胞胞耐拉不耐扭扭，抵抗剪切切力差；2）培养过程程生长速度缓缓慢，易受微微生物污染，，需用抗生素素；

3）细细胞生长的中中期及对数期期．易凝聚为为直径达350mm一400mm的的团块，悬浮浮培养较难；；

4)培养养时需供氧，，培养液粘度度大：5)具有群体体效应；6)因为有细细胞壁,培培养细胞产物物滞留于细胞胞内，产量较较低；

7)细胞培养过过程具有结构构与功能全能能性,因而易易分化,从而而导致目的产产物低于原植植物体内的浓浓度；

8)悬浮培养中中要求有一定定的细胞浓度度，否则不生生长（25000~50000个/ml）。5、植物细胞胞培养需要解解决的问题（1）氧和二二氧化碳的控控制，过多氧氧过少氧均不不利于生长；；

（2）营营养物的供应应；

（3））细胞密度过过高引起细胞胞团聚甚至分分化

（4））培养过程中中细胞分化的的防止，（（5）细胞培培养中微生物物的去除；（（6）细胞胞壁脆性的存存在要求培养养体系剪切力力要小；二.培养系统统1.悬浮培养养系统机械搅拌式培培养系统机械搅拌式生生物反应器通通常是根据植植物细胞的特特性在微生物物发酵罐的基基础上作如下下改进：搅拌装置要减减少剪切，一般般改叶叶轮式式为螺螺旋式式。因为植植物细细胞生生长周周期长长，需需要随随时补补充水水分和和营养养，因因此必必须设计加加液装装置；由于植植物细细胞的的生理理活动动需要要新鲜鲜空气气，且且细胞胞代谢谢也可可能产产生有有害气气体，，所以以必须须设计计通气装装置；为便便于取取样观观察，，一般般还设设计有取样样口。。机械搅搅拌式式培养养系统统气压搅搅拌式式培养养系统统考虑到到机械械搅拌拌式反反应器器的剪剪切作作用难难以避避免，，同时时搅拌拌器转转动的的中轴轴往往往是容容易使使培养养物污污染的的部位位，因因此，，发展出出空气气提升升式生生物反反应器器，但但其缺缺点是是搅拌拌不均均匀。。旋转式式培养养系统统一般用用于产产品中中试或或某些些必需需裂解解细胞胞才能能获得得目的的产物物的培培养，，其优优点是是控制制精确确，处处理灵灵活，，缺点点是培培养体体积较较小。。2、固固定化化培养养系统统细胞固固定化化培养养技术术按照照其支支持物物不同同可以以分为为两大大类：：包埋式式固定定化培培养系系统：支持持物多多采用用琼脂脂、琼琼脂糖糖、藻藻酸盐盐、聚聚丙烯烯酰胺胺等；；附着式式固定定化培培养系系统：支持持物采采用尼尼龙网网、聚聚氨酯酯泡沫沫、中中空纤纤维等等材料料。平床培培养系系统。本系系统由由培养养、液液罐和和动泵泵等构构成。。新鲜鲜的细细胞被被固定定在床床底部部由聚聚屏烯烯等材材料编编织成成的无无菌平平垫上上。无无菌液液罐被被紧固固定在在培养养床的的上方方，通通过管管道向向下滴滴注培培养液液。培培养床床上的的营养养液再再通过过动泵泵循环环送回回中，，本系系统设设备较较简单单，比比悬浮浮培养养体系系能更更有效效地合合成次次生物物质。。不过过它占占地面面积大大，累累积次次生代代谢物物较多多的滴滴液区区所占占比例例不高高；而而且在在这密密封的的体系系中氧氧气的的供应应时常常成为为限制制因子子，经经常还还得附附加提提供无无菌空空气的的设备备。（2））立柱柱培养养系统统本方法法将植植物细细胞与与琼脂脂或褐褐藻酸酸钠混混合，，制成成一个个个1-2cm3的细胞胞团块块，并并将它它们集集中于于无菌菌立柱柱中。。这样样，下下滴的的营养养液流流经大大部分分细胞胞，亦亦即"滴液液区"比例例大大大提高高，次次生物物质的的合成成大为为增强强，同同时占占地面面积大大为减减小。。这一技技术的的优点点在于于：细胞位位置的的固定定使其其所处处的环环境类类似于于在植植物体体中所所处的的状态态，相相互间间接触触密切切，可可以形形成一一定的的理化化梯度度，有有利于于次生生产物物的合合成；；由由于细细胞固固定在在支持持物上上，培培养基基可以以不断断更换换，可可以从从培养养基中中提取取产物物，免免除了了培养养基中中因含含有过过多的的初生生产物物对细细胞代代谢的的反馈馈抑制制，也也由于于细胞胞留在在反应应器中中，新新的培培养基基可以以再次次利用用这些些细胞胞生产产初生生产物物，从从而节节省了了生产产细胞胞所付付出的的时间间和费费用；；正正是由由于细细胞固固定在在一定定的介介质中中，并并可以以从培培养基基中不不断提提取产产物，，因此此，它它可以以进行行连续续生产产。可可以以较容容易地地控制制培养养系统统的理理化环环境，，从而而可以以研究究特定定的代谢途径，，并便于调调节；植物细胞固固定化培养养时必须考考虑以下几几个问题：：①所选用用的植物细细胞的次生生代谢产物物的产量是是否很高，，细胞生长长速度是否否较慢并能能维持较长长时间的生生活能力；；②所选用用的固定支支持物对细细胞的存活活是否有影影响，对产产物的合成成是否有阻阻碍；③终产物物是否能释释放到培养养基中，如如果产物不不释放到培培养基中，，是否能采采用物理(电击)或或化学(离离子渗透法法)方法使使其释放而而又不影响响细胞生活活力。三.植物细细胞规模培培养技术要要点1.细胞系系的建立和和选择悬浮细胞系系单细胞养与与筛选种细胞增殖殖有效成分分分析2.优良细细胞系的增增殖培养所选择的优优良细胞系系，进行大大规模繁殖殖，得到足足够的细胞胞是建立细细胞规模化化培养体系系的中间环环节。3.大规模模培养体系系的建立一步法逐级级放大：对于细胞胞生长与目目的产物合合成同步的的类型，一一般采用此此方法建立立大规模培培养系统。。两步法：用于目的的产物合成成在细胞生生长发育到到一定时期期进行，细细胞生长和和产物合成成需要不同同的培养基基的类型。。先在细胞胞生长培养养基中培养养大批量细细胞，当细细胞生长至至合成产物物的阶段后后，再将其其转入到产产物合成培培养基中培培养。如果采用固固相培养方方式生产次次生产物，，一般均需需采用两步步法建立体体系。四.提高细细胞次生代代谢产物的的途径1．明确植植物细胞生生长与产物物合成的关关系生长偶联型型产物合成与与细胞生长长成正比。。如长春花花属植物中中的长春花花碱的合成成、烟草细细胞的烟碱碱合成、薯薯蓣属植物物中的薯蓣蓣皂甙的合合成等；中间型产物仅在细细胞生长下下降时合成成，细胞处处于指数生生长期或停停止生长产产物都不合合成。蒽醌醌类物质合合成的植物物细胞，托托品类生物物碱类合成成的植物细细胞等属于于此类型；；非生长偶联联型产物合成在在细胞生长长停止以后后。如紫草草宁的合成成。2、选择适适宜的起始始材料首先必须选选择能够高高效合成目目的产物的的植物种类类。再此前前提下，起起始培养材材料还应考考虑器官和和组织特异异性，通常常选取自然状态下下能够积累累次生产物物的部位，这样的细细胞经过培培养后常具具有合成目目的产物的的能力，或或比较容易易诱导合成成目的产物物。同时要要筛选高产产、稳产的的细胞株系系。3、选择合合适的培养养基成分一般来说，，增加培养养基的N，，P、K的的浓度能促促进细胞生生长，而适适当增加糖糖浓度有利利于次生产产物的合成成。培养基基的成分包包括培养条条件要通过一定的的实验才能能选择出既既有利于细细胞大量生生长繁殖又又有利于次次生代谢产产物大量产产生的培养养基。4、前体植物培养细细胞具有能能将有机化化合物进行行化学转化化的巨大潜潜力，这些些化学反应应包括皂化化、酯化、、醛基化、、羧基化、、异构化、、甲基化及及双键还原原等。因此此可在培养基中加加入适当的的进行上述述化学反应应的前体，，便有可能能为我们得得到需要的的化学转达达化目的产产物。5、激发子子的应用植物细胞次次生代谢除除了自身的的遗传或发发育基础外外，通常还还与诱导因因子有关。。在一些不不良环境或或有微生物物侵入的情情况下，细细胞次生代代谢活动显显著增强。。因此，人人为合理的的应用这些些诱导因子子，就有可可能提高目目的产物的的产量。激发子也称称诱导子，是指能够够诱导植物物细胞中一一个反应，，并形成细细胞特征性性自身防御御反应的分分子。A、非生物物激发子，如辐射、、金属离子子等B、生物激激发子，（外源激激发子，多多来源于微微生物，内内源激发子子，来源于于植物本身身的物质，，如降解细细胞壁的酶酶类，细胞胞碎片、寡寡聚糖等。。6、培养技技术的选择择包括对反应应器的选择择和对培养养方式的选选择，就目目前的技术术基础来讲讲，固定化化培养是植植物细胞规规模化生产产较为理想想的系统为为了同时时满足细胞胞生长和产产物合成的的需要，通通常需要在在不同阶段段使用不同同的培养基基，即两阶阶段培养为为了解决决产物对合合成的反馈馈抑制可以以采用两相相培养技术术，液-液系统统：分离相常常用的有液液体石蜡、、烷类化合合物、甘油油等液-固系统统：常用的有有活性炭、、硅酸镁载载体、沸石石、蚕丝、、树脂等。。一一般来来说，提取取相的选择择目标是具具有较大的的分离能力力，同时对对于没有毒毒副作用，，不影响产产物的化学学稳定性。。五．植物细细胞规模化化培养中的的有关工程程技术问题题1．悬浮培培养系统必必须适应植植物细胞特特性2．植物细细胞培养液液的流变特特性植物细胞培培养液的流流变特性常常用粘度来来描述培养过程中中培养液的的粘度变化化可由细胞胞密度和细细胞分泌物物以及细胞胞状态引起起。如烟烟草培养液液的表观粘粘度培养过过程中主要要是由培养养细胞密度度的增加引引起的，当当细胞密度度低于7gL-1时，培养液液的粘度基基本保持不不变，而当当细胞密度度高于此值值时，培养养液的粘度度即增加。。长春花花细胞培养养，当细胞胞密度在10gL-1时，培养液液属于假塑塑性流体，，此时，培培养液的粘粘度依赖于于细胞年龄龄、形态和和细胞团的的大小。在在相同物物质浓度下下，大细胞胞团的营养养液表观粘粘度明显大大于小细胞胞团培养液液的表观粘粘度。3．植物细细胞培养过过程中的气气体调节O2：KLa（体体积氧传递递系数，单单位时间、、单位体积积氧量）：：如在4L的气升式式反应器中中进行长春春花细胞培培养时，KLa在20h-1左右时，，细胞生长长与次生产产物合成均均维持在良良好状态；；又如在15L的通通风式反应应器中培养养的烟草细细胞，当KLa值值在5－10h-1的范围内内，随着KLa的的增加，生生物量和代代谢产物也也呈线性增增加。溶氧浓度：曾在不同同氧浓度下下对毛地黄黄细胞培养养进行培养养，结果显显示，当培培养基氧浓浓度从10%饱和度度上升至30%时，，细胞的生生长速率从从0.15d-1上上升至0.20-1，如果溶溶氧浓度继继续上升至至40%饱饱和度时，，细胞生长长速率反而而下降至0.17d-1。CO2：植物细胞能能非光合地地利用CO2，如在通气气调节过程程中，混入入2%－4%的CO2即能消除高高通气速率率对长春花花细胞生长长和产生代代谢产物的的不利影响响。总之，对于于植物细胞胞规模化培培养来讲，，在要求培培养基充分分均匀的同同时，O2和CO2的浓度必需需达到某一一平衡状态态。4．泡沫和和表面粘附附性植物细胞大大规模培养养中易产生生大量的泡泡沫，且覆覆盖有蛋白白质和粘多多糖，因而而粘性大，，细胞极易易被包埋在在其中从循循环的培养养液中带出出来，形成成非均相培培养而影响响培养系统统的稳定性性和生产率率。控制泡沫的的方式目前前通常采用用化学和机机械两种方方法。化学消泡剂剂必需满足足以下条件件：(1)具具有较低低的表面张张力和一定定的亲水性性，以使消消泡剂对气气/液界面面的分散系系数足够大大，消泡作作用迅速有有效；(2)化化学性质质稳定，在在水中的溶溶解度小，，不与次生生产物起任任何化学反反应，对植植物细胞无无毒害；(3)不不影响气气体在营养养液中的传传递和溶解解；(4)来来源方便，，价格便宜宜。常用的化学学消泡剂包包括天然油油脂类、高高级醇类、、聚醚类和和硅酮类。。实际应用用中必需根根据所培养养的植物种种类、次生生产物特性性具体选择择。植物细胞规规模化培养养中的另一一个问题是是，细胞往往往会粘附附于培养液液表面以上上的器壁上上，或电极极的挡板上上使这些细细胞脱离于于培养液造造成细胞死死亡，培养养液表面以以上的细胞胞可采用机机械去除，，电极上的的细胞多采采用在电极极上涂布硅硅油以防止止细胞粘附附。机械消泡泡是靠机机械装置置实现的的。其优点点是勿需需在培养养液中加加入其它它物质，，从而减减少了由由于消泡泡剂所引引起的污污染和对对后续分分离工艺艺的影响响。但机机械消泡泡效果常常不如化化学消泡泡迅速彻彻底，同同时机械械消泡也也会增加加培养装装置的复复杂性。。5、剪切切力对植植物细胞胞的影响响在大规模模的培养养中，植植物细胞胞对剪剪切力的的敏感性性一直是是力求解解决的主主要技术术问题之之一。剪切力对对植物细细胞的伤伤害主要表现现在机械械损伤，，表现为为细胞团团变小，，细胞破破损等，，从而造造成细胞胞内含物物释放到到培养基基中，从从而改变变了培养养系统的的物理特特性如PH，，流变特特性等，，进而影影响整个个培养系系统的细细胞生长长和产物物积累。。

因此此目前植植物细胞胞反应器器的设计原则则为提高高混合程程度和降降低剪切切力思考题1、名名词：植植物细胞胞培养、、悬浮培培养、单单细胞培培养、植植板率、、固定化化培养、、激发子子、次生生产物2．一一个好的的悬浮细细胞系有有哪些特特征？用用于建立立悬浮浮细胞系系的愈伤伤组织有有何要求求？3．建立立悬浮细细胞系的的关键技技术有哪哪些？4．悬悬浮细胞胞系在继继代培养养中其群群体生长长规律。。

5．．细胞大大规模培培养有哪哪些培养养系统？？

6．．植物细细胞规模模培养与与次生产产物生产产前景及及需要研研究解决决的问题题。9、静夜四无无邻，荒居居旧业贫。。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、雨中黄叶叶树，灯下下白头人。。。01:12:1301:12:1301:1212/25/20221:12:13AM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2201:12:1301:12Dec-2225-Dec-2212、故人江海别别，几度隔山山川。。01:12:1301:12:1301:12Sunday,December25,202213、乍见翻疑梦梦，相悲各问问年。。12月-2212月-2201:12:1301:12:13December25,202214、他他乡乡生生白白发发，，旧旧国国见见青青山山。。。。25十十二二月月20221:12:13上上午午01:12:1312月月-2215、比比不不了了得得就就不不比比，，得得不不到到的的就就不不要要。。。。。。十二二月月22