《经典开题报告》教学课件

《经典开题报告》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！《经典开题报告》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用1研究背景研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究方法、手段、技术路线及可行性分析统计学分析课题创新之处年度方案及预期进展实验条件及经费预算研究背景2研究背景研究背景3Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病机体免疫反响在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保护中均起重要作用研究Hp感染的免疫致病机制及Hp疫苗防治机制有重大意义Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病4Th免疫反应分泌IL-2、IFN-γ、TNF介导细胞免疫

ThTh1Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13介导体液免疫反应Treg分泌IL-10、TGFβ免疫抑制Th免疫反应分泌IL-2、IFN-γ、TNFThTh1Th25Th1Th2IFN-γ(-)

(-)

IL-4

Th1与Th2关系Th1Th2IFN-γ(-)(-)IL-4Th1与Th6Hp与Th反应Hp感染Th1占优势Th1和Th2失衡招募Treg感染持续存在Hp疫苗诱导Th1、Th2Th1和Th2失衡纠正Treg减少感染清除Hp与Th反应Hp感染Th1占优势Th1和Th2失衡招募Tr7Tim家族Tim家族8Tim蛋白结构Tim蛋白结构9Tim-3是第一个被发现与T细胞反响有关的Tim家族成员表达在成熟Th1细胞膜上不表达在未成熟Th细胞、Th2细胞上包含Ig-V样构造域的信号肽、粘附素样构造域、跨膜区域、细胞内尾巴Tim-3激活后降低Th1反响Galectin-9是Tim-3的配体，主要表达在CD4+的T细胞Tim-3/Galectin-9通路的激活可导致Th1细胞效应功能的终止Tim3和Tim3配体Tim-3是第一个被发现与T细胞反响有关的Tim家族成员Ti10Tim-3与Th1Tim-3与Th111TLR家族及配体TLR家族及配体12TLR4信号通路TLR4信号通路13我们前期研究发现阻断Tim-3信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活NF-κBTLR信号的负性调控因子SIGIRR可上调Tim-3的表达提示：Tim-3和TLR4信号通路可相互调控

Tim3和TLR4我们前期研究发现Tim3和TLR414我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少说明Tim-3信号通路在调节Treg控制炎症反响中起重要作用Treg和Tim-3我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少T15Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并且与TLR4信号通路和Treg密切相关TLR4信号通路Treg变化Th反应Tim-3/Tim-3LHp致病和疫苗免疫保护Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并16我们的研究还发现Tim-3阻断提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜内Hp定植密度加剧Hp疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程度提示Tim-3信号通路参与Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用问题：Tim-3信号通路激活，将会对Hp感染和Hp疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚

我们的研究还发现Tim-3阻断17体外研究

体内研究

研究内容体外研究体内研究研究内容18研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反响、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反响和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系体内研究研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th119Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察以下指标：小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化胃黏膜局部Tim-3表达、Treg和几个有代表性的Th1〔IFN-γ、LI-12〕和Th2〔IL-4、IL-10〕细胞因子含量的变化胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子〔TLR4、MyD88、NF-κB〕的变化。胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况观察指标Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察20淋巴细胞对Hp刺激的增殖反响Tim-3阳性细胞的数量培养上清液中Th1和Th2细胞因子含量CD4+效应T细胞中TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子的变化比较它们与未处理组的差异体外研究观察小鼠的脾淋巴细胞用Tim-3L(Galectin-9)预处理后与Hp共培养后：

淋巴细胞对Hp刺激的增殖反响体外研究观察小鼠的脾淋巴细胞用21说明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反响、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反响和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系研究目标说明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th122说明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系明确通过对Tim-3/Tim-3L信号通路的调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用拟解决的关键科学问题说明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变23研究方法和步骤研究方法和步骤24体内研究未经处理组:①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组Tim3配体处理组：①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组体外研究未经处理组：①Hp刺激组②空白组Tim3配体处理组：①Hp刺激组②空白组试验分组体内研究试验分组25Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂根底上，微需氧条件下〔O25%、CO210%、N285%〕37℃培养2-3天Hp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素〔CT〕和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗HP培养及疫苗制备Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择266-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠处死，取胃黏膜进展病理检查和Hp培养，确定Hp感染模型的建立Hp感染小鼠模型6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的279/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次，共4次。末次攻击后4周处死小鼠，取标本检测各项指标Hp疫苗的接种9/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次28在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μgGalectin-9

Galectin-9预处理在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μg29用淋巴细胞别离液别离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml的Galectin-9预处理2h，按细胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，共同孵育24-48〔3、6、12、24、48〕小时后，测细胞的增殖反响，并收集细胞和培养上清，测各项指标Hp刺激鼠脾淋巴细胞用淋巴细胞别离液别离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml30采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内Treg采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞Tim-3阳性细胞采用ELISA法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含量采用细菌培养和组织学Giemsa染色法检测Hp采用MTT法进展细胞增殖试验检测方法检测方法31技术路线流式细胞仪检测脾内Tim3阳性细胞胃粘膜内TLR4通路关键分子免疫组化、westernblotBALB/C小鼠未处理组Tim3配体组空白组Hp感染组疫苗组胃粘膜病理及Hp检测胃粘膜内Th1Th2细胞因子ELLISA检测技术路线流式细胞仪检胃粘膜内TLR4BALB/C小鼠未处理组32技术路线鼠脾淋巴细胞Tim3配体组未处理组Hp刺激组空白组培养细胞Tim3阳性细胞流式细胞仪培养上清Th1Th2细胞因子ELISA检测培养细胞内TLR4信号通路分子WesternBlot细胞增殖试验MTT技术路线鼠脾淋巴细胞Tim3配体组未处理组Hp刺激组空白组培33课题选题合理，具有理论根底课题所采用的技术均已建立，在技术上确保了本工程的完成本实验所需的仪器设备本单位根本齐全可行性分析课题选题合理，具有理论根底可行性分析34计量资料: ①多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时采用秩和检验②多个样本的两组间比较采用SNK-q检验计数资料:采用X2检验等级资料：采用Kruskal-WallisH检验。P≤0.05时有统计学意义统计学分析计量资料: 统计学分析35

Tim3/Tim3L信号通路在Hp感染致病及疫苗免疫中作用研究国内外未见报道创新之处Tim3/Tim3L信号通路在Hp感染致病及疫苗免疫362011.12-2012.02

查阅相关文献，完成综述2012.03-2012.04

收集资料，完成各项准备工

作，进行预实验2012.05-2012.12

正式实验，并检测各项指标2013.01-2013.03

整理数据并分析，统计处

理，完成论文年度计划2011.12-2012.02查阅相关文献，完成综述年度37激活Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染和Hp疫苗免疫小鼠Th免疫反响、TLR4信号通路及Treg通过调节Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染结局及Hp疫苗免疫效果发表一篇SCI论文，题目为Tim3/Tim3L信号通路在幽门螺杆菌免疫致病及疫苗免疫中的作用及机制预期研究结果激活Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染和Hp疫苗免疫38BALB/C小鼠2000元消耗材料费8000元WesternBlot20000元抗体70000元RT-PCR10000元细胞因子检测试剂15000元流式细胞检测费20000元总计135000元经费预算BALB/C小鼠39谢谢！谢谢！40《经典开题报告》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！本课件PPT仅供大家学习使用学习完请自行删除，谢谢！《经典开题报告》幻灯片本课件PPT仅供大家学习使用41研究背景研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究方法、手段、技术路线及可行性分析统计学分析课题创新之处年度方案及预期进展实验条件及经费预算研究背景42研究背景研究背景43Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病机体免疫反响在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保护中均起重要作用研究Hp感染的免疫致病机制及Hp疫苗防治机制有重大意义Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病44Th免疫反应分泌IL-2、IFN-γ、TNF介导细胞免疫

ThTh1Th2分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13介导体液免疫反应Treg分泌IL-10、TGFβ免疫抑制Th免疫反应分泌IL-2、IFN-γ、TNFThTh1Th245Th1Th2IFN-γ(-)

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IL-4

Th1与Th2关系Th1Th2IFN-γ(-)(-)IL-4Th1与Th46Hp与Th反应Hp感染Th1占优势Th1和Th2失衡招募Treg感染持续存在Hp疫苗诱导Th1、Th2Th1和Th2失衡纠正Treg减少感染清除Hp与Th反应Hp感染Th1占优势Th1和Th2失衡招募Tr47Tim家族Tim家族48Tim蛋白结构Tim蛋白结构49Tim-3是第一个被发现与T细胞反响有关的Tim家族成员表达在成熟Th1细胞膜上不表达在未成熟Th细胞、Th2细胞上包含Ig-V样构造域的信号肽、粘附素样构造域、跨膜区域、细胞内尾巴Tim-3激活后降低Th1反响Galectin-9是Tim-3的配体，主要表达在CD4+的T细胞Tim-3/Galectin-9通路的激活可导致Th1细胞效应功能的终止Tim3和Tim3配体Tim-3是第一个被发现与T细胞反响有关的Tim家族成员Ti50Tim-3与Th1Tim-3与Th151TLR家族及配体TLR家族及配体52TLR4信号通路TLR4信号通路53我们前期研究发现阻断Tim-3信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活NF-κBTLR信号的负性调控因子SIGIRR可上调Tim-3的表达提示：Tim-3和TLR4信号通路可相互调控

Tim3和TLR4我们前期研究发现Tim3和TLR454我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少说明Tim-3信号通路在调节Treg控制炎症反响中起重要作用Treg和Tim-3我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少T55Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并且与TLR4信号通路和Treg密切相关TLR4信号通路Treg变化Th反应Tim-3/Tim-3LHp致病和疫苗免疫保护Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并56我们的研究还发现Tim-3阻断提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜内Hp定植密度加剧Hp疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程度提示Tim-3信号通路参与Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用问题：Tim-3信号通路激活，将会对Hp感染和Hp疫苗免疫产生何种影响？目前尚不清楚

我们的研究还发现Tim-3阻断57体外研究

体内研究

研究内容体外研究体内研究研究内容58研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反响、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反响和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系体内研究研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th159Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察以下指标：小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化胃黏膜局部Tim-3表达、Treg和几个有代表性的Th1〔IFN-γ、LI-12〕和Th2〔IL-4、IL-10〕细胞因子含量的变化胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子〔TLR4、MyD88、NF-κB〕的变化。胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况观察指标Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察60淋巴细胞对Hp刺激的增殖反响Tim-3阳性细胞的数量培养上清液中Th1和Th2细胞因子含量CD4+效应T细胞中TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子的变化比较它们与未处理组的差异体外研究观察小鼠的脾淋巴细胞用Tim-3L(Galectin-9)预处理后与Hp共培养后：

淋巴细胞对Hp刺激的增殖反响体外研究观察小鼠的脾淋巴细胞用61说明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反响、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反响和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系研究目标说明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th162说明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系明确通过对Tim-3/Tim-3L信号通路的调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用拟解决的关键科学问题说明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变63研究方法和步骤研究方法和步骤64体内研究未经处理组:①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组Tim3配体处理组：①Hp感染组②Hp疫苗组③对照组体外研究未经处理组：①Hp刺激组②空白组Tim3配体处理组：①Hp刺激组②空白组试验分组体内研究试验分组65Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂根底上，微需氧条件下〔O25%、CO210%、N285%〕37℃培养2-3天Hp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素〔CT〕和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗HP培养及疫苗制备Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择666-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠处死，取胃黏膜进展病理检查和Hp培养，确定Hp感染模型的建立Hp感染小鼠模型6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，给予含109/ml的679/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次，共4次。末次攻击后4周处死小鼠，取标本检测各项指标Hp疫苗的接种9/ml的SS1Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次68在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μgGalectin-9

Galectin-9预处理在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100μg69用淋巴细胞别离液别离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml的Galectin-9预处理2h，按细胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，共同孵育24-48〔3、6、12、24、48〕小时后，测细胞的增殖反响，并收集细胞和培养上清，测各项指标Hp刺激鼠脾淋巴细胞用淋巴细胞别离液别离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml70采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞TLR4、MyD88、NF-κB和Tim-3采用Westernblot法和免疫组化法检测胃黏膜内Treg采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞Tim-3阳性细胞采用ELISA法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含量采用细菌培养和组织学Giemsa染色法检测Hp采用MTT法进展细胞增殖试验检测方法检测方法71技术路线流式细胞仪检测脾内Tim3阳性细胞胃粘膜内TLR4通路关键分子免疫组化、westernblotBALB/C小鼠未处理组Tim3配体组空白组Hp感染组疫苗组胃粘膜病理及Hp检测胃粘膜内Th1Th2细胞因子ELLISA检测技术路线流式细胞仪检胃粘膜内TLR4BALB/C小鼠未处理组72技术路线鼠脾淋巴细胞Tim3配体组未处理组Hp刺激组空白组培养细胞Tim3阳性细胞流式细胞仪培养上清Th1Th2细胞因子ELISA检测培养细胞内TLR4信号通路分子WesternBlot细胞增殖试验MTT技术路线鼠脾淋巴细胞Tim3配体组未处理组Hp刺激组空白组培73课题选题合理，具有理论根底课题所采用的技术均已建立，在技术上确保了本工程的完成本实验所需的仪器设备本单位根本齐全可行性分析课题选题合理，具有理论根底可行性分析74计量资料: ①多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时采用秩和检验②多个样本的两组间比较采用SNK-q检验计数资料:采用X2检验等级资料：采用Kruskal-Wallis