qRT-PCR-生物分析检测技术课件

第二节实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR仪、技术原理及应用一、实时荧光定量PCR仪二、实时荧光定量PCR的技术原理

1.定量与常规的差别2.荧光扩增曲线3.荧光阈值和CT值

4.熔解曲线5.标准曲线

6.何为实时？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（发夹型杂交探针）的工作原理9.TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理10.多色多通道技术应用——基因表达分析11.内标技术介绍三、实时荧光定量PCR技术的应用介绍1.医疗方面2.研究方面

3.其它方面四、荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单五、实时定量PCR及应用于植物分子生物学的研究不产热的光源---

发光二极管（LED）灵敏度高的检测器---

光电倍增管（PMT）优点：

不产热---无散热装置，全封闭无机械转动装置---抗震性强无需经常校准，耐用灵敏度高线性范围广

Opticon实时荧光定量PCR仪荧光检测热循环仪光色:蓝色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes

精确性:±0.3°C激发光波长：450-495nm发射光波长:515-545nm

升降温速率:最高3°C/秒.灵敏度:<5nM的荧光素温度梯度:有检测范围:100-108拷贝容量:96样品反应管:0.2mL反应管&96孔板操作系统:WindowsNT二、实时荧光定量PCR的技术原理1.定量与常规的差别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR技术简介

实时荧光定量PCR技术简介

实时荧光定量PCR技术简介实时荧光定量PCR：其反应体系中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。3.荧光阈值和CT值

荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。荧光阈值线的位置一般事实上位于减去本底的位置上，这时的荧光信号超过了荧光背景信号并且开始增加。对某一样品的C（t）值就定义为荧光量与荧光阈值线交叉时的循环数。即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。

定量荧光扩增曲线是荧光量与循环数的图表。4.熔解曲线在PCR结束后，我们可以根据变性过程中的荧光值变化绘出每个样品的熔解曲线。绘制熔解曲线时，Real-TimePCR仪连续监测每个样品在从双链完全配对到完全解链的升温过程中荧光值的变化过程。不同的扩增产物因为其长度和GC含量不同而在不一样的温度下解链，当产物解链时，SYBRGreenⅠ的荧光值将降低并被仪器监测到。由此绘制出荧光强度随温度变化的负一次倒数图。荧光强度变化的拐点（熔点，Tm）即为熔解峰值。熔解曲线是扩增反应的质控途径，当图中没有出现杂峰，也未出现主峰的异常增宽：表明实验中未出现污染、引物二聚体和非特异性扩增。

5.标准曲线CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系：起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表CT值，纵坐标代表起始拷贝数的对数（如图3所示）。因些只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。Thistechnologyisvery

sensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable)Quantitationcanbe"relative"toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,or"absolute"whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.SYBRGreenⅠ的特点由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链DNA熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以区分非特异扩增。此外，由于一个PCR产物可以与多个分子的染料结合，因此SYBRGreenⅠ的检测灵敏度很高。但是，由于SYBRGreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBRGreenI。MolecularBeacons（发夹型杂交探针）的工作原理原理：荧光谐振能量传递（FRET）

环与目标序列完全配对

茎由互补配对的序列组成变性:产生非特异性的荧光延伸:没有荧光分子Beacons是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中：位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。分子信标的结构：是一个具有茎－环（loop-stem）结构的寡核苷酸探针，通常有25～35个核苷酸，两端分别标上一个荧光基团和淬灭基团。分子Beacons的茎环结构中，环的部分用于与靶序列杂交（与目标序列互补），通常由15～30个核苷酸组成，要求与靶序列杂交后能形成与探针－靶序列双螺旋有关的反式构型，并使干的部分打开，尽量得使荧光基团和淬灭基团分开足够的距离。一般茎（干的部分）一般5-8个核苷酸长（碱基对），并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，一般连在5’端；而淬灭基团一般连在3’端。通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作为淬灭基团。分子Beacons必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下：

模板不存在时形成茎环结构；

模板存在时则与模板配对。自由状态时，分子信标呈发夹型结构，荧光基团和淬灭基团靠得很近，二者之间发生能量转移（FRET和直接能量转移），荧光基团的能量被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭。。当有靶序列存在的时候，靶序列和分子信标的探针序列杂交形成有一定刚性的双螺旋结构，导致分子信标的构象改变，干的部分打开，荧光基团与猝灭基团分开，二者之间的能量转移终止；在有相应的单色光激活时，荧光基团发出荧光。荧光强度与溶液中靶序列的多少成正比，通过检测荧光的强度就可以计算出靶序列的量。Beacons与模板配对后：分子Beacons的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开；当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子。分子Beacons不同于SYBRGreen的一个优点就是它特异性地检测感兴趣的目标DNA。通过精心设计分子Beacons和优化反应条件（温度和缓冲液）后，其灵敏度非常高，可用于单核苷酸多态性（SNPs）的检测。但是，为检测某一特定的目标DNA，每一个探针都必须单独仔细地设计。

分子Beacons是美国纽约公共健康研究学会的技术专利。MolecularBeacons

的应用范围及优缺点

定量起始模板浓度基因型分析鉴定产物单核苷酸多态性（SNP）检测对目标序列有很高的特异性，用于SNP检测的最灵敏的试剂之一荧光背景低设计困难无终点分析功能只能用于一个特定的目标价格较高9.

TaqMan（水解型杂交探针）的工作原理

目标特异性探针5’为荧光素，3’为淬灭剂模板和探针杂交

延伸:聚合反应，Taq酶切下5’端荧光素出现荧光TaqMan(水解型杂交探针)的应用范围及优缺点

定量起始模板浓度基因型分析产物鉴定

SNP分析对目标序列有很高的特异性,特别适合于SNP检测与MolecularBeacons相比，设计相对简单价格较高只适合于一个特定的目标

不能进行融解曲线分析QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetector

DeborahS.Grove

NucleicAcidFacility,LifeScienceConsortium,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA16802

Probe

Aprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforward

andreverseprimers.Theprobeislabeledatthe5‘endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein[6-FAM]，6-羧基荧光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

[TAMRA],6-羧基-四甲基-若丹明)addedatanyTpositionoratthe3'end.TheprobeisdesignedtohaveahigherTm

thantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridized

forsuccessoftheassay.PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter.However,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（内在的，固有的）5'to3'nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.

Fluorogenic5'nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.TheCt

isinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.

Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples.BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.

Turn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequence

specificprobeisrequired.Userswillalsoneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mm

thermalmicroseal

filmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（数不清的）.

DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.

GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.Setupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironment

thantraditionalPCRtechniques.Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.Allelic(等位基因的)discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.Oneprobelabeledwith6-FAM(6-羧基荧光素)representsoneallele（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.Amismatchleadsto

alessefficientamplification.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal.Heterozygotes（杂合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.Allthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication

10.多色多通道技术应用

——基因表达分析PRIMERANDPROBEDESIGN

Primersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5'and3'ends.

PE/ABDPrimerExpresssoftware,

whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram.TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10°Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58°Cand60°C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5'Gs.Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase,andtheprobesonly

havetodifferbythatbase.AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.

PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa"probeless"alternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.

11.内标技术介绍三、实时荧光定量PCR技术的应用介绍荧光定量PCR技术的应用对DNA、RNA样品进行定量和定性分析定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。可以不定期对PCR产物或样品进行定性分析如：利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及SNP检测等。目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），及特定基因在不同相的表达差异；比较正常组织与病理组织中各种mRNA表达量差异；验证基因芯片实验结果；验证RNA干扰实验结果。四、荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单专用工作服和工作鞋专用办公用品一次性手套、一次性吸水纸微量加样器一套（覆盖1~1000ul）

以上物品各一套。2~8℃和-20℃或-80℃冰箱混匀器耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心）高速台式冷冻离心机五、实时定量PCR及应用于植物分子生物学的研究Microarray最强大的功能是平行分析，在单次实验中同时观察上万种RNA的相对量变，也因为平行处理之故，无法对每一个probe做最佳化、标准化，所以目前大部份结果都会再以

NorthernblotorReal-timequantitativePCR再做确认。虽然Northernblot在过去曾扮演十分称职的角色，但有時microarray筛选出來的基因常有上千个谱，以传统方法来验证，仍是耗费人力物力的苦差事。

Real-timequantitativePCR

在近年来迅速普及，原因在其高灵敏度、快速及精确，样品需求量少也是很重要的优势，是最适合承接microarray验证的工具。

LaserCapturedMicrodissection(LCM)

RealTimeQuantitativePCR：量化组织中特定基因之表现共聚焦显微影像系统(ConfocalImagingSystem)流速细胞筛选分析系统(FlowCytometry)以上技术就基因表现之各个面相作系统探讨。

实验程序（举例）RNA的定量：RNA的测量仪上，以NonoDrop软件进行RNA的定量(ng/µl)。如浓度过高必须稀释后再定量，以便定量尽可能地准确。同时，可从260/280的比值看出RNA的纯度(一般在1.9-2.1之间)是否在要求的范围内。RNA的反转录及cDNA模板的稀释：用作RNA反转录的RNA量，在盐芥和拟南芥两种材料、各200mMNaCl处理2小时及对照的4种RNA之间必须完全准确一致，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的RNA量均为2000ng。以下的反转录体系中RNA和RNase-freeH2O的总体积为8.5µl

。RNA+RNase-freeH2O：8.5µl(2000ngRNA)Oligo-dT18(500ng/µl)：0.5µldNTP(2.5mM/each)：4µl计

：13µl该体系于65-70℃，5min；置于冰上冷却后，加下面反应体系：5×

RTBuffer：4µl0.1MDTT：2µlSuperScriptIIIRT：1µl总计：20µl混匀，50℃保持6小时或过夜，即得到20µlcDNA；该cDNA稀释20倍，即为400µl稀释的cDNA，此用于实时定量PCR作为反应模板。

DTT即Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C4H10O2S2。

是一种常用d的小分子有机还原剂，有抗氧化作用。二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖）。DTT的异构体为Dithioerythritol（DTE），即DTT的氧化结构。

实时定量PCR(Real-timePCR)

SYBR®GreenPCRMasterMix：12.5µl稀释的cDNA模板：2µlPrimer-F：1µlPrimer-R：1µl总计：25µl

2-ΔΔCT方法与相对基因表达差异的分析使用内标基因的目的是为了对加入到反转录反应中的RNA进行均一化处理，标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时PCR反应的内标基因包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），β-actin(细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin)、β2-microglobulin(微球蛋白)以及rRNA；当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。

相对定量的方法分析基因表达差异(i)选择一个内标基因；(ii)确定内标的有效性，确保它不会受到实验处理的影响；(iii)通过PCR扩增目标基因和内标基因RNA或cDNA的一系列梯度稀释模板，确保它们的

扩增效率相同。(iv)最后通过2-ΔΔCT计算将统计数据转化成线性形式而不是原始CT值。ΔΔCT表示目标基因和内标基因CT值的差异;

2-ΔΔCT方法是实时定量PCR实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。Giovanna(2002)提出“相对CT”或“δ-δCT”的方法，这个方法的优点是不需要为每次实验制作标准曲线，只需要一个优化步骤证明外源基因与内源基因有相同的、至少是相似的反应效率即可。比较CT方法的优点是无需标准曲线、适合多个样品，当然它也消除了创造标准曲线时任何稀释错误的不利影响。

相比于标准子(normalizer)，比较CT法(ΔΔCT)在对模板进行相对定量、监测基因的表达水平时，不需标准曲线并增加了样品的通量；为了使这个方法成功应用，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。只要靶基因和标准者具有相似的动力学范围，比较CT(ΔΔCT)方法就是最具有实际应用价值的方法。2-ΔΔCT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型；本实验中参照因子是未经NaCl处理的对照样品；内标基因为标准的看家基因Actin。根据实验获得的经验值，使用公式：

1.9-ΔΔCT进行统计分析。每个基因在两种处理情况下的表达水平均来自3次实时定量PCR的平均值。Ct-ActinCt(control)Ct-ActinCt(200mMNaCl处理)deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDevThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia(缺氧症）ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner,IsabelleDupuis,andCrisKuhlemeier*InstituteofPlantSciences,Altenbergrain21,CH–3013Berne,SwitzerlandPlantPhysiology,June2003,Vol.132,pp.968–978,©2003AmericanSocietyofPlantBiologistsFermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen,mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress.

Pyruvatedecarboxylase

(PDC,丙酮酸盐(或酯)脱羧酶),whichcatalyzesthefirststepinthispathway,isthoughttobethemainregulatoryenzyme.PDCis

encodedbyfourcloselyrelatedgenes

inArabidopsis.

Usingreal-timequantitativepolymerasechainreaction,wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgene

indifferenttissues,undernormalgrowthconditions,andwhentheplantsweresubjectedto

anoxiaorotherenvironmentalstressconditions.

PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses.Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genefamily.Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia，butALDH2B7

reactsstronglyto

ABAapplicationand

dehydration,suggestingthatALDHmayplayaroleinaerobicdetoxificationofacetaldehyde.Discussthepossibleroleofethanolicfermentationasarobustback-upenergyproductionpathwayunderadverseconditionswhenmitochondrialfunctionisdisturbed.Estimatingthecopynumberoftransgenesintransformedricebyreal-timequantitativePCR.

YangL,DingJ,ZhangC,JiaJ,WengH,LiuW,ZhangD.

SchooloflifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,800DongchuanRoad,Shanghai,200240,People'sRepublicofChina.

PlantCellRep.2005Mar;23(10-11):759-63.Epub2004Oct1.

Intransgenicplants,transgenecopynumbercangreatlyinfluencetheexpressionlevelandgeneticstabilityofthetargetgene,makingestimationoftransgenecopynumberanimportantareaofgeneticallymodified(GM)cropresearch.TransgenecopynumbersarecurrentlyestimatedbySouthernanalysis,whichislaboriousandtime-consuming,requiresrelativelylargeamountsofplantmaterialsandmayinvolvehazardousradioisotopes.

Reportherethedevelopmentofasensitive,high-throughputreal-time(RT)-PCRtechniqueforestimatingtransgenecopynumberinGMrice.UseTaqManquantitativeRT-PCRandcomparisontoanovelriceendogenousreferencegenecodingforsucrosephosphatesynthase(SPS)todeterminethecopynumbersoftheexogenousbeta-glucuronidase(GUS)andhygromycinphosphotransferase(HPT)genesintransgenicrice.Thecopynumbers

oftheGUSandHPTin

primaryricetransformants(T0)werecalculatedbycomparingquantitativePCRresultsoftheGUSandHPTgeneswiththoseoftheinternalstandard,SPS.

WithoptimizedPCRconditions,achievedsignificantlyaccurateestimatesofone,two,threeandfourtransgenecopiesintheT0transformants.CopynumberestimationsofboththeGUSreporter

geneandtheHPTselectivemarkergeneshowedthatrearrangementsoftheT-DNAoccurredmorefrequentlythanisgenerallybelievedintransgenicrice.

Anexpressionanalysisofagenefamilyencodingplasma