蛋白质工程制药

04蛋白质工程制药S1蛋白质工程制药概述S2蛋白质工程的基本技术S3蛋白质工程制药实例S1蛋白质工程制药概述从基因工程药物到蛋白质工程药物蛋白质工程的诞生、概念蛋白质工程的基本过程蛋白质分子设计基因工程药物蛋白质工程药物1982年第一个基因工程药物：重组人胰岛素重组蛋白存在问题：1、稳定性差：体内半衰期短2、药理活性不够强：使用剂量偏大3、毒副作用大4、生产工艺复杂蛋白质工程药物蛋白质工程的诞生1970S末，Smith等人建立了寡核苷酸点突变改变DNA序列的方法1982年，一些实验室用此技术来改造蛋白质分子，研究蛋白质的功能1983年，Ulmer发表了题为“ProteinEngineering”的专论目前已应用于医药领域，并有多种产品上市已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂已上市的蛋白质工程药物1、体内半衰期短2、药理活性不够强3、毒副作用大4、生产工艺复杂蛋白质工程的概念蛋白质工程（ProteinEngineering）(第二代基因工程)是以蛋白质结构功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计以及DNA重组技术，把天然的蛋白质改造成合乎人类需要的新的突变蛋白质(mutein)的一项技术。蛋白质工程的概念内涵：1、从DNA水平改变基因，改造蛋白质2、一个或多个氨基酸残基结构域全新蛋白质3、有目的地改造，获得期望功能——强调分子设计4、结合DNA重组技术从不同尺度改造蛋白质工程的基本过程蛋白质工工程的基基本过程程1、分离离纯化所所需改造造的目的的蛋白2、对蛋蛋白进行行氨基酸酸序列测测定、X射线晶晶体衍射射分析、、核磁共共振分析析等———结构和和功能信信息3、根据据结构和和功能信信息、生生物信息息学信息息，运用用蛋白质质分子预预测技术术提出蛋蛋白质设设计方案案4、分离离克隆该该蛋白编编码基因因，并进进行突变变改造5、插入入适当的的载体表表达6、分离离纯化表表达产物物，检测测其生物物学功能能实验设计实验蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略蛋白质分分子设计计蛋白质分分子设计计的三个个基本条条件：1、蛋白白质分子子的基本本知识：：理化性性质、结结构与功功能、构构象规律律2、对具具体改造造的蛋白白质分子子必须有有一个系系统、全全面和深深入的了了解3、分子子设计的的基本工工具：高高性能的的计算机机硬件、、功能齐齐全的计计算机软软件——只有有在此基基础上，，才能应应用蛋白白质分子子预测技技术，提提出合理理的设计计方案三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略蛋白质分分子设计计蛋白质分分子设计计的分类类1、小范范围改造造：对已知结结构的蛋蛋白质进进行少数数几个残残基的替替换、部部分片段段的缺失失，改善善蛋白质质的性质质和功能能。2、较大大程度的的改造：：根据需求求对来源源于不同同蛋白质质的结构构域进行行拼接组组装，或或在蛋白白质分子子中进行行大范围围肽链替替换、结结构域替替换，获获得多功功能复合合体。3、蛋白白质从头头设计（denovoproteindesign）三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略概念：从蛋白质质分子一一级结构构出发，，设计制制造自然然界中不不存在的的全新蛋白白，使之具具有特定定的空间间结构和和预期的的生物功功能。1、需要要扎实的的理论基基础2、在分子设计计与试验验证证之间交互互进行蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略PDA循循环（ProteinDesignAutomation））1、设计模拟实验分析2、不断断循环：：一步步步的修正正最终获获得成功功蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计计算机模拟基因构建突变蛋白质产物功能分析三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略蛋白质从从头合成成的范例例凋亡诱导导肽：CNGRC-GGn-（KLAKLAK）2KLAKLAK：可形成典典型的两两亲-螺旋结结构，进进入细胞胞后，可可破坏线线粒体膜膜引起细细胞凋亡亡NGR：：与新生血血管的内内皮细胞胞特异结结合，起起到靶向向弹头的的作用蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略利用NGR为弹头，，将KLALAK肽特异地地导向肿肿瘤部位位的新血血管内皮皮细胞，，通过抑抑制新血血管的生生成，从从而抑制制肿瘤的的形成，，且对其其他细胞胞没有明明显的毒毒性。300mol/L3mol/L蛋白质从从头合成成的范例例凋亡诱导导肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略蛋白质从从头合成成的范例例凋亡诱导导肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计考虑的其其他因素素1、Gly-Gly接接头：防止两功功能部位位的立体体结构相相互影响响。2、L-型氨基基酸（D-型））：防止蛋白白酶的降降解三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略蛋白质从从头合成成的范例例凋亡诱导导肽：CNGRC-GGn-（（KLAKLAK）2蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计实验结果果1、特异异地被激激活的新新生血管管内皮细细胞内吞吞，引起起凋亡2、在小小鼠肿瘤瘤模型中中，可抑抑制肿瘤瘤的生长长，明显显延长治治疗组小小鼠的存存活时间间3、对健健康小鼠鼠超剂量量使用时时，没有有毒副作作用的产产生三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略1、顺式式思维理理性化设设计——合理理化设计计2、基于于各种功功能筛选选平台的的非理性性逆向改改造策略略——非理理性的体体外进化化3、两种种策略的的结合蛋白质分分子设计计的策略略蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略1、顺式思维维理性化化设计——合理理化设计计基于现有有知识信信息：蛋蛋白质的的结构与与功能；；因此，受受到已有有认识水水平的制制约。蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计的策略略蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略2、基于各种种功能筛筛选平台台的非理理性逆向向改造策策略——非理理性的体体外进化化1）构建建包含众众多突变变蛋白的的文库：：随机突变变、DNA改组组等2）筛选选文库：：从功能入入手进行行筛选所所需要的的蛋白3）进行行蛋白质质基本结结构、序序列信息息的分析析蛋白质分分子设计计的策略略蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略3、两种种策略的的结合非理性的的体外进进化：弥补合理理性化设设计应用用中的局局限性，，并且迅迅速得到到大量有有功能的的目标分分子，通通过分析析积累所所需的蛋蛋白质结结构与功功能相关关信息合理化设设计：对非理性性筛选出出的候选选分子进进行合理理化的分分子修正正，使之之进一步步符合实实际需求求蛋白质分分子设计计的策略略蛋白质分分子设计计三个基本本条件蛋白质分子设计计的分类类蛋白质从从头设计计蛋白质分分子设计计策略S2蛋蛋白质工工程的基基本技术术定点突变技技术随机突变技技术1、寡核苷苷酸引物介介导的定点突变变2、PCR介导的定定点突变3、盒式突突变4、易错PCR5、DNA改组技术术易错PCR连续易错PCR（sequentialerror-pronePCR））：经以上上一次PCR突变的的基因很难难获得满意意的结果，，于是将前前一轮PCR扩增得得到的有用用突变基因因作为下一一轮PCR的模板，，每次获得得的突变累累积起来，，产生重要要的有益突突变。可遗传的变变化只发生生在单一分分子内部，，属于无性进化（asexualevolution）易错PCR（error-pronePCR））：利用缺缺乏修复功功能的Taq酶，并并设置容易易引起出错错的PCR反应条件件，在扩增增目的基因因的同时引引入碱基错错配，导致致目的基因因随机突变变——完全随随机化易错PCR优点：简便易行不足：突变文库规规模有限，，有益突变变少，后续续筛选工作作费力、耗耗时，只适适用于较小小的基因片片段（<800bp）DNA改组组技术DNA改组组（DNAshuffling），又叫有性性PCR（sexual-PCR）等，将单一一基因随机片段化化，这些片段段自配对PCR扩增增，由于易错PCR而引入大量量随机突变变，并在多多次循环中中重组，使使基因在体体外迅速进进化，从中中筛选到有有益重组。。优点：体外定向进进化，快速速，高效（（蛋白质、、酶、抗体体等）DNA改组组技术基因家族改改组DNA改组组的不足：：从单一基因出出发，得到的随随机点突变变率很低，，且有益突突变的积累累相对缓慢慢在自然界中中，不同物物种同源基基因本身就就是具有非非常丰富的的变异，如如果加以利利用，就可可以大大地地加速基因因在体外的的进化速度度——基因家族改改组（DNAfamilyshuffling）基因家族改改组S3蛋白白质工程制制药实例蛋白质工程程在新药研研究中的应应用胰岛素的蛋蛋白质工程程研究蛋白质工程程在新药研研究中的应应用1、提高药药效活性2、提高靶靶向性3、提高稳稳定性、改改善药代动动力学特性性4、提高工工业生产效效率5、降低蛋蛋白药物引引起的免疫疫反应6、获得具具有新功能能的蛋白分分子7、获得特特定蛋白的的拮抗物或或类似物8、模拟原原型蛋白分分子结构开开发小分子子模拟肽类类药物胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药1、糖尿病病I型糖尿病病：II型糖尿尿病：胰岛素抵抗抗（IR））为主，伴伴胰岛素相相对缺乏；；以及胰岛岛素分泌缺缺陷，伴IR由于细胞介介导的胰岛岛B细胞自自身免疫性性破坏，导导致胰岛素素绝对缺乏乏胰岛素的蛋蛋白质工程程研究闭环系统：自调控竞争解吸附作用胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药1、糖尿病病中国4000万，全全球1.5亿患者急性并发症症：酮症酸中毒毒（I，昏昏迷、死亡亡）非酮症高渗渗性昏迷（（II）低血糖反应应（心慌、、手抖、饥饥饿、出冷冷汗）胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药1、糖尿病病中国4000万，全全球1.5亿患者慢性并发症症（可遍及全全身各重要要器官）：：心血管疾病病、慢性肾肾病视网膜病变变、神经病病变胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药2、胰岛素素胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药2、胰岛素素胰岛素从猪猪、牛等动动物的胰腺腺中提取，，100Kg胰腺只能提提取4-5g的胰岛素，，其产量之之低和价格格之高可想想而知。胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药2、胰岛素素1982年年，重组人人胰岛素上上市——第一个个基因工程程药物！第一个完成成序列测定定的蛋白质质（1958年年）第一个人工工合成的蛋蛋白质（1965年年）Sanger

胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素是治治疗糖尿病病的特效药药2、胰岛素素每100L发酵液就能能产生5g胰岛素，使使其价格降降低了30%-50%!提取4-5g胰岛素需要要100Kg胰腺胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素在临临床应用时时存在的问问题1、在正常常生理情况况下胰岛素素在体内是是不断地分分泌的，但但不能连续续不断地注注射胰岛素素2、皮下注注射胰岛素素时，吸收收得也很慢慢，注射后1.5-2小小时，体内内胰岛素水水平还未能能达到高峰峰，这就会会导致高血血糖；3-5小时之之后胰岛素素水平仍在在继续上升升，这又会会导致低血血糖胰岛素的蛋蛋白质工程程研究胰岛素在临临床应用时时存在的问问题3、糖尿病病病人一般般需要每日日四次注射射给药胰岛素的蛋白白质工程研究究蛋白质工程技技术对胰岛素素的改造1970S初初，英国的Hodgkin等、我国国的梁栋材等等，分别用X-射线晶体体衍射法进行行了高分辨率率的三维结构构分析，胰岛岛素的蛋白质质工程研究奠奠定了基础胰岛素的蛋白白质工程研究究蛋白质工程技技术对胰岛素素的改造1、速效胰岛岛素（可快速吸收收的单体胰岛岛素）2、长效胰岛岛素3、高效胰岛岛素（与受体亲和和力增加的胰胰岛素突变体体）速效胰岛素胰岛素吸收慢慢的原因：二聚体、六聚聚体速效胰岛素3D分析发现现：多聚体的的形成与B8、B9、、B12、B13、B16、B23-B28的氨基酸残基基有关用蛋白质工程程方法在多聚聚体接触面上上某些氨基酸酸残基换上带带负电的氨基基酸残基B链Ser9Asp（-）），Thr27Glu（-））由于相同电荷荷互斥，减少少多聚体形成成，