药物遗传毒性和致癌性现状和动向

药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向2022/12/251常艳国家上海新药安全评价研究中心药物遗传毒性评价的指导原则1遗传毒性试验方法的研究2药物致癌性评价的概要3传统和替代致癌试验的研究434主要内容

遗传毒性评价的指导原则

SFDA-中国国家食品药品监督管理局

ICH-人用药物注册技术规定国际协调组织

OECD-经济合作发展组织

EMEA-欧洲药品评价局

USFDA-美国药监局

USEPA-美国环境保护署

MHLW-日本厚生劳动省其他世界性的政府法规部门

药物研发监管的主要药政实体OECD、EPA可供参考的遗传毒性指导原则

遗传毒性试验的指导原则

SFDA

体外：2项试验

•细菌回复突变试验（Ames）——Required

•染色体畸变试验（CA）

OR

•小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验（MLA）

体内：1项试验

•微核试验（MN）——Required

《药物遗传毒性研究技术指导原则》ZHGPT2-1,2007等同于ICHS2BICH

S2A+S2BFDA-RedbookRedbook2000:IV.C.1Short-TermTestsforGeneticToxicityJuly2007Redbook2000:IV.C.1.aBacterialReverseMutationTest

Redbook2000:IV.C.1.bInvitroMammalianChromosomalAberrationTestRedbook2000:IV.C.1.cMouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayRedbook2000:IV.C.1.dMammalianErythrocyteMicronucleusTestFDA-CDERFDA-CDEREMEAEMEAEMEAStep2Step1Step3Step42006200720082009~20112006.06ICHSC同意意启启动动修修订订工工作作2006.10ICHEWG讨论论筹筹划划修修订订方方法法2007.05对修修订订内内容容达达成成一一致致意意见见，，开开始始起起草草S2(R1)2007.10完成成起起草草的的S2(R1)2008.02签署署S2(R1)，完完成成step22008.06审议议意意见见，，回回答答公公共共注注释释2008.11未按按期期开开会会（（未未获获得得彗彗星星试试验验数数据据））2009.06体内内试试验验单单次次和和重重复复给给药药方方案案都都接接受受FDA对取消消体体外外细细胞胞试试验验或或降降低低最最高高浓浓度度和和细细胞胞毒毒性性提出出异异议议2011.11S2(R1)正式式颁颁布布遗传传毒毒性性标标准准组组合合试试验验的的修修订订2009~2011ICHS2A+S2B=S2(R1)S2R1的修修订订宗宗旨旨：：减少少体体外外哺哺乳乳动动物物细细胞胞试试验验的的假假阳阳性性动物物试试验验3R原则则（（替替代代、、减减少少和和优优化化））Invivo：建议议整整合合入入重重复复给给药药毒毒性性实实验验中中每次次实实验验不不必必使使用用平平行行的的阳阳性性对对照照应用用流流式式细细胞胞仪仪检检测测ICHS2A+S2B=S2(R1)遗传传毒毒性性标标准准组组合合试试验验的的修修订订S2BS2R1选择一选择二细菌回复突变试验（withrepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA10mMCellgrowth:50%/RTG:80%体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA/MN

1mM

≤50%/

≥80%无体外哺乳动物细胞试验体内微核试验（单独一项且是急性毒性试验）体内微核试验（整合至一般毒理试验中）一项体内微核试验+一项体内不同检测终点/组织试验（肝Comet试验）（整合至一般毒理试验中或联合在同一个试验）整合合试试验验的的最最高高剂剂量量和和暴暴露露ICHS2(R1)修订订小小结结S2A和S2B整合合入入一一个个指指导导原原则则中中；；提供供可可选选择择的的遗遗传传毒毒性性试试验验组组合合；；减少少体外外哺哺乳乳动动物物细细胞胞试试验验不不相相关关的的阳阳性性；；体内遗传毒性性试验可以整合入重复给药毒毒性试验中；；无需每一项体体内试验都设设同步的阳性性对照；体外细菌突变变试验无需重重复试验。ICHS2(R1)PfuhlerS.etal.2009药物遗传毒性性评价的指导导原则1遗传毒性试验验方法的研究究2药物致癌性评评价的概要3传统和替代致致癌试验的研研究434主要内容遗传毒性传统统试验方法31细菌回复突变变试验（Ames试验）人工诱变的突突变株在组/色氨酸操纵子子中有一个突突变，突变的的菌株必须依依赖外源性组组/色氨酸才能生生长，而在无无组/色氨酸的选择择性培养基上上不能存活，，致突变物可可使其基因发发生回复突变变，使它在缺缺乏组/色氨酸的培养养基上也能生生长。野生型（原养型）突变型（缺陷型）Ames试验测试系统：细细菌鼠伤寒沙门氏氏菌：组氨酸酸营养缺陷型型埃希氏大肠杆杆菌：色氨酸酸营养缺陷型型菌株特性鉴定定菌株组/色氨酸突变缺失可检测的突变类型修复LPSVIT质粒TA1535G46urvB-rfa-

bio----碱基置换TA1537C3076urvB-rfa-bio----移码TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移码TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移码TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101碱基置换TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101碱基置换WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101碱基置换Ames试验验Ames试验验浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；；受试物至少五五个剂量组；；阳性对照组；；Ames试验验方法平板掺入法：：-0.1mL受试菌液；-0.1mL受试物、溶剂剂对照或阳性性物溶液；-0.5mL磷酸钠缓冲液液/S9混合液；-2.0mL融溶的顶层琼琼脂（0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－组胺酸））混合后，铺于于底层琼脂上上，室温凝固固。Ames试验验预培养法-将下列物质在在冰浴上混合合：0.5mLS9混合液或0.5mL磷酸缓冲液0.1mL过夜培养菌液液（大约10^8菌量））0.01mL受试物溶液（（或对照，溶溶剂和阳性对对照物溶液））-将该混合液在在37℃下培养20分钟（水浴中中）-然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－组胺酸的融溶溶顶层培养基基，铺至基础础培养琼脂表表面（V-B培养基E），在室温下凝固。。Ames试验验代谢活化系统统大鼠肝S9混合液S9制备方法：取取5只雄性大鼠，，处死大鼠的的前5天单次腹腔注注射给予500mg/kg的Aroclor1254。处死，放血血，无菌取肝肝组织，匀浆浆，经9000g离心10分钟后的上清清液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，冷冻保存存在-70℃～-85℃。Ames试验验结果观察和判判定计数突变菌落落数－致突变变性观察背景菌斑斑－毒性判断是否具有有致突变性Ames试验假设的证明无组氨酸的VB平皿7个克隆来自0对照平皿划线7个克隆来自1000ug/皿处理组划线全部生长:克隆为组氨酸酸回复突变克隆隆无生长：克隆不是组氨酸回复突变克隆隆Ames试验—案例1测试系统哺乳动物细胞胞：CHL,CHO人外周血淋巴巴细胞细胞核型遗传毒性试验验的技术要点点32染色体畸变试试验(CA)剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；；受试物至少三三个剂量组；；阳性对照组；；染色体畸变试试验方法细胞复苏、培培养；受试物处理；；加入秋水仙素素，使细胞停停止于分裂中中期；收获细胞，滴滴片空气干燥，染染色染色体畸变试试验包括代谢活化化和非代谢活活化条件在处理后6和24小时收获细胞胞代谢活化条件件下，受试物物处理时间为为3小时染色体畸变试试验处理条件读片分析有丝分裂指数数－毒性染色体结构畸畸变染色体数目畸畸变染色体畸变试试验试验系统小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-细胞既能够检测点点突变，也能能够检测出大大的染色体损损伤自发突变率高高，需要定期期清除自发突突变。33小鼠淋巴瘤细细胞试验（MLA）遗传毒性传统统试验方法ThymidineKinase(TK):233aminoacidsCodedbytheautosomaltkgenetkgene:Situatedatthedistalendoftheq-armofchromosome11(mouse)orchromosome17(human)Sizeoftkgene:11kbwith5intronstklocusmutation:tk+tk-allelecausedbyTGtransversionatposition489小鼠淋巴瘤细细胞试验（MLA）基本原理Targetcell：MouselymphomaL5178Ytk+/-3.7.2Ccellline(D.Clive&P.Voytek.MutatRes,1977)L5178Y-3cellline（tk+/+）EMStreatmentL5178Y-3.7.2cellline（tk+/-）L5178Y-3.7cellline（tk-/-）Spontaneousreversemutation(selectedbyTHMGmedium)MLA基本原理TK+/-cells(TFTsensitive&THMGresistant)TK-/-cells(TFTresistant&THMGsensitive)MutagentreatmentTK+/-cells(L5178Y,TK6,WTK1)treatedbychemicals,andthenselectedbyTFT(trifluorothymidine)Thegrowingcolony——TFTresistant(TK-/-)mutantMLA基本原原理培养基基不含马马血清清的RPMI1640培养基基含10%马血清清的RPMI1640培养基基含20%马血清清的RPMI1640培养基基小鼠淋淋巴瘤瘤细胞胞试验验（MLA）受试物物处理理时间间TK基因突突变试试验中中，要要使用用短时时处理理(3～4小时)方式。。但张张立实实和Honma等的研研究表表明，，使用用长时时间(24或48小时)处理可可显著著提高高MLA对某些些染色色体断断裂剂剂和纺纺锤体体毒物物的检检出率率。小鼠淋淋巴瘤瘤细胞胞试验验（MLA）突变选选择剂剂在MLA中最初初使用用5-溴脱氧氧尿苷苷（BUdR）作为为突变变选择择剂，，后来来改用用三氟胸胸苷（TFT）。二二者均均为胸胸苷类类似物物，都都能被被胸苷苷激酶酶磷酸酸化，，其磷磷酸化化产物物掺入入DNA可导致致tk+/-细胞死死亡。。但TFT的作用用比BUdR更迅速速，TFT在一个个细胞胞世代代即可可阻滞滞tk+/-细胞，，因此此TFT选择平平板背背景清清晰；；而BUdR则需要要经历历数个个细胞胞世代代才能能完全全阻滞滞tk+/-细胞，，故可可产生生分散散的微微小集集落（（microcolony），形成成特征性性的背景景阴影（（backgroundhaze）。因此此，现TFT已基本取取代了BUdR，成为TK基因突变变试验的的常规选选择剂。。小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）基本方法法软琼脂平平皿法（（softagarmethod）在美国国使用较较多。在在平皿中中生长的的抗性突突变细胞胞集落呈呈近似正正态分布布，根据据实验结结果可计计算克隆隆效率（（cloningefficiency，CE）和突变变率（mutationfrequency，MF）等指标标。微孔平板板（microwellmethod）（即即96孔培养板板）法在在欧洲使使用较多多。在微微孔中生生长的抗抗性突变变细胞集集落呈Poisson分布，根根据实验验结果可可计算接接种效率率（platingefficiency，PE）和突变变率等指指标。小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）CellsExpression(2d)Chemicaltreatment(3hor24h)PlatingforPE0PlatingforPE2PlatingforTFTrIncubation(12d)ColonycountingandcalculationIncubation(12d)小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）突变集落落在TK基因突变变试验中中，经过过TFT选择后长长出的抗抗性细胞胞集落（（即tk-/-突变体））可分为为两种类类型，即即大集落落（λ集落）和和小集落落（σ集落）。。微孔平板板法：大大集落≥≥微孔直直径的1/4小集落＜＜微孔直直径的1/4软琼脂平平皿法：：大集落落直径≥≥0.6mm小集落直直径＜0.6mm大集落呈呈弥散性性生长，，其密度度低；小小集落呈呈集中性性生长，，其密度度高。小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）一般认为为大、小小集落突突变体是是由于基基因损伤伤的范围围和程度度不同所所致。大集落突变体的的基因损损伤多仅仅局限于于tk位点（即即小范围围的点突变）；而小集落突变体是是由较大范范围的染色体改改变（染色体体断裂、、缺失、、重组或或分离异异常等））所致。。这是TK基因突变变试验能能够检出出基因突突变和染染色体畸畸变两类类终点，，并能在在一定程程度上对对二者加以以区分的的重要机机理。但但关于两两类集落落产生的的确切机机制及其其意义，，还有待待进一步的研研究。小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）小鼠淋巴巴瘤细胞胞试验（（MLA）试验结果果的判定定各处理组组的MF值呈浓度依赖赖性升高高，判定为为阳性；；MF值≥阴性对对照值+126，判定为阳阳性。（（微孔法法中的GEF=99+27=126）阳性对照照参考值值其一，阳阳性对照照组总诱诱导率IMF至少≥300××10-6，其中小小克隆IMF至少≥120××10-6其二，小小克隆IMF至少≥150××10-6满足上述述标准之之一，并并且阳性性对照相相对总生生长率（RTG）≥10%结果评判判原标准组组合中唯唯一一项项体内试试验采用大鼠鼠或小鼠鼠（6～10周）分析骨髓髓中嗜多多染红细细胞中的的微核，，嗜多染染红细胞胞是红细细胞成熟熟的一个个阶段，，主核已已排出，，容易观观察微核核遗传毒性性试验的的技术要要点34体内微核核试验微核形成成体内微核核试验剂量设置置阴性对照照组/溶剂对照照组；受试物至至少三个个剂量组组；阳性对照照组；（S2R1建建议无需需每次试试验均设设阳性对对照）体内微核核试验试验方法法给药－临临床拟用用途径；；预试验中中测定时时相点，，确定正正式试验验的采样样时间；；收集骨髓髓细胞，，离心，，涂片，，干燥，，固定，，染色体内微核核试验读片计数PCE/NCE的比例－－反映毒毒性计数含微微核PCE的细胞百百分率；；体内微核核试验S2R1推荐的的试验方方法测试系统统哺乳动物物细胞：：CHL,CHO,V79胞质分裂裂组织剂剂——松胞素B（Cyt-B）通过阻止止微丝聚聚合而破破坏胞质质分裂所所需的微微丝环，，从而达达到阻滞滞胞浆分分裂又不不影响胞胞核分裂裂的目的的。体外双核核微核浓度设置置阴性对照照组/溶剂对照照组；受试物至至少三个个浓度组组阳性对照照组；体外双核核微核试试验方法细胞复苏苏、培养养；受试物处处理；收获细胞胞，滴片片空气干燥燥，染色色(+CytB)(+CytB)体外双核核微核试试验读片分析析胞浆分裂裂阻断增增值指数数（CBPI）－细胞毒毒性双核微核核率（1000～2000个双核））体外双核核微核试试验给药染毒毒采集血样样（～100l）－80℃至少固定定3d离心(300g,10min,4℃)buffer洗脱孵育标记记FCM检测4℃,30minRT/37℃,30minS2R1推荐的的试验方方法FCM体内微核核自动化化检测FCM体体内微核核自动化化检测甲醇（99.8%）－80℃至少固定定3dAnti-CD71-FITCAnti-CD61-PEPIRNase生物标准准品—伯氏疟原原虫感染染的红细细胞模仿仿MN调节PMT电压调节补偿偿血样固定定标记染色色质控FCM体体内微核核自动化化检测图1利用CD71-(-)样品和疟疟原虫生生物标准准品建立立FCM检测小鼠鼠外周血血MN的模板。。ABCDFCM与常规显显微镜检检MN结果相关关性良好好，同时时获得3个指标：：%RET、%MN-RET和%MN-NCE；染色体断断裂剂和和非整倍倍体诱导导剂都能能检测出出来；重复性好好，同样样的受试试物剂量量在本实实验室和和其他已已知报道道的实验验室结果果相当；；排除除一一些些假假阳阳性性因因素素的的干干扰扰:使用用RNase，排排除除聚集集RNA的干干扰扰；；使用用CD61抗体体，，排排除除血小小板板的干干扰扰；；使用用CD71抗体体特特异异标标记记RET，排排除除常常规规Giemsa同染染的的嗜碱碱性性小小体体等干干扰扰。。三色色FCM自动动化化MN检测测系系统统符符合合IWGT的标标准准FCM体体内内微微核核自自动动化化检检测测基本本满满足足分分子子生生物物学学和和组组合合化化学学的的大大量量候候选选化化合合物物的的毒毒性性筛筛选选快速速、、高高通通量量灵敏敏、、客客观观机制制研研究究无种种属属选选择择性性三色色FCMvs显微微镜镜检检既可可以以检检出出染染色色体体断断裂裂剂剂，，也也可可以以检检出出非非整整倍倍体体诱诱导导剂剂；；研究究量量效效关关系系和和毒毒性性阈阈值值。。啮齿齿类类骨骨髓髓和和外外周周血血；；其其他他骨骨髓髓样样品品不不易易获获取取且且脾脾脏脏亦亦有有消消除除MN-RBC作用用的的物物种种的的MN检测测（（狗狗、、灵灵长长类类等等））FCM亦能能得得出出MN大小小和和分分布布的的资资料料，，即即PI相关关的的荧荧光光数数值值的的大大小小（（如如DNA含量量））FCM体体内内微微核核自自动动化化检检测测S2R1推推荐荐的的试试验验方方法法体内内Comet试验验体内内Comet试试验验遗传传毒毒性性新新方方法法的的研研究究体内内Pig-a基基因因突突变变试试验验Pig-a是N——乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺转转移移酶酶复复合合体体催催化化亚亚基基的的编编码码基基因因，，N——乙酰酰葡葡萄萄糖糖胺胺转转移移酶酶催催化化细细胞胞表表面面磷磷脂脂酰酰肌肌醇醇聚聚糖糖（（glycosylphosphatidylinositol,GPI）锚锚的的早早期期合合成成，，GPI锚可可将将一一些些特特殊殊的的蛋蛋白白（（如如CD55、CD48等））连连接接到到细细胞胞表表面面。。pig-a突变变导导致致细细胞胞表表面面GPI锚蛋蛋白白缺缺陷陷。。在在与与GPI锚合合成成有有关关的的基基因因中中，，只只有有pig-a位于于X染色色体体上上，，其其他他基基因因都都位位于于常常染染色色体体上上，，故故GPI锚缺缺陷陷表表型型几几乎乎等等同同于于pig-a突变变。。基本本原原理理体内内Pig-a基基因因突突变变试试验验体内内Pig-a基基因因突突变变试试验验体内内Pig-a基基因因突突变变试试验验药物物遗遗传传毒毒性性评评价价的的指指导导原原则则1遗传传毒毒性性试试验验方方法法的的研研究究2药物物致致癌癌性性评评价价的的概概要要3传统统和和替替代代致致癌癌试试验验的的研研究究434主要要内内容容药物物致致癌癌性性评评价价的的概概要要药物物致致癌癌性性试试验验的的指指导导原原则则2.ICH指导导原原则则-S1A：药药物物致致癌癌试试验验的的必必要要性性-S1B：药药物物致致癌癌试试验验-S1C：药药物物只只要要试试验验的的剂剂量量选选择择-S1C(R)：药药物物致致癌癌试试验验剂剂量量选选择择的的附附件件1.SFDA指导导原原则则（（国国食食药药监监注注[2010]129号））-《《药物物致致癌癌试试验验必必要要性性的的技技术术指指导导原原则则》<Technicalguidanceontheneedforcarcinogenicitystudiesforpharmaceuticals>（等同同于ICHS1A）药物致致癌性性评价价的概概要致癌性性试验验指南南药物致致癌性性评价价的概概要ICHS1A和SFDA指导原原则致癌试试验要要求-持续使使用6个月以以上的的药物物或频频繁、、周期期性、、间歇歇性使使用的的药物物；-如果有有致癌癌倾向向，一一些短短期使使用药药物也也要做做致癌癌试验验，-某些剂剂型或或输药药系统统会导导致体体内药药物长长期暴暴露的的时间窗窗要求求-批准上上市之之前前要做做致癌癌试验验；-一些特特殊关关注的的群体体（如如婴幼幼儿））则需需要在在批准准（IV期临床床）前前做-用于严严重甚甚至威威胁生生命的的疾病病的药药物可可以在在临床床批准准（IV期临床床）后做（（没满满意的的可替替代疗疗法；；特定定人群群如肿肿瘤病病人较较短的的生存存期；；视适应应症不不同等等情况况而定定）药物致致癌性性评价价的概概要以下情情况不不需要要致癌癌试验验-明确的的基因因型致致癌物物-假定此此类药药物具具有跨跨种属属致癌癌性-经眼睛睛用药药和皮皮肤用用药-药物无无明显显的结结构警警示和和全身身暴露露-药物经经过盐盐、酸酸或某某些治治疗性性基因因改变变-改变之之前的的试验验数据据已存存在-改变后后的PK、PD和毒性性没有有明显显改变变-用于治治疗危危及生生命的的疾病病或患患者存存活期期较短短（＜2-3年）生物制制剂（（蛋白白疗法法）通通常不不要求求致癌癌试验验—casebycase（ICHS6）ICHS1A和SFDA指导原原则遗传毒毒性和和致癌癌性的的相关关性基因型型与非非基因因型致致癌物物的致致癌性性-Ames阳性的的致突突变剂剂中，，80%具有致致癌性性-由2年动物物致癌癌试验验证实实呈阳阳性的的致癌癌物中中，50%具有遗遗传毒毒性Correlationisnotperfect!2.药物体体外遗遗传毒毒性试试验的的阳性性率偏偏高(Snyderetal.––MutatRes.2001,488:151-69)-25%上市药物物具有遗遗传毒性性结果-在体外染染色体损损伤试验验中证实实阳性的的药物，，在致癌癌试验中中大部分分呈阴性性-在体外染染色体损损伤试验验中，高高于治疗疗浓度的的药物呈呈阳性，，通常与与细胞毒毒性有关关3.药物的遗遗传毒性性和致癌癌性不完完全相符符的其他他原因-体内组织织修复功功能-适应性反反应-遗传多态态性-器官及系系统之间间相互作作用等因因素遗传毒性性和致癌癌性的相相关性药物遗传传毒性评评价的指指导原则则1遗传毒性性试验方方法的研研究2药物致癌癌性评价价的概要要3传统和替替代致癌癌性试验验的研究究434主要内容容致癌性试试验研究究先导物研研发靶点筛选选候选物筛筛选I期临床III期临床II期临床IV期临床传统两年年啮齿类类动物致致癌试验验-起始于上上世纪60年代，首首先用于于检测工工业化学学物质的的致癌性性-现用于检检测大多多数慢性性药物的的致癌性性非传统啮啮齿类动动物致癌癌试验–转基因动动物-1997年开始用用于检测测新药的的致癌性性（ICHS1B）-目前尚未未用于首首要和工工业化合合物的致致癌性检检测GLP致癌性研研究大鼠小鼠传统两年年致癌性性试验啮齿类每每个品系系都有其其病变背背景并容容易自发发肿瘤，，因此背背景数据据和经验验非常重重要。大鼠-因为SD大鼠的死死亡率高高，所以以每组动动物数量量要多（（70只/性别/组）-Wistar和F344大鼠存活活率高些些，但F344渐渐不受受欢迎-Wistar大鼠用的的越来越越多，50只/性别/组小鼠-CD-1和B3C6F1在两年致致癌性试试验中较较常用种属和品品系的选选择传统两年年致癌性性试验1个溶剂对对照组，，3个给药组组至少50只/性别/组，可考考虑增加加（如：：70只/性别/组）-中期处死死-毒代样品品采集-其他血样样采集-两年存活活率低（终身试试验）计计划给药药104周理想情况况下，在在计划处处死时能能有25只/性别/组以计划用用于临床床的给药药方式给给药；环环境化学学品、人人用食品品添加剂剂或动物饲料补补充剂等等加入饮饮食中。。组数和每每组动物物数传统两年年致癌性性试验104周大鼠口口服给药药致癌实实验*若赋赋形剂不不常用，，可增加加一个对对照组；；因为有中中期剖检检和毒代代用动物物数量增增加Note：根据ICH指导原则则，对于于长期用用药，6个月毒理理试验加加一个两两年致癌癌性试验足够了了，无需需12个月的毒毒理试验验。同时时，需要要用主实实验的动动物或独独立的TK组动物进进行TK实验进行行评估。。基本的实实验设计计组别剂量（mg/kg）动物中期剖检毒代1对照组*064M/64F10M/10F4M/4F2低剂量组X64M/64F10M/10F4M/4F3中剂量组Y64M/64F10M/10F4M/4F4高剂量组Z64M/64F10M/10F4M/4F传统两年年致癌性性试验“最高剂量量或最大大耐受剂剂量用来来预测在在致癌性性试验过过程中会会产生的的最低毒毒性作用用”-ICHS1C(R2)在最高推推荐人用用剂量时时，啮齿齿类与人人类血清清AUC（无毒药药物）的的暴露比比大于25:1吸收饱和和—最大暴露露限制剂量量药理学学—镇静，食欲不不振，血压过过低，影响实实验数据的癫癫痫如果以下情况况发生，采用用限制剂量（（药物）：1500mg/kg-人用剂量<500mg/d；无遗传毒性性；暴露水平平高于最高推推荐人用剂量量的10倍最大可行剂量量-饲料量的5%；最大灌胃量量；局部耐受受性高剂量的选择择传统两年致癌癌性试验展示不同剂量量组药物代谢谢动力学、药药理学、毒理理和致癌性范范围—各组间暴露不不同很重要展示不产生毒毒性或未出现现药物相关肿肿瘤的剂量水水平（定义阈阈值）通常使用给药药剂量或人类类暴露的几何何或线性倍数数通常低剂量接接近临床暴露露水平低剂量和中剂剂量的选择传统两年致癌癌性试验对于药品，FDA的CAC特别提出了一一套评估方案案，包括给药原理和实验设计客户必须提交交与实验计划划给药途径一一致的预试验结果，此外还需提提交遗传毒理理学数据，人人类给药和暴暴露剂量，蛋蛋白结合信息息，人体和动动物中代谢物物的数据在试验开始前前，无任何其其他机构定期期审查方案如果FDA与客户意见一一致或客户同同意接受美国国FDA的建议，无论论研究结果如如何，FDA都认为剂量的的选择适当美国FDA致癌评估委员员会（CAC）传统两年致癌癌性试验毒理学监测-摄食量-体重-临床症状-六个月后进行行触诊肿块，，一般每周一一次，但可以以低于此频率率。每周触诊诊可以对肿瘤的的发病提供更更好的评估对濒死的动物物实行安乐死死，早期处死死要比晚期死死亡更有价值值预先设定好安安乐死标准将将加速决策进进程活体数据采集集传统两年致癌癌性试验每个实验中药药物的暴露情情况都必须进进行评估在实验中第6-12个月对暴露情况评评估一次就足足够了通常取3-4个时间点，每个剂量组组每个时间点点取3-4只动物进行如果用主实验验的动物，每每只大鼠取一一个样品；对对于小鼠用卫卫星动物组收集和分析对对照组的样品品期望有独立的的毒代动力学学报告毒代代动动力力学学传统统两两年年致致癌癌性性试试验验医药药品品通通常常不不进进行行临临床床病病理理的的检检验验，，除除非非有有项项目目特特殊殊要要求求（（STP,inpress2010）实验验终终期期进进行行临临床床病病理理检检测测没没有有价价值值，，而而中中期期处处死死时时进进行行却却很很有有价价值值如果果在在实实验验早早期期没没有有将将临临床床病病理理检检查查定定义义好好，，在在15个月内也也可以考考虑进行行特定的的检查血涂片和和骨髓涂涂片是否否要进行行常规采采集？-可以作为为保险措措施-通常不进进行-根据情况况而定临床病理理学传统两年年致癌性性试验在全面评评价潜在在致癌性性研究时时统计学学是一个个重要的的工具控制假阳阳性错误误-对罕见肿肿瘤P<0.05-对常见肿肿瘤P<0.01专题负责责人必须须监测活活体阶段段所有初初步假设设的统计计因素，，并减少少偏离对死亡率率、肿块块、大体体和组织织病理学学数据的的评估是是十分复复杂的*来自活体阶阶段人员以以及病理专专家的数据据要准确完完整-足够的死亡亡率（到80~90周时尚有50%）-早期处死濒濒死动物以以保存组织织-跟踪活体阶阶段表明肿肿瘤-确定可能的的死亡原因因*见指导原原则《药物慢性啮啮齿类致癌癌试验的设设计，分析析和阐释中中的统计学学》,FDACDER,2001统计分析应应考虑的因因素传统两年致致癌性试验验每层架子上上的各组动动物数目相相等定期在房间间内交替架架子，以减减少视网膜膜退变在非工作时时间，采用用低光照以以减少视网网膜退变给药顺序：：对照组，，低剂量组组，中剂量量组，高剂剂量组；避免交叉污污染以同样顺序序来采集毒毒代样品高标准的动动物管理是是至关重要要的保持同样的的饲料/垫料来源，，密切监测测成分/污染物的变变化活体期间动动物的饲养养与管理传统两年致致癌性试验验如果死亡率率很高，可可能一个剂剂量组全部部早期处死死更合适FDA在通讯中提提到：-在第100周以前，幸幸存动物数数降至15时，可考虑虑处死该给给药组或该该性别所有动物-在某些方案案中，当幸幸存动物数数降至20时，停止对对高剂量组组该性别动动物的给药；当幸幸存动物降降至15时，处死高高剂量组受受影响的性性别的所有有动物-如果对照组组的幸存动动物数下降降至20或更少时，，处死所有有剂量组中中受影响的性别的所所有动物-在100周以后，如如果高剂量量组的幸存存动物降至至15时，处死所所有剂量组组中受影响的性别别的所有动动物-早期处死一一个剂量组组不会实验验无效剂量组的提提前终止传统两年致致癌性试验验早期处死与与早期死亡亡-所有组织采采集-早期处死动动物比发现现死亡动物物更有价值值大鼠品系的的选择会影影响动物的的寿命和到到计划处死死时存活的的比例-Wistar大鼠存活率率比SD大鼠高肿块跟踪-跟踪活体阶阶段的每一一个肿块-与解剖结果果的关联-通过显微评评价来跟踪踪解剖时发发现的肿块块（Peto试验要求））解剖传统两年致致癌性试验验检查查方方案案中中各各组组所所有有动动物物的的所所有有组组织织和和肿肿块块跟踪踪解解剖剖中中发发现现的的所所有有肿肿块块的的显显微微诊诊断断尽可可能能将将大大体体观观察察与与显显微微观观察察结结果果关关联联起起来来；；但但是是“大大体体观观察察与与显显微微观观察察没没有有关关联联””也是是可可接接受受的的，，不不是是每每个个大大体体观观察察都都有有相相关关联联的的显显微微观观察察，，重重要要的的是是你你所所观观察察到到的的。。如果果可可行行的的话话，，确确认认肿肿瘤瘤的的原原发发部部位位将肿肿瘤瘤归归类类为为““致致命命””与与““非非致致命命””：：-有没没有有可可能能是是肿肿瘤瘤促促成成的的动动物物提提前前死死亡亡或或死死亡亡-要求求专专业业判判断断-要求求做做Peto试验验-计划划处处死死的的动动物物不不需需要要记录录计计划划处处死死前前解解剖剖的的动动物物死死亡亡或或濒濒死死的的原原因因显微微评评价价传统统两两年年致致癌癌性性试试验验致癌癌性性实实验验是是评评价价化化合合物物在在动动物物体体内内潜潜在在致致癌癌性性的的特特定定的的非非临临床床安安全全性性评评价价，，旨旨在在增增进进人人类类的的潜潜在在致致癌癌风风险险评评价价致癌癌性性试试验验开开展展时时间间取取决决于于药药物物的的类类型型和和关关注注程程度度-通常常在在临临床床试试验验第第二二，，三三阶阶段段进进行行，，很很少少在在第第IV阶段段（（上上市市后后））进进行行-通常常104周的的生生物物评评价价采采用用大大鼠鼠或或小小鼠鼠进进行行-使用用转转基基因因动动物物或或敏敏感感的的体体外外试试验验来来推推进进致致癌癌性性试试验验一些些药药物物可可能能不不需需要要进进行行致致癌癌性性试试验验-细胞胞毒毒性性抗抗癌癌药药物物一一般般不不需需要要进进行行致致癌癌性性试试验验-生物物技技术术药药物物也也可可除除外外（（ICHS6）专题题负负责责人人、、毒毒理理人人员员和和统统计计人人员员作作为为一一个个团团队队，，共共同同设设计计、、执执行行和和评评估估-选择择种种属属应应考考虑虑药药代代、、毒毒代代情情况况-实验验中中每每组组必必须须有有足足够够的的动动物物，，试试验验设设计计或或执执行行使使偏偏离离最最小小化化-剂量量选选择择是是关关键键，，必必须须显显示示暴暴露露范范围围，，从从推推荐荐人人用用剂剂量量到到MTD或最最大大可可行行剂剂量量-活体体阶阶段段，，死死亡亡、、解解剖剖和和显显微微数数据据必必须须衔衔接接-对数据全全面评价价的统计计方法必必须适当当总结替代致癌癌性试验验ICHS1B潜在致癌癌性研究究的指南南1997年：1个两年性性致癌试试验+1个替代模模型的体体内试验验Trp53+/-（应用于于遗传毒毒性的药药物）rasH2（应用于于遗传毒毒性和非非遗传毒毒性的药药物）Tg.AC（局部采采用，许许多阳性性结果，，遗传不不稳定））XPA-/-和XPA-/-xp53+/-新生鼠开始启动动（Ito模型）p53+/-转基因小小鼠替代致癌癌性试验验应用替代代模型的的原因减少动物物使用并并降低费费用两年致癌癌试验的的问题被被广泛认认知—肝细胞肿肿瘤；许许多发现现与人不不相关提供有助助于风险险评估的的其他信信息如有时间间要求，，可以缩缩短至9个月可以延长长试验直直至III期