pH对热处理状态下κ-酪蛋白水解作用和凝乳酶凝胶脱脂乳作用的影响

pH对热处理状态下K-酪蛋白水解作用和凝乳的

凝胶脱脂乳作用的影响EffectofpHatheattreatmentonthehydrolysisofk-casein

andthegelationofskimmilkbychymosin目录TOC\o"1-5"\h\z摘要2.简介2.材料和方法334344444调整pH值、热处理和pH值的再度调整对牛奶样品的凝乳酶作用的监测流变特性离心分离凝胶电泳和光密度分析法.结果与讨论5致谢7牛奶的pH重调，酪蛋白在胶体相和血清相之间的分布摘要脱脂牛奶是指牛奶在调整pH值在6.5和7.1之间，在90c加热30分钟后的牛乳。热处理后，样本再次进行调整到自然pH（pH值为6.67）,建立新的平衡。高浓度的变性乳清蛋白与在pH为6.5时加热过程中的酪蛋白胶束有关（约占加热30分钟后总数的70380%。变性乳清蛋白的含量在加热的条件下随pH的升高而降低。所以分别在pH6.7、6.9、7.1加热30分钟后与酪蛋白胶束有关的变性乳清蛋白的含量为30%20%10%在加热时pH的增加使越来越多的酪蛋白转入到血清相中。以k-酪蛋白的损失和副-k-酪蛋白的形成时间作为用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS检测牛奶样本凝乳酶处理的结果。无论pH值在加热或热处理应用中，k-酪蛋白的损失和副-k-酪蛋白的形成在常温或加热的样品中相似。检测用凝乳酶作用过的牛奶样品的胶凝化性能随时间的变化表明不管已变性的乳精蛋白是否与酪蛋白微胶粒或牛奶中的血清有关，经过热处理的奶的凝胶化时间显著增加，所形成的凝胶的牢固性显著减小。pH对热处理没有影响。这些结果表明，牛奶的热处理只对凝乳酶反应（酶相）的初级阶段有很小的影响。然而，热处理对本反应的第二阶段有显著影响，不管变性乳精蛋白是否和酪蛋白胶束或牛奶血清中不沉淀的聚集体有关，其效果是类似的。关键词：牛奶；热处理；pH值；凝乳酶；酪蛋白胶束；凝胶。1.简介在牛的酪蛋白胶束中，K-酪蛋白主要位于二硫键连接的聚合物的胶束表面。疏水的N末端区域与亲水的胶束相关联，带负电荷的C末端区域作为一个高度柔性的纤维在胶束表面突出。这种结构使酪蛋白胶束的稳定性提高，因为柔性纤维提供了抗聚集的空间位阻和静电稳定。虽然酪蛋白非常稳定，但是他们可以通过某些方法破坏，如酸化至等电点，加入溶剂如乙醇或某些特定酶。酪蛋白胶束酶的不稳定是奶酪制作过程的基础。传统上所用的酶提取物是凝乳酶，是从年轻的小牛的第四个胃获得，它包含了一些主要控制牛奶凝固的主要凝乳酶（EC3.4.23.4）。凝乳酶添加到牛奶中后发生的反应可被分为不同的步骤或阶段。第一阶段是酶水解.酪蛋白的酶促反应，形成二肽作为反应产物。是一种N末端为副-.酪蛋白与酪蛋白胶束保持缔合，而C-末端的糖巨肽（GMF,被释放到血清相中的肽。实际上，凝乳酶被酪蛋白胶束表面上的柔性纤维切割，降低了表面电荷作用，去除立体“毛发”层。这导致酪蛋白胶束的不稳定。第二阶段包括胶束聚集，当有足够的.酪蛋白被水解并且如果温度和钙离子的活性足够高，这个阶段就会发生。第二阶段导致凝胶的形成。一些报道称在第三阶段将进一步反应，其中步骤包括如脱水收缩作用，非特异性的蛋白水解作用和结构重组的凝胶网络。牛奶的热处理导致乳清蛋白的变性和变性乳清蛋白与K-酪蛋白在酪蛋白胶束表面之间的相互作用。这个相互作用涉及变性乳清蛋白（特别是B-乳球蛋白）游离筑基和■酪蛋白二硫键之间的筑基二硫键交换反应。K-酪蛋白的二硫键被发现于副-K-酪蛋白区域，K-酪蛋白被凝乳酶水解后，变性乳清蛋白仍与副-K-酪蛋白维持关系。因此，在制作奶酪之前牛奶的热处理是相当关键的，因为他似乎有可能通过向奶酪凝乳中加入乳精蛋白使产量有大幅度的提升。结果，已经有相当多热处理对牛奶奶酪制作性能影响的研究。人们普遍认为，牛奶在经过足够高的温度的热处理后使乳精蛋白变性，导致凝乳酶凝固牛奶的时间增加。然而，对于延缓凝固时间的机制却有相矛盾的观点。大多数报告表明，变性乳清蛋白与L酪蛋白之间的相互作用抑制凝乳酶对K-酪蛋白的作用。然而其他报道显示，加热对凝乳酶反应初级阶段的影响可以忽略不计，他已经表明，凝固过程的第二阶段被变性乳清蛋白的存在或由热引起的钙离子活性减少所抑制。最近一份由vasbinder等人的报告比较了几种分析酶促反应产物的方法。这项研究发现，从热处理的牛奶中分离GMP的水平取决于分离GMP勺方法。可以得出结论，乳清蛋白的变性对酶的活性影响不大，而释放的GMP（或副-R-酪蛋白的形成）在加热和常温的牛奶中是相似的。大多数是研究自然pH下的牛奶进行热处理后对凝乳酶反应的影响。最近的研究表明，在热处理前调整牛奶的pH可以来改变变性乳精蛋白和酪蛋白胶束的反应水平。在低pH（pH约为6.5）下，经过热处理的牛奶中约有70-80%勺乳清蛋白和酪蛋白胶束有关。加热之前随牛奶pH的增加，乳清蛋白作为不沉淀聚合物在血清中的水平逐渐升高，因此，在pH值为6.7时，只有约为30%勺变性乳清蛋白与酪蛋白胶束相关联。牛奶的pH升高时会使酪蛋白胶束发生pH依赖性解离。当牛奶的pH为6.5被加热时，大约有10-15%的.酪蛋白是不沉淀的，并且该水平随pH的增加而增加，因此，在pH为6.7、6.9和7.1时分别有30%,45%和60%是不沉淀的。随着pH的增加到pH大于6.7时，大部分变性乳清蛋白仍在血清中作为不沉淀聚合物存在。通过在加热之前控制乳的pH,有可能产生具有改变成分的酪蛋白胶束，特别是在胶束表面与■酪蛋白相关联的乳精蛋白和K-酪蛋白含量在胶体相和血清相之间的分布。这些变化可能改变与酪蛋白胶束和牛奶的凝胶化特性相关的凝乳酶活性。因此本研究通过检测凝乳酶对k-酪蛋白的作用检验酪蛋白胶束的pH依赖性，热诱导的改变是否影响凝乳反应的初级阶段，第二阶段则通过检测由凝乳酶处理过的牛奶的流变性能。.材料和方法牛奶供应将经过重组低热量的脱脂奶粉，放入经过反渗透连接过滤穿过Milli-Q装置净化的水中，制成10g/100g的实验脱脂牛奶样品。在进一步处理前，该重组后的脱脂乳样品允许在环境温度（约为20C）并轻轻搅拌24h的条件下平衡。叠氮钠（0.01克/100克）被添加到牛奶作为防腐剂。调整pH值、热处理和pH值的再度调整子样本的脱脂牛奶通过缓慢添加1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液并搅拌使pH值调节到范围6.5-7.1。牛奶样品在常温下允许平衡约3h。在不同pH的牛奶样品转移到玻璃瓶中加热，并持续晃动，要求恒温水浴温度控制在90C达到规定时间（30分钟）。热处理后，牛奶样品通过浸泡在有流动的冷水的玻璃瓶中来冷却到室温。加热后的牛奶样品在常温下保存24h然后用1mol/LHCl或1mol/LNaOH再调整到自然pH（pH6.67）。样品保存6h,在使用前要进行定期检查和pH调整。凝乳酶对牛奶样品作用的监测将牛奶样品（2mL置于试管中并塞好案子，然后水浴到30C,使其平衡在该温度下60分钟。凝乳酶（99%勺21®）最初是用水稀释（1:3000）。对于每个牛奶样本，凝乳酶溶液（50mL被加入到每个试管中，并将试管上下振摇。使反应持续进行40分钟。用凝乳酶处理过的牛奶子样品，静置5分钟，使反应终止，然后立即稀释成用于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS的缓冲溶液。样品通过SDS-PAG趾行分析.酪蛋白和副-k-酪蛋白。此外，当凝乳酶加入到该缓冲溶液中时通过SDS-PAG进行分析证实，此时凝乳酶的作用被抑制。流变特性通过使用低幅度的动态振荡进监测用凝乳酶处理的牛乳的流变特性随时间的变化。CarrimedCSL10瑜变仪和圆锥体（4厘米，4°）和排板用于所有的实验中，如前面描述。所有的数据测量都是在30C,0.01应力，0.1Hz频率的条件下进行的。凝乳酶最初用水稀释（1:3）。将稀释的凝乳酶（40mL加入到牛奶样本（1300mL）中并将其轻轻上下震摇，然后将牛奶立刻置于流变仪中并开始实验。每次实验进行60分钟，每隔2.5分钟收集一个试验点。离心分离将牛奶样品（1mL置于体积为1.5mL的小塑料管中。这些样本在型号为5417C的Eppendorf离心机中，像之前描述的那样，在20c时，14000r/min（平均25000克）离心1h。蛋白质的含量和上精液的组成由NATIVE^变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）和SDS-PAG茯丙烯酰胺电泳）测定。凝胶电泳和光密度分析法NATIVE口SDS-PAG眩如前所述进行实验。NATIVE-PAG医口SDS凝胶用分子动力学模型扫描进行密度计算。目的蛋白条纹的整合强度用与密度计相关的Imagequant软件来确定。用离心上精液中的每种蛋白质的数量确定在最初的牛奶样品的比例.结果与讨论凝乳酶水解.酪蛋白的一个特定键，将蛋白质转化为两个肽，副-.酪蛋白和GMP该反应可以通过监测.酪蛋白的损失或肽产物的形成（之一或两者）。经SDS-PAG分析，可以同时监测的酪蛋白底物的损失和副K-酪蛋白产物的形成。图1A将未经处理的脱脂奶、部分水解的脱脂牛奶、完全水解的脱脂奶在该点凝乳酶诱导凝胶首次观察到的分离模式进行比较。R-酪蛋白（峰值3）和副-k-酪蛋白（峰值5）对应的条带表明这些物质与其他乳蛋白组分的分离。K-酪蛋白的损失和副K-酪蛋白的形成清晰而易于检测。K-酪蛋白与副K-酪蛋白的水平之间的关系像预期的那样，呈线性和反比关系（图1B）。这些结果表明SDS一PAGE方法应适合于监测凝乳酶对脱脂乳中k-酪蛋白的作用效果。牛奶样品在90C加热达30分钟，调整pH值从6.5到7.1,然后pH值将重新调整到自然pH值（pH6.67）。子样品进行离心，将上精液通过NATIVE进行分析，以确定变性乳清蛋白的水平，并通过SDS以确定不能沉淀的乳精蛋白和.酪蛋白的水平。除非另有说明，报道中的乳精蛋白对应于a-乳白蛋白和B-乳球蛋白的结合体。在所有样品中，在加热5分钟后约80%勺乳精蛋白变性，在加热30分钟后这将增加到接近100%（图2A）。pH值对此只有很小的影响，无论样品的初始pH值是多少，在任何给定的加热时间样品的乳精蛋白变性水平类似。pH值对变性水平的影响，和先前的报道一致。|与变性相比之下，pH对乳精蛋白与酪蛋白胶束相关联的水平有显着影响（图2A）。在pH值为6.5（•）,加热30分钟后发现大约有70-80%勺变性的乳精蛋白与酪蛋白胶束相关联。较低水平的变性乳清蛋白与胶束随着pH值的增加而相关联，所以，在pH值为6.7（▼八6.9（■）和7.1（♦）时分别有约30%、20%口10%与胶束相关联。低水平的K-酪蛋白（大约20%）,在未加热的牛奶中是不沉淀的。在pH值为6.5加热时，与不加热样品相比不沉淀的K-酪蛋白的水平略有下降。在pH6.7加热时，不沉淀的k-酪蛋白的水平从未加热的样品中的约20%提高到被加热的样品中的30%,而在pH6.9和7.1加热处理后约40%,60%的k-酪蛋白是不沉淀的。加热时间对血清K-酪蛋白在所有pH值水平上的影响不大（图2B）。pH值对乳精蛋白与酪蛋白胶束关系和K-酪蛋白的解离的影响与先前的报道一致。在目前的研究中，牛奶样本在不同pH值下加热。样品中产生的变性乳清蛋白分布在胶体和血清相之间（图2）。在低pH值（pH值6.5）,变性乳清蛋白几乎完全与酪蛋白胶束相关，然而，在较高的pH值，无论是作为不沉淀的乳精蛋白聚集体或相当水平的游离的k-酪蛋白，变性乳清蛋白主要是存在于血清相中。在自然pH值的加热牛奶用凝乳酶处理后（pH6.67）表明，副-.酪蛋白的形成速率和R-酪蛋白的损失速率几乎相同。这清楚地表明，牛奶的热处理，特别是乳精蛋白的变性，无论乳精蛋白是否与酪蛋白胶束或血清中不沉淀聚合物相关，对凝乳反应的初级阶段几乎没有影响。人们普遍认为热处理阻碍了凝乳反应的第二阶段或凝胶阶段。关于延迟凝胶的一个解释是，B-乳球蛋白和副-k-酪蛋白区域形成二硫键，在GM股去除后，这种复合物将继续附着在酪蛋白胶束上，并且这种B-乳球蛋白/副.酪蛋白复合体可以在空间上阻碍凝乳酪蛋白胶束的聚集。不加热和加热的牛奶样品，用凝乳酶在加热和在未加热的牛奶中30C中约40分钟后产生凝胶化。子样本在设定的时间内利用SDS-PAG监测K-酪蛋白的损失和副-K-酪蛋白的形成。请注意，所有的牛奶样品在凝乳酶处理前进行重新调节到pH值为6.67。加入凝乳酶后K-酪蛋白水平随时间降低，副K-酪蛋白水平随时间增加（图3）。无论样品经热处理后的pH值或热处理的持续时间如何，所有加热样品中k-酪蛋白的损失速率和副k-酪蛋白的形成速率都和那些没有加热的样本类似（图3）。样品之间的微小变化可能是加入凝乳酶时样品问pH值的微小变化，或是加入凝乳酶的实验误差，或是通过SDS-PAG由法测定牛奶样本中K-酪蛋白和副K-酪蛋白的浓度。K-酪蛋白和副K-酪蛋白在所有未加热的牛奶样品中与那些所有加热牛奶样品中相比平均含量示于图3Bo这些结果清楚地表明在不加热和加热的牛奶样品之间K-酪蛋白的减少和副-K-酪蛋白的形成几乎没有差别。检测的结果在图2和图3中清楚地表明，在经过热处理的牛奶，包括乳精蛋白的变性和它们与血清或胶体组分发生的后续反应，在脱脂乳中凝乳酶对K-酪蛋白的反应在初级阶段仅有很小的影响。|通过动态振荡流变学监测不加热和加热的牛奶样品的凝胶化。在所有的牛奶样品中，在反应开始前pH将再调整为自然pH值（pH6.67）,使所述的流变学性能是直接可比的。在流变学实验中，在5分钟后，在未加热的牛奶中凝乳酶浓度增加至诱导凝胶的水平，并且实验允许进行总时间为60分钟。不加热和加热牛奶样品的凝胶曲线显示在图4,表1总结了关键的凝胶化参数。在所有的情况下，G-时间曲线具有相似的形状，在初始时期，G是非常低的，其次的一个时期，G增加。除非另有说明，最终的G是指凝胶化1小时后测得的G值，而凝胶化时间是指在该样品具有G>1Pa的时间。无论凝乳酶处理前的pH调整步骤如何，对于未加热的牛奶样品（图4A,表1）来说凝胶化时间和最终的G值非常相似。这表明，从自然pH值（pH值6.67）的pH调节至pH6.5-7.1,并随后调整回自然pH值对奶的凝乳酶处理的第一和第二阶段的影响不大。经过热处理的牛奶，凝胶化时间显著增加，最后的G显著下降（图4B和4C,表1）。凝胶化时间的从未加热的牛奶的约6分钟增加到加热30分钟的样本的超过20分钟，和G约为90Pa的未加热的牛奶相比加热样本最终的G只有约5-15Pa（图4,表1）。虽然加热5分钟比那些加热较长时间的样本保持稍高的G值稍高和稍短的凝胶化时间，但是在所有加热时间从5到30分钟（表1）的样本中都看到了类似的影响。虽然样品在pH值6.7时的最终G值比其他pH值略高，pH值在热处理凝胶化时间或最终G值几乎没有影响（图4,表1）。这些结果表明牛奶的热处理显著影响凝乳酶对牛奶的凝胶化作用。然而，研究结果还表明，在加热后的pH值，和因此变性的乳精蛋白和酪蛋白在胶束和血清相的分布，不影响所有加热样品的最后的凝胶作用是类似的。在文献中，关于凝乳反应的初级阶段（酶法）是否受到热处理的影响有矛盾的报告。许多研究表明牛奶加热时初级阶段被延迟，并认为在酪蛋白胶束表面变性乳清蛋白和k-酪蛋白之间的相互作用抑制凝乳酶接近R-酪蛋白的敏感键。然而，其他的研究发现，加热对凝乳反应的初级阶段有很小或没有影响。这些研究表明，牛奶的热处理降低了酪蛋白胶束聚集的能力，并且这种影响可能是由于空间位阻或增加的电荷作为乳精蛋白与酪蛋白胶束缔合的结果。最近的一项由Vasbinder等人的研究（2003）表明，该实验方法用于通过测定的GM冰平的酶促反应程度，以获得变量结果。这种变化主要是由于从GMPM淀其他牛奶蛋白质所用的酸的类型和浓度。这种变化可能引起初级阶段的明显迟缓。当采用的最可靠的技术时，只能观察到加热在凝乳反应的初级阶段只有很小的影响。此外，由Vasbinder等人（2003年）的研究表明热沉淀磷酸钙对凝乳反应的初级阶段影响不大，同凝乳酶对不加热和加热无乳清蛋白的牛奶的影响几乎相同。在当前的研究中，热处理前牛奶的pH值调整允许操纵的变性的乳精蛋白和k-酪蛋白在血清和胶体相之间的分布（图2）。在所有情况下，牛奶中凝乳酶的凝胶化由于热处理被延缓，且观察到无论变性乳精蛋白是否主要在血清相或与酪蛋白微胶粒结合在凝胶化行为上几乎没有差别（图4）。这是与vanHooydonketal.（1987年）和辛格等人（1988年），达成了广泛共识，因为两项研究发现，无论加热时的pH值如何，加热都增加了牛奶的凝乳酶凝固时间。这些结果表明凝胶的延迟是不大可能是由于通过变性乳清蛋白依附胶束表面的酪蛋白空间位阻稳定。选定的凝乳酶处理的牛奶离心后分析他们的上精液中的蛋白质成分表明，无论加热时pH如何，用凝乳酶处理后，不沉淀的变性乳清蛋白水平和（副）K-酪蛋白与未经处理的牛奶相比明显减少（结果未显示）。这表明不能沉淀的变性乳清蛋白和（副-）K-酪蛋白在凝乳酶反应中与聚合酪蛋白胶束相关联。因此看来变性乳精蛋白，不论是否与K-酪蛋白在胶束表面或血清相中作为不沉淀聚合物（和.酪蛋白），都可以抑制或干扰聚合过程，减缓聚集速率，因此延缓凝胶化过程形成弱凝胶。这是通过Vasbinder等人（2003）使用扩散波谱仪（DWS检验凝乳期间脱脂乳的粒径变化的研究的支持的。DWST以提供聚合反应导致的凝胶化的早期阶段的信息。结果表明，聚合反应开始时在加热的牛奶和未加热的牛奶中是相似的，这表明反应的初级阶段是相对不受热处理的影响。然而，据观察尤其是在加热温度高于约75c时，加热过的牛奶中后续的聚集率明显缓慢。这些结果证实了凝乳酶处理在未加热的牛奶和加热过的牛奶中对酪蛋白胶束造成同样的不稳定；然而，加热过程减速了随后的酪蛋白胶束聚集。Vasbinder等人（2003）得出结论，在文献中提出的支持假说之一，加热牛奶系统通过凝乳酶的凝胶化延迟完全归因于变性乳清蛋白与酪蛋白胶束的关联。|然而，在我们的研究中，无论已变性的乳精蛋白是否与酪蛋白胶束或在血清相相关联，都能观察到凝胶化的延迟（图4）0这表明凝胶化过程的延迟不是特别由于乳清蛋白与.酪蛋白在酪蛋白胶束表面上相关联的空间位阻效应。可以看出，无论是否在酪蛋白胶束或血清相中与R-酪蛋白作为复合物，变性乳清蛋白都干扰聚合过程，因此增加凝胶化的时间。无论在加热时的pH值如何，K-酪蛋白转为副-…酪蛋白和GMP在加热过的牛奶和未加热的牛奶中是类似的（图3和4）,和变性乳清蛋白相关的疏水的副-k-酪蛋白被纳入到由凝乳酶处理的酪蛋白胶束形成的聚集体中。这些副K-酪蛋白/变性乳清蛋白结合的复合物可能进一步抑制聚集，因此延缓胶凝。致谢作者要感谢MikeBoland有益的探讨和ClaireWoodhall校对手稿。该基金会的研究,科学和技术，合同号DRIX0201,提供了财政支持。亚历山大・冯・洪堡基

金会的研究员支持了作者Anema3000-1500-1000-3000-1500-1000-2030td^ratondistance{mm)图1(A)用凝乳酶处理脱脂牛奶从0到40分钟的电泳痕迹峰1为as酪蛋白；峰2为B酪蛋白；峰3为.酪蛋白；峰4为B-乳球蛋白；峰5为副-.酪蛋白；峰6为丫-酪蛋白Intensity(arbitraryunits)强度(任意单位)Migrationdistance(mm)迁移距离(mm)

icosemofinitiallevel)图1(B)用凝乳酶处理过的脱脂牛奶中K-酪蛋白与副-K-酪蛋白之间的关系。在用凝乳酶处理前，将牛奶样品的pH值调整到6.5(•),6.7(?),pH6.9(▼)和7.1(▽),然后牛奶重新调整回自然pH值(pH6.67)0R-酪蛋白(％初始水平)100306040200.酪蛋白(％最高水平)1OO60-0-O51015202530Heatingtime（min）图2（A）脱脂乳90c加热30分钟后自然的（填充符号）和不能沉淀的（打开符号）乳清蛋白（a-乳清蛋白和B-乳球蛋白结合）含量（B）脱脂乳90c加热30分钟后不能沉淀的K-酪蛋白（K-酪蛋白）水平。在离心和分析之前。将加热和未加热的脱脂牛奶的pH分别调整到6.5（•,?）,6.7（▼,▽）,6.9（■,口）和7.1（♦,◊）然后重新调整到自然pH值（6